專利名稱：保存細胞或固定的細胞懸浮體的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種保存細胞或固定的細胞懸浮體的方法。更確切地是，本發(fā)明涉及一種將由培養(yǎng)或其固定細胞得到的微生物細胞，作為一種含水介質(zhì)中的懸浮體被穩(wěn)定保存的方法。
在許多領域中，使用由微生物產(chǎn)生的酶作為化學轉(zhuǎn)化反應的催化劑。特別是，腈水化酶和腈水解酶能夠使腈基團水合或水解，可以低成本制備酰胺、羧酸和α-羥基羧酸，這在化學工業(yè)領域中是重要的。此外，所述的酶能夠進行特定的旋光水合或水解，這可以制備作為藥物和農(nóng)業(yè)化學重要生產(chǎn)材料的旋光活性羧酸、氨基酸和α-羥基羧酸。
在使用微生物酶作為催化劑的化學轉(zhuǎn)化反應中，必須將培養(yǎng)和收集的微生物細胞或其固定的細胞穩(wěn)定保存直至其使用。即必須在這樣的條件下將其貯存，使得酶的催化功能得以保存，而細胞不會由于微生物污染而腐敗或溶解。因此，通常是通過冷凍或冷藏防止酶的失活和細胞的溶解及腐敗。
在迄今已知的保存方法中，冷凍的微生物細胞或其顆粒固定細胞需要復雜的冷凍和解凍步驟，這也可導致破壞或降低酶活性。冷藏保存方法需要較低的保存溫度以防止微生物污染并使細胞穩(wěn)定，從而造成高的冷卻成本。
已經(jīng)對價廉并穩(wěn)定的保存培養(yǎng)和收集細胞或其固定細胞的條件進行了充分的研究。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當在無機鹽摩爾濃度范圍為100mM至飽和濃度的中性至堿性無機鹽水溶液中保存時，甚至在室溫下，這些細胞或其固定細胞可穩(wěn)定地被保存300天或更長時間而不引起細胞溶解或酶失活。在這一發(fā)現(xiàn)的基礎上完成了本發(fā)明。
因而，本發(fā)明提供了一種保存微生物細胞或其固定細胞懸浮體的方法，在該方法中，以一種微生物細胞的懸浮體或以一種顆粒固定細胞的懸浮體在含水介質(zhì)中將具有酶活性的微生物細胞或其酶活性穩(wěn)定保存很長時間周期，其中含水介質(zhì)是無機鹽摩爾濃度范圍為100mM至飽和的中性或微堿性水溶液。
本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點將由如下對本發(fā)明的描述表達出來。
本發(fā)明的無機鹽水溶液是一種選自由磷酸鹽、硼酸鹽、硫酸鹽、亞硫酸鹽和鹽酸鹽構成的物組中至少一種鹽的水溶液；磷酸鹽或硼酸鹽較佳的可以是以磷酸鹽或硼酸鹽的緩沖液形式。鹽的類型包括鈉鹽、鉀鹽和銨鹽。
本發(fā)明的無機鹽水溶液是一種無機鹽摩爾濃度范圍為100mM至飽和的高濃度水溶液。飽和濃度根據(jù)各種鹽和溫度而變化，較佳的范圍是300-500mM。
還有，無機鹽水溶液應為中性至堿性，并且通常調(diào)至pH值為pH7-10，較佳的為pH7.5-9.5。
對酶和具有酶活性的微生物沒有特別限定。酶的例子包括腈水化酶、腈水解酶等。
盡管已知有一系列微生物可產(chǎn)生腈水化酶和腈水解酶，但屬于紅球菌屬(Rhodococcus)和Gordona種屬的微生物由于其高的酶活性而較佳。
這些微生物的說明例子包括Rhodococcus sp.HT40-6(FERMBP-5231)、Rhodococcus rhodochrous ATCC 33278、Rhodococcusrhodochrous J-1(FERM BP-1478)和Gordona terrae MA-1(FERMBP-4535)。
在這些菌株中，Rhodococcus rhodochrous ATCC 33278是一種已知的菌株并可由美國典型培養(yǎng)物收藏中心(ATCC)很容易地得到。還有，Rhodococcus sp.HT40-6和Rhodococcus rhodochrous J-1是在上述標志下保藏在the National Institute of Bioscienceand Human Technology(以前的Fermentation RsearchInstitute)，Agency of Industrial Science and Technology，at 1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-Ken，305，Japan，的已知菌株，其細菌學特性分別開在JP-A-4-222591和JP-B-6-55148(此處用詞″JA-A″和″JP-B″分別表示″未審定的
公開日本專利申請″和″審定的日本專利公告″)。
Gordona terrae MA-1是被本發(fā)明的一些發(fā)明人由土壤中分離出的菌株并在上述標志下保藏在the National Institute ofBioscience and Human Technology，Agency of IndustrialScience and Technology。這一菌株的細菌學特性如下菌株MA-1形態(tài)學 多形桿革蘭氏染色劑 +
孢子 -游動性-氧化酶-過氧化氫酶+菌落顏色 桃紅色至橙色桿-球菌循環(huán) +菌落外周細胞的延伸有氣生菌絲形成 無對氧的行為需氧細胞壁中的二氨基酸介二氨基庚二酸乙醇酰試驗+(乙醇酰型)細胞壁的糖組成阿拉伯糖 +半乳糖+醌體系MK-9(H2)腺嘌呤水解-酪氨酸水解-尿素水解 +同化作用肌醇 -麥芽糖-甘露糖醇 +鼠李糖+山梨醇+
間羥基苯甲酸鈉 -苯甲酸鈉 +檸檬酸鈉 +乳酸鈉 +睪酮 +乙酰胺 -丙酮酸鈉 +在0.02％疊氮化鈉存在下生產(chǎn) +在10℃生長 +在40℃生長 +在0.001％結(jié)晶紫存在下生長+在0.3％苯乙醇存在下生長 +在5％NaCl存在下生長 +在7％NaCl存在下生長 +當將這些細菌學特性根據(jù)Bergey′s Manual of SystematicBacteriology(1986)；J.Gen.appl.Micribiol.，34，341-348(1988)和Int.J.Syst.Bacteriol.，39，371(1989)分類時，菌株MA-1與屬于Gordona terrae種屬的細菌相同。
下面，描述本發(fā)明總的狀況。
通過使用一種培養(yǎng)基培養(yǎng)本發(fā)明所用的微生物，該培養(yǎng)基含有可同化的碳源(如葡萄糖和果糖)、氮源(如酵母提取物-胨和硫酸銨)和無機鹽(如氯化鎂、氯化鐵和磷酸氫二鈉)以及用作誘導腈水化酶和腈水合酶活性所需輔基的金屬鹽類(如氯化鈷和硫酸鐵)和用作誘導物的腈類(如芐腈、異丁腈和琥珀腈)和酰胺類(如ε-己內(nèi)酰胺、異丁酰胺和丙酰胺)?？稍谂囵B(yǎng)基pH為pH4-10，較佳為pH6-9并且在培養(yǎng)溫度為20-40℃，較佳為25-35℃進行培養(yǎng)1-7天，直到重要的酶達到其最大活性。
通過離心收集得到的細胞并用硼酸鹽或磷酸鹽緩沖液洗滌一次或二次。而后，將該細胞懸浮體與能得到最終感興趣濃度量的上述無機鹽溶液混合。
當以固定形式使用細胞時，洗滌的細胞懸浮體是被固定的，然后以如下方式使其成粒。即，將至少一種丙烯酸單體(例如，丙烯酰胺、丙烯酸、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸、N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、丙烯酸二甲氨丙酯、甲基丙烯酸二甲氨丙酯、二甲氨丙基丙烯酰胺、二甲氨丙基甲基丙烯酰胺、二乙氨丙基丙烯酰胺或二乙氨丙基甲基丙烯酰胺)和一種交聯(lián)劑(例如、亞甲基雙丙烯酰胺、亞甲基雙甲基丙烯酰胺、1，2-二羥基亞乙基雙丙烯酰胺或雙丙烯酰氨乙酸)的混合物加入洗滌的細胞懸浮體中，然后將聚合引發(fā)劑和加速劑(如過硫酸銨和N，N，N′，N′-四甲基乙二胺)加入得到的懸浮體中，使引起聚合和凝膠化。而后將所得的凝胺切成通常為約0.5-100mm平方的方塊顆粒，用硼酸鹽或磷酸鹽緩沖液洗滌，然后以與上述關于細胞懸浮體的相同方式與無機鹽的水溶液混合。
在固定化步驟中，是使一般為0.1-40％(重量)，較佳是1-20％(重量)的以干重計的細胞與一般為2-30％(重量)，較佳為5-15％(重量)的單體混合物混合。
雖然未具體限定，但保存的細胞或顆粒的固定細胞濃度范圍可以為以干重計細胞為0.1-30％(重量)。
保存溫度通常為0-40℃，較佳為0-35℃。
為防止在細胞保存期腐敗，可將具有抗細菌或抗真菌活性的一種藥劑加入保存溶液中并且可以加入其他鹽類，如乙二胺四乙酸的鹽。
當在制備反應中使用這樣保存的細胞或顆粒的固定細胞作為轉(zhuǎn)化催化劑時，如需要時可將細胞懸浮體直接或在洗滌后加入反應溶液中。
提供如下實施例以進一步說明本發(fā)明。然而，要理解到，這些實施例僅用于說明目的而不是為了限定本發(fā)明。除非另有說明，所有百分比均為重量比。
發(fā)明實施例1(1)培養(yǎng)將具有腈水解酶活性的Gordona terrae MA-1在30℃下好氣培養(yǎng)72小時，使用的培養(yǎng)基為補充1-環(huán)己乙酰腈作為酶活性誘導物的如下培養(yǎng)基培養(yǎng)基成分(pH7.5)葡萄糖 30g各氨酸鈉 15g酵母抽提物 8g磷酸氫二鈉7.1g磷酸二氫鉀6.8g硫酸鈉2.8g氯化鎂0.4g氯化鈣 0.04g硫酸錳 0.03g氯化鐵 0.006g硫酸鋅 0.003g1-環(huán)己乙酰腈 0.5g蒸餾水 1000ml(2)要保存的細胞懸浮體的制備將培養(yǎng)過的液體培養(yǎng)基以45ml一份分配在5個離心管中并離心分離(10000rpm，15分鐘，10℃)并用45ml 50(對比例)、100、300、500或700mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0，K2HPO4-KH2PO4)洗滌各管中所收集的細胞一次并再懸浮在45ml洗滌中所用的各種濃度的磷酸鹽緩沖液中。將各個細胞懸浮體以15ml一份分配在3個覆蓋的玻璃容器中并于5、20或30℃下于暗處保存。在保存0、120或300天后，對各細胞懸浮體的一部分取樣，測定酶活性。(3)腈水解酶活性測定將一小份保存的各細胞懸浮體進行離心分離(1500rpm，5分鐘，10℃)，并用2體積50mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0，Na2HPO4-KH2PO4)洗滌所收集的細胞兩次并懸浮在另外補充有100mM亞硫酸鈉的相同緩沖液中。通過向細胞懸浮體加入20mM扁桃腈作為基底測定腈水解酶活性，并且在30℃下振蕩30分鐘后，通過離心(1500rpm，5分鐘，10℃)除去細胞。通過液相色譜(柱，Wakosil ODS 5C 18；洗脫液，0.1M磷酸∶乙腈＝3∶1，檢測波長，254nm)分析所得上清液中所含的R-扁桃酸量。
一單位(1U)酶活性被規(guī)定為1ml反應溶液中每1分鐘1mg干細胞產(chǎn)生1μmol扁桃酸的能力。由1ml保存的細胞懸浮體中干細胞的量(mg)乘1mg干細胞的活性計算出1ml保存的細胞懸浮體中酶活性的量。(4)結(jié)果表1示出了對1ml保存的各細胞懸浮體在0天時的活性規(guī)定為1.0的相對酶活性值。
表1
發(fā)明實施例2將發(fā)明實施例1的培養(yǎng)過的液體培養(yǎng)基以20ml一份分配在6個離心管中并離心分離(10000rpm，15分鐘，10℃)，并用相同體積的50mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0，K2HPO4-KH2PO4)洗滌各管中所收集的細胞一次并重新懸浮在20ml上述50mM磷酸鹽緩沖液中，另外補充300mM硫酸鈉、300mM氯化鈉、300mM氯化鉀或100mM亞硫酸鈉。也制備未補充任何鹽的再懸浮體作為對比例。
在20℃下于暗處將細胞懸浮體保存60天。用與發(fā)明實施例1中所述相同的方式測定1ml保存各細胞懸浮體的酶活性量。表2示出了對1ml保存各細胞懸浮體在0天時的活性量被規(guī)定為1.0的相對值。
表2<
實施例3將發(fā)明實施例1培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)基以20ml一份分配在3個離心管中并離心分離(10000rpm，15分鐘，10℃)，用pH值為6.0(比較例)、7.0或8.0的20ml 300mM磷酸鹽緩沖液(Na2HPO4-KH2PO4)洗滌每管中所收集的細胞一次并再懸浮在20ml具有在洗滌時所用的各個pH值的相同磷酸鹽緩沖液中。將這些細胞懸浮體在暗處于20℃下保存60天。以發(fā)明實施例1所述的相同方式測定保存的各細胞懸浮體的活性量。表3示出了對1ml保存的各細胞懸浮體在0天時的活性量被規(guī)定為1.0的相對酶活性值。
表3
發(fā)明實施例4(1)培養(yǎng)將具有腈水化酶活性的Rhodococcus sp.HT40-6，在30℃下好氣培養(yǎng)96小時，所用培養(yǎng)基為補充有ε-己內(nèi)酰胺作為酶活性誘導物的如下培養(yǎng)基培養(yǎng)基成分(pH7.5)葡萄糖 27g多胨4g酵母抽提物 2g磷酸氫二鈉7.1g磷酸二氫鉀6.8g硝酸銨 2g氯化鎂0.4g硫酸銨0.2g氯化鈣 0.04g硫酸錳 0.03g氯化鈷·6H2O0.03g氯化鐵 0.006g硫酸鋅 0.003gε-己內(nèi)酰胺 4g蒸餾水 1000ml(2)要保存的細胞懸浮體的制備將培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)基以45ml一份分配在5個離心管中并離心分離(10000rpm，15分鐘，10℃)，并用45ml50mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0K2HPO4-KH2PO4)(比較例)或300mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0Na2HPO4-KH2PO4)洗滌各管中所收集的細胞一次并再懸浮在20ml在洗滌時所用的各個濃度的磷酸鹽緩沖液中。將所制得的細胞懸浮體在暗處于20℃不保存120天，在0天和120天時對每個細胞懸浮體取一份樣品以測定酶活性。
(3)腈水化酶活性的測定在如發(fā)明實施例1所述相同條件下，通過相同步驟進行反應，并在如發(fā)明實施例1所述相同條件下通過液相色譜定量測定所形成的產(chǎn)物(扁桃酰胺)。
(4)結(jié)果表4示出了對1ml保存的各細胞懸浮體在0天時的活性量被規(guī)定為1.0的相對酶活性值。
表4<
發(fā)明實施例5按照發(fā)明實施例1對MA-1和發(fā)明實施例4對HT40-6和ATCC33278的方法分別培養(yǎng)Gordona terrae MA-1，Rhodococcus sp.HT40-6和Rhodococcus rhodochrous ATCC 33278。將20ml一份的培養(yǎng)后的各液體培養(yǎng)基離心分離(10000rpm，15分鐘，10℃)，用相同體積100mM硼酸鹽緩沖液(pH9.0，Na2B4O7·10H2O-HCl)洗滌所收集細胞一次并再懸浮在20ml相同緩沖液中。將細胞懸浮體在暗處于20℃下保存200天，并按照實施例1和4的分別方法測定在0天和200天時1ml保存的各細胞懸浮體的活性量。表5示出了對1ml保存的各細胞懸浮體在0天時的活性量被規(guī)定為1.0的相對值。
表5
發(fā)明實施例6(1)顆粒固定細胞的制備在含有2％葡萄糖、1％尿素、0.5％胨、0.3％酵母抽取物和0.05％氯化鈷(全部為重量％)的培養(yǎng)基中好氣培養(yǎng)具有腈水化酶活性的Rhodococcus rhodochrous J-1。用50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)洗滌所得到的細胞。然后將500g 20％(重量)丙烯酰胺、2％(重量)亞甲基雙丙烯酰胺和2％(重量)2-二甲氨丙基甲基丙烯酰胺的單體混合物加到500g細胞懸浮體(以干細胞計的20％(重量)]中并充分懸浮。向其中加入2g 50％(重量)過硫酸銨和2g 50％(重量)N，N，N’，N’-四甲基乙二胺以使聚合和凝膠化。將得到的凝膠切成1mm平方的方塊，用1000ml 20mM硫酸鈉洗滌5次，得到顆粒固定細胞。
(2)要保存的固定細胞顆粒懸浮體的制備將200ml一份通過放置沉淀的顆粒固定細胞放到500ml容量的聚乙烯容器中，分別與200ml 40％硫酸銨溶液(調(diào)至pH7.0)和8％氯化鈉溶液(調(diào)至pH7.0)混合，然后在30℃下保存100天。重覆相同的步驟，所不同的是加入20mM硫酸鈉(比較例)。
(3)腈水化酶活性的測定用5體積50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0，Na2HPO4-KH2PO4)洗滌一小份所保存的固定細胞顆粒懸浮體。然后將試樣包封在濾網(wǎng)中并通過離心脫水，將約1g這樣處理過的顆粒懸浮在100ml相同磷酸鹽緩沖液中。將懸浮體與5％相同磷酸鹽緩沖液的丙烯腈溶液混合，并通過在0℃振蕩20分鐘使反應開始。通過使反應混合物通過0.45μm濾器過濾結(jié)束該反應。通過氣相色譜[注入溫度，220℃；柱溫度，180℃；裝柱，Porapack PS 80-100MESH(由Waters生產(chǎn))；檢測器，F(xiàn)ID]分析所得濾液中生成丙烯酰胺的量。
(4)結(jié)果表6示出了對1g顆粒固定細胞在0天時的活性量被規(guī)定為1.0的相對酶活性值。
表6
因而，本發(fā)明提供了一種將大量具有腈水化酶活性或腈水解酶活性的細胞或顆粒固定細胞甚至在室溫下保存很長時間周期(例如300天)，而不發(fā)生細胞溶解或酶惡化的工業(yè)上有用的方法。本發(fā)明也可能急劇降低在常規(guī)保存工藝中所需的勞動和冷卻成本。
雖然已詳盡地并參考其特定實施方案說明了本發(fā)明，但對現(xiàn)有技術的普通技術人員顯而易見的是，可以在其中進行各種改變和改進而不超出精神和范圍。
權利要求
1.一種將具有酶活性的微生物細胞，及其酶活性穩(wěn)定保存很長時間周期的方法，該方法包括將所述細胞以微生物細胞懸浮體或以顆粒固定細胞懸浮體保存在一種含水培養(yǎng)基中，其中所述含水培養(yǎng)基是一種中性或微堿性無機鹽水溶液，該溶液具有所述無機鹽的摩爾濃度范圍為100mM至飽和。
2.權利要求1的方法，其中所述無機鹽水溶液是一種至少一種選自由磷酸鹽、硼酸鹽、硫酸鹽、亞硫酸鹽和鹽酸鹽構成物組的鹽的水溶液。
3.權利要求1的方法，其中所述的無機鹽是至少一種選自由鈉鹽、鉀鹽和銨鹽構成物組中的鹽。
4.權利要求1的方法，其中所述無機鹽水溶液pH值范圍為pH7-10。
5.權利要求1的方法，其中所述酶活性是腈水化酶活性或腈水解酶活性。
6.權利要求1的方法，其中所述微生物細胞是Gordona terraeMA-1(FERM BP-4535)。
7.權利要求1的方法，其中所述微生物細胞是Rhodococcusrhodochrous sp.HT40-6(FERM BP-5231)。
8.權利要求1的方法，其中所述微生物細胞是Rhodococcusrhodochrous J-1(FERM BP-1478)。
9.權利要求1的方法，其中所述微生物細胞是Rhodococcusrhodochrous ATCC 33278。
10.權利要求1的方法，其中所述以顆粒固定的細胞濃度范圍為以干細胞計的0.1-30％(重量)。
11.權利要求1的方法，該方法保存溫度范圍為0-40℃。
12.權利要求1的方法，其中所述無機鹽水溶液包括具有摩爾范圍為300-700mM的磷酸鹽緩沖液。
13.權利要求1的方法，其中所述無機鹽水溶液包括具有摩爾為50mM的磷酸鹽緩沖液和具有摩爾為300mM的硫酸鈉溶液。
14.權利要求1的方法，其中所述以顆粒固定的細胞懸浮在硫酸銨水溶液中。
全文摘要
一種將具有酶活性的細胞，和其酶活性以微生物細胞懸浮體或以顆粒固定的細胞懸浮體在含水培養(yǎng)基中穩(wěn)定保存很長時間周期的方法，其中含水培養(yǎng)基是一種中性或微堿性無機鹽水溶液，該溶液具有無機鹽摩爾濃度范圍為100mM至飽和。本發(fā)明提供了一種將大量具有腈水化酶或腈水解酶活性的細胞或顆粒固定細胞甚至在室溫下保存很長時間周期(例如300天)，而不發(fā)生細胞溶解或酶惡化的工業(yè)上有用的方法。本發(fā)明還可急劇降低在常規(guī)保存工藝中所需的勞動和冷卻成本。
文檔編號C12N11/00GK1132788SQ95119978
公開日1996年10月9日 申請日期1995年10月14日 優(yōu)先權日1994年10月14日
發(fā)明者遠藤隆一, 土井俊明, 田村鋼二, 平田祐司, 村尾耕三 申請人:日東化學工業(yè)株式會社