一種露兜樹懸浮細胞的快速繁殖方法
【專利摘要】本發(fā)明研究了一種露兜樹懸浮細胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，包括酶解法組織破碎、愈傷組織誘導、愈傷組織繼代、懸浮細胞培養(yǎng)等步驟。本發(fā)明方法利用了酶技術縮短了細胞培養(yǎng)周期，生產(chǎn)能耗低且無污染，工藝流程簡單，有利于建立露兜樹懸浮細胞的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)，為藥用成分的提取提供新的途徑。
【專利說明】 一種露兜樹懸浮細胞的快速繁殖方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及組培條件下露兜樹懸浮細胞的培養(yǎng)，屬于植物【技術領域】。

【背景技術】
[0002]露兜樹，灌木或喬木，別名:林茶、華露兜等，原產(chǎn)馬達加斯加。喜光，喜高溫、多濕氣候，適生于海岸砂地，常生于海邊沙地。產(chǎn)福建、臺灣、廣東、海南、廣西、貴州和云南等省區(qū)。生于海邊沙地或引種作綠籬。也分布于亞洲熱帶、澳大利亞南部。露兜樹的根可治感冒發(fā)熱、眼熱疼痛；葉芽可治爛腳；果可補脾胃、固元氣、解酒毒.主治肝熱虛火、肝硬化腹水、中暑等，并有降血糖功效；果核治睪丸炎及痔瘡。藥用:性味:甘、淡、涼。效用:葉:發(fā)汗解表，清熱解毒，利尿。根:治感冒發(fā)熱，腎炎水腫，尿路感染、結合，肝炎，肝硬化腹水，眼結膜炎；果:治痢疾；咳嗽；果核:治睪丸炎，痔瘡。孕婦忌服。露兜樹全身是寶，有著很廣闊的開發(fā)前景的。目前主要采用分株或播種繁殖。組培方法研究目前尚處于起步階段，懸浮細胞培養(yǎng)還無人研究，懸浮細胞具有操作簡單可控，生產(chǎn)成本低，繁殖率高等優(yōu)點。


【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供露兜樹懸浮細胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，通過酶技術縮短了組織培養(yǎng)的繁殖周期，工藝流程簡單可控。
[0004]為解決上述技術問題，本發(fā)明采用下列技術方案:
選用露兜樹幼嫩的葉片，洗去表面污潰，25%的次氯酸鈉中浸泡15min，無菌水沖洗至無殘留，消毒過的葉片經(jīng)放入打漿機+NT營養(yǎng)液中打漿，每2g加入20mL，打漿液加入50mg/L纖維素酶和果膠酶，靜止5小時，用50微目微孔過濾器過濾，接入250mL錐形瓶中，接種量為15g/L，細胞濃度103_5細胞/mL，恒溫震蕩器中懸浮培養(yǎng)，轉速150_200r/min，培養(yǎng)基為6，7-V+0.5-2.5mg/L2, 4-D+0.1-lmg/LKT，附加蔗糖 40g/L，PH5.8，生長培養(yǎng)基于 121°C 高壓滅菌20min，溫度23°C，光照12h/d，7天繼代一次，用120目不銹鋼網(wǎng)過濾，洗滌，烘干。
[0005]采用本發(fā)明制備的露兜樹懸浮細胞，生長速度快，能耗小，污染小，次生代謝物含量高。
[0006]下面將結合【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明要求保護的范圍并不局限于下列實施方式。

【具體實施方式】
[0007]實施例1
選用露兜樹幼嫩的葉片，洗去表面污潰，25%的次氯酸鈉中浸泡15min，無菌水沖洗至無殘留，消毒過的葉片經(jīng)放入打漿機+NT營養(yǎng)液中打漿，每2g加入20mL，打漿液加入50mg/L纖維素酶和果膠酶，靜止5小時，用50微目微孔過濾器過濾，接入250mL錐形瓶中，接種量為15g/L，細胞濃度103_5細胞/mL，恒溫震蕩器中懸浮培養(yǎng)，轉速150_200r/min，培養(yǎng)基為 6，7-V+0.5mg/L2, 4-D+0.lmg/LKT,附加蔗糖 40g/L，PH5.8，生長培養(yǎng)基于 121 °C 高壓滅菌20min，溫度23°C，光照12h/d7天繼代一次，用120目不銹鋼網(wǎng)過濾，洗滌，烘干，成活率89%。
[0008]實施例2
選用露兜樹幼嫩的葉片，洗去表面污潰，25%的次氯酸鈉中浸泡15min，無菌水沖洗至無殘留，消毒過的葉片經(jīng)放入打漿機+NT營養(yǎng)液中打漿，每2g加入20mL，打漿液加入50mg/L纖維素酶和果膠酶，靜止5小時，用50微目微孔過濾器過濾，接入250mL錐形瓶中，接種量為15g/L，細胞濃度103_5細胞/mL，恒溫震蕩器中懸浮培養(yǎng)，轉速150_200r/min，培養(yǎng)基為 6，7-V+2.0mg/L2, 4-D+0.5mg/LKT,附加蔗糖 40g/L，PH5.8，生長培養(yǎng)基于 121 °C 高壓滅菌20min，溫度23°C，光照12h/d7天繼代一次，用120目不銹鋼網(wǎng)過濾，洗滌，烘干，成活率88%。
[0009]實施例3
選用露兜樹幼嫩的葉片，洗去表面污潰，25%的次氯酸鈉中浸泡15min，無菌水沖洗至無殘留，消毒過的葉片經(jīng)放入打漿機+NT營養(yǎng)液中打漿，每2g加入20mL，打漿液加入50mg/L纖維素酶和果膠酶，靜止5小時，用50微目微孔過濾器過濾，接入250mL錐形瓶中，接種量為15g/L，細胞濃度103_5細胞/mL，恒溫震蕩器中懸浮培養(yǎng)，轉速150_200r/min，培養(yǎng)基為6，7-V+2.5mg/L2, 4-D+lmg/LKT,附加蔗糖40g/L，PH5.8，生長培養(yǎng)基于121°C高壓滅菌20min，溫度23°C，光照12h/d7天繼代一次，用120目不銹鋼網(wǎng)過濾，洗滌，烘干，成活率87%。
【權利要求】
1.一種露兜樹懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征是:露兜樹的葉片經(jīng)放入打漿機+NT營養(yǎng)液中打漿，每2g加入20mL，打漿液加入50mg/L纖維素酶和果膠酶，靜止5小時，用50微目微孔過濾器過濾，接入恒溫震蕩器中懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)基為6，7-V+0.5-2.5mg/L2, 4-D+0.l_lmg/LKT，7天繼代一次，用120目不銹鋼網(wǎng)過濾，洗滌，烘干。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種露兜樹懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征是:所述的消毒處理為:選用露兜樹幼嫩的葉片，洗去表面污潰，25%的次氯酸鈉中浸泡15min，無菌水沖洗至無殘留。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種露兜樹懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征是:懸浮細胞的培養(yǎng)方法為處理過的露兜樹葉片，接入250mL錐形瓶中，接種量為15g/L，細胞濃度103_5細胞/mL，轉速150-200r/min，每七天換一次培養(yǎng)液。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種露兜樹懸浮細胞的快速繁殖方法，其特征是:懸浮細胞的培養(yǎng)條件為蔗糖40g/L，PH5.8，生長培養(yǎng)基于121 °C高壓滅菌20min，溫度23°C，光照12h/d0
【文檔編號】A01H4/00GK104160964SQ201410463059
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年9月12日 優(yōu)先權日:2014年9月12日
【發(fā)明者】楊存 申請人:南京通澤農(nóng)業(yè)科技有限公司