一種血管瘤動(dòng)物模型的建系方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種血管瘤動(dòng)物模型的建系方法，包括：(1)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)的PyMT基因質(zhì)粒的構(gòu)建；(2)將上述構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)PvuI酶切線性化，然后顯微注射到小鼠受精卵中；(3)將出生的小鼠進(jìn)行PCR鑒定，得到鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因小鼠；所述的轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)血管瘤樣表型；(4)將上述轉(zhuǎn)基因小鼠作為培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系基礎(chǔ)種群的首建鼠建立血管瘤動(dòng)物模型。本發(fā)明中目的基因PyMT僅表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，避免了其在其他組織中誘導(dǎo)發(fā)生惡性腫瘤，模型動(dòng)物表型專一，顯示典型的血管瘤樣改變；明顯改善了PyMT基因的胚胎毒性，產(chǎn)生的陽(yáng)性首建鼠的數(shù)量明顯高于傳統(tǒng)方法，可以穩(wěn)定傳代、建系，子代鼠也均有血管瘤表型。
【專利說(shuō)明】一種血管瘤動(dòng)物模型的建系方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于心血管疾病的研究領(lǐng)域，特別涉及一種血管瘤動(dòng)物模型的建系方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 良性先天性血管腫瘤是嬰幼兒的常見疾病。新生兒的發(fā)病率為1?2%，1歲左右 發(fā)病率上升至12%，而在體重低于1000g的早產(chǎn)兒中，發(fā)病率可高達(dá)23%。為了突破血管 瘤研究瓶頸，更有效地認(rèn)識(shí)血管瘤的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，建立一個(gè)理想的血管瘤動(dòng)物模型是當(dāng) 務(wù)之急。
[0003] 血管瘤的動(dòng)物模型最早采用的是雞冠模型，但是其組織發(fā)生和結(jié)構(gòu)與血管瘤有 著巨大差異，這一模型已被淘汰。目前，國(guó)內(nèi)、外學(xué)者普遍接受的血管瘤動(dòng)物模型的建立 方法主要有2種：①通過(guò)接種血管瘤組織或內(nèi)皮細(xì)胞，使動(dòng)物產(chǎn)生與來(lái)源細(xì)胞生物學(xué)性 狀接近的血管瘤模型。雖然這種方法操作簡(jiǎn)便，成功率高，但是產(chǎn)生的動(dòng)物模型僅模擬了 血管瘤的局部疾病狀態(tài)，無(wú)法在機(jī)體整體水平反映疾病發(fā)展過(guò)程中的系統(tǒng)生物網(wǎng)絡(luò)變化 規(guī)律，并且其產(chǎn)生的血管瘤與疾病的自然發(fā)生過(guò)程也存在較大的差異。②通過(guò)病毒感染、 轉(zhuǎn)基因技術(shù)將某些基因?qū)雱?dòng)物基因組，產(chǎn)生血管瘤表型。Williams最早采用多瘤病毒 MiddleT(Polyomavirus Middle T，PyMT)基因建立了轉(zhuǎn)基因血管瘤小鼠模型，誘發(fā)的動(dòng)物 模型在出生后2周左右出現(xiàn)血管瘤樣表型，與自然發(fā)生的血管瘤極為相似。但是，采用PyMT 轉(zhuǎn)基因方法建立血管瘤小鼠模型存在2個(gè)明顯缺陷：（l)PyMT轉(zhuǎn)基因后不僅引起血管瘤的 發(fā)生，也會(huì)誘發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生多種其他惡性腫瘤，導(dǎo)致模型的專一性差，降低其在血管瘤研究中 的價(jià)值。（2)PyMT基因具有胚胎致死性，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性動(dòng)物的出生率極低，且動(dòng)物生殖力低下， 造成難以獲得足夠數(shù)量的模型動(dòng)物由于后續(xù)研究。這些問(wèn)題的發(fā)生是因?yàn)镻yMT基因在不 同的組織中表達(dá)可以造成不同的病理變化，例如，在血管內(nèi)皮中表達(dá)造成血管瘤表型，在乳 腺組織中表達(dá)可以導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生，胚胎組織廣泛表達(dá)PyMT基因造成嚴(yán)重的胚胎毒性， 生殖細(xì)胞表達(dá)該基因造成小鼠生殖能力低下。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種血管瘤動(dòng)物模型的建系方法，該方法制作 的血管瘤動(dòng)物模型的目的基因 PyMT僅表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，避免了其在其他組織中誘 導(dǎo)發(fā)生惡性腫瘤，模型動(dòng)物表型專一,顯示典型的血管瘤樣改變。
[0005] 本發(fā)明的一種血管瘤動(dòng)物模型的建系方法，包括：
[0006] (1)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)的PyMT基因質(zhì)粒的構(gòu)建；
[0007] 所述質(zhì)粒中包含血管內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)的啟動(dòng)子Tie2、真核生物轉(zhuǎn)錄所需Kozak 序列、PyMT基因全序列、SV40 polyA信號(hào)和Tie2增強(qiáng)子序列；
[0008] (2)將上述構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)Pvul酶切線性化，回收7. Okb的DNA片段；然后將上 述DNA片段注射到受精卵的雄原核中，再移植到0. 5天假孕鼠的輸卵管中，得小鼠；
[0009] (3)將出生的小鼠進(jìn)行PCR鑒定，得到鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因小鼠；所述的轉(zhuǎn)基 因小鼠出現(xiàn)血管瘤樣表型；
[0010] (4)將上述轉(zhuǎn)基因小鼠作為培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系基礎(chǔ)種群的首建鼠建立血管瘤動(dòng) 物模型。
[0011] 步驟（1)中所述的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)的PyMT基因質(zhì)粒構(gòu)建的具體操作方法 為：實(shí)驗(yàn)小鼠為C57BL/6J轉(zhuǎn)基因小鼠，由上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司提供和繁 育，小鼠基因組的制備：取出生10天左右新生鼠的鼠尾0. 3cm，加450μ 1裂解液及50μ 1蛋 白酶K(10mg/ml)，56°C消化過(guò)夜；離心取上清，無(wú)水乙醇沉淀，70%乙醇洗滌，稍晾干后溶 解于200 μ 1純水中；
[0012] 以鼠尾DNA為模板，分別PCR擴(kuò)增Tie2啟動(dòng)子，Tie2增強(qiáng)子，以pPymt為模板PCR 擴(kuò)增PyMT基因全長(zhǎng)，以pGL3-Basic為模板擴(kuò)增A ;PCR體系為：模板DNA : 1 μ 1，5xPCR緩沖 液：4 μ 1，三磷酸脫氧核糖核苷：1 μ 1，PCR引物混合物：2 μ 1，PCR聚合酶：0. 2 μ 1，雙蒸水： 11·8μ 1 ;反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 3 分鐘，98°C 15 秒，55°C -68°C 15 秒，72°C 90 秒，72°C 5 分鐘， 35個(gè)循環(huán)；用ΚρηΙ和Sail酶切Tie2啟動(dòng)子序列，Xhol和Nhel酶切PyMT基因序列，Xbal 和Clal酶切載體連接片段序列，Clal和Sail酶切Tie2增強(qiáng)子，依次連接到pGL3-Basic載 體上；
[0013] 上述構(gòu)建用引物如下：
[0014] Tie2 啟動(dòng)子上游引物 catggtaccgcggaagcttactaagatctaatgaaaatc ;
[0015] Tie2 啟動(dòng)子下游引物 catgtcgacTTCAACAACTCACAACTTTGCG ;
[0016] Pymt 上游引物 catctcgagagcctcaccaccatcATGGATAGAGTTCTGAGCAGAG ;
[0017] Pymt 下游引物 catgctagcCTAGAAATGCCGGGAACG ;
[0018] 載體連接片段上游引物GTGTAATTCTAGAGTCGGGGC ;
[0019] 載體連接片段下游引物 CGACGGATCCTTATCGATTTTACC ;
[0020] Tie2 增強(qiáng)子上游引物 catatcgatctcgaggtccagtatggcttc ;
[0021] Tie2 增強(qiáng)子下游引物 catgtcgacgtaccattattgttttacttgggagg。
[0022] 步驟⑴中所述的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)的啟動(dòng)子Tie2的序列為：
[0023] AAGCTTACTAAGATCTAATGAAAATCAAGATGTTAGGCACAGTGCCAGATACTTTAACATAGTAATATG ACTCTTTAGAGTTTTGAGACAGGGCCTCATATAGTTTATGATGAATTCACTGTTTTGTCAAAGATGACCTTGAACTC TTAATCCATTCCCAAAGTGTTGTTGTCATATGTTTGCACCACTCCTGGCTTCATAGTGTTTTTAAAACACCCATGGA GAGTCGGGTGTGAAGATCCACACGTCTAACCTCAGCATCTGGTGAATCAAGGCAGGAGGGCGGGTGGTTGCAGGCTG GCTATAATATCTAAGTTTCAGTTAGTAAGGGCTGCATAATGAAACACTGTCTTAAACACAAAACCAAAACCCATGAA GGAGATACTATTGCCATTTAAAAGTCTCTGGAATGGAAATAGCTATCATAATCTTACCTCTGAGCCAGTGTCTGCCC TCAGGTGTGCCTGAGGACTGAACAGGGCTATGCACTCCTCAGGTTGGAAACATTACTAGTCCTCAGTGTCTGCTCTT GACCTGTTAACAGCTGAGTCAGGGTCTGCCCTCAGCTGTGCCTGAGGACAGAGCTGAGCTATCTACCCCTGCAGATT GGAAGCATTACAGGCACTCAAGATCAGCCCTGAAGTGATAAAACCTAAGGCAGAAATCCACCAAGACTAGCAGTGCC TCCGTGTCTCTTCCTGTGGCTGGTGGGAAAGGGAGGGGCAGTCCTTCCTTGATGCAAGGTCGTGTGTCTAGTGGCAT GCTTGCTTCATTCCCAGTGAGAGCAAGTGATCACCTGGGTAAGGAAGGTTCAGGTGCCTGAGCTTGCTGGAGAATTC ATCACTCATCCATCACTCTGCTCCTGTAGACATAATCACTTCTGTTGGGTCTTTATAGAGATGATTTATAACTTTGT TGTTTATAGTTTTTATGAATGTGTGTATTCATTTAGGTCACATGGGAGGTGCACATTTTCAGGTGTCTGTCTTTCCA TCACACGGGCTTTGAATTAAACTCAGTCTTGGTTTTACCGGCTGAGCCATCTCACCTGCCTGATTATTTAAAAATCT CCGGAGTAATCCAAGAGTGTGGTTTATGATTGTAGTATCAACACTCGGGAGGCTGAGGGAGCATCGTTATCATGAGC TCCAGGCTAGTTCCAGGCTTGCCTAAGCTGTAGAGCAAGTCACTCTCTTAAAAAGTGCCTCTCCCATATTTTTGTAT ATAATTTGCATCTGAAATTCTGTTTGCCAATAACTATGAAATTATTCACATTACTAAAATCTTCCTGTGCCAAGTTC TCCAACGAATTAGATCACACTCAGATGAAATGCTAATAAAAATTAAAGCTGTAGCCAGTAGCATGCGTATATTTGGG CTCAGGGCCAACAGGCAGGCGATCTGGGTGTAAGAAAATAGGCTAATGGCTGTGGAATCTGGTCTCTAGTGGCTCCG CTGAGAGCTGACCTCAACCACGCTCCCTCAAATTGATTGCCTTCCAGGTTATGATTTCTCATCACAGGAAACTTTGT TGCCCAATTCAAACCCTGTGAGTGAAAACAAAAACAGGAGAGCAAGTGCTGCTCCCCGTGCCCCAAAGCCCCTTCTG TCAGGGATCCCAAATGCACCCCAGAGAACAGCTTAGCCTGCAAGGGCTGGTCCTCATCGCATACCATACATAGGTGG AGGGCTTGTTATTCAATTCCTGGCCTATGAGAGGATACCCCTATTGTTCCTGAAAATGCTGACCAGGACCTTACTTG TAACAAAGATCCCTCTGCCCCACAATCCAGTTAAGGCAGGAGCAGGAGCCGGAGCAGGAGCAGAAGATAAGCCTTGG ATGAAGGGCAAGATGGATAGGGCTCGCTCTGCCCCAAGCCCTGCTGATACCAAGTGCCTTTAAGATACAGCCTTTCC CATCCTAATCTGCAAAGGAAACAGGAAAAAGGAACTTAACCCTCCCTGTGCTCAGACAGAAATGAGACTGTTACCGC CTGCTTCTGTGGTGTTTCTCCTTGCCGCCAACTTGTAAACAAGAGCGAGTGGACCATGCGAGCGGGAAGTCGCAAAG TTGTGAGTTGTTGAA。
[0024] 步驟⑴中所述的真核生物轉(zhuǎn)錄所需Kozak的序列為：
[0025] AGCCTCACCACCATC。
[0026] 步驟（1)中所述的PyMT基因的全序列為：
[0027] ATGGATAGAGTTCTGAGCAGAGCTGACAAAGAAAGGCTGCTAGAACTTCTAAAACT
[0028] TCCCAGACAACTATGGGGGGATTTTGGAAGAATGCAGCAGGCATATAAGCAGCAGT
[0029] CACTGCTACTGCACCCAGACAAAGGTGGAAGCCATGCCTTAATGCAGGAATTGAAC
[0030] AGTCTCTGGGGAACATTTAAAACTGAAGTATACAATCTGAGAATGAATCTAGGAGGAACCGGCTTCCAG GTAAGAAGGCTACATGCGGATGGGTGGAATCTAAGTACCAAAGACACCTTTGGTGATAGATACTACCAGCGGTTCTG CAGAATGCCTCTTACCTGCCTAGTAAATGTTAAATACAGCTCATGTAGTTGTATATTATGCCTGCTTAGAAAGCAAC ATAGAGAGCTCAAAGACAAATGTGATGCCAGGTGCCTAGTACTTGGAGAATGTTTTTGTCTTGAATGTTACATGCAA TGGTTTGGAACACCAACCCGAGATGTGCTGAACCTGTATGCAGACTTCATTGCAAGCATGCCTATAGACTGGCTGGA CCTGGATGTGCACAGCGTGTATAATCCAAAACGGCGGAGCGAGGAACTGAGGAGAGCGGCCACAGTCCACTACACGA TGACTACTGGTCATTCAGCTATGGAAGCAAGTACTTCACAAGGGAATGGAATGATTTCTTCAGAAAGTGGGACCCCA GCTACCAGTCGCCGCCTAAGACTGCCGAGTCTTCTGAGCAACCCGACCTATTCTGTTATGAGGAGCCACTCCTATCC CCCAACCCGAGTTCTCCAACAGATACACCCGCACATACTGCTGGAAGAAGACGAAATCCTTGTGTTGCTGAGCCCGA TGACAGCATATCCCCGGACCCCCCCAGAACTCCTGTATCCAGAAAGCGACCAAGACCAGCTGGAGCCACTGGAGGAG GAGGAGGAGGAGTACATGCCAATGGAGGATCTGTATTTGGACATCCTACCGGGGGAACAAGTACCCCAGCTCATCCC CCCCCCTATCATTCCCAGGGCGGGTCTGAGTCCATGGGAGGGTCTGATTCTTCGGGATTTGCAGAGGGCTCATTTCG ATCCGATCCTAGATGCGAGTCAGAGAATGAGAGCTACTCACAGAGCTGCTCTCAGAGCTCATTCAATGCAACGCCAC CTAAGAAGGCTAGGGAGGACCCTGCTCCTAGTGACTTTCCTAGCAGCCTTACTGGGTATTTGTCTCATGCTATTTAT TCTAATAAAACGTTCCCGGCATTTCTAG。
[0031] 步驟⑴中所述的Tie2增強(qiáng)子的序列為：
[0032] CTCGAGGTCCAGTATGGCTTCTCAACCTTCTTGGCAAGAAGGCTGCAGGGACGACCAGGAAGTTTGAAA CAGTCTTAGAAGAAAATGCTGGCTTAGAGACAGGTGGCAATGGGGGATGGGGAGCAGTATTCTGGTTTGCATAGAGG CAGAGTCCTTCCAAGTGCTGGGAAACAAGGCAGGAGGGCAGGGATAGAGCAAATGATGGCTCTGTATGTGTCCCTGT TCAGTTTGCATTTAATCTGAGCAAAATTTGGCTTTTGACATCTGCAACTCAAAAGAAGGTAATTAGGCAAATGACTG ACACATAGATATCTTAATAGTCAAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAGAGTTAGCAGTCAGGGGATGGTAGA AACTGCAAAACCAATCCGTATTCTTTCTTGAGATTTTTAGACAGTTGATGCTACTAGCCACAAAAAGAGTTTTAAGT GGGAGGAGAGTAAGATGCAGGCACCAAGGTGACAGGCTCCAGGTCTGTAGCATTAGCTTACAGATGAGATTCTTTAC AGAGAGCCAGGCAGCTGCATTGGCTAAAGCAGATCTGGGAGGGGGCCAGGAGATCAGCTGGCGGCACTCCCAGCCTC CAGGAAAGGCAACCCTTATTTCTGGAATTTTAAACTGATAACCCAATTCCCACCAGCCTGGCCAGGCTCTTCCTTAG CTCACATCACAAACACAGAAGGATTGTTTTAGATGGAGTCATGCTTGATTCTTTCTATACCTACTTCCAAGACCAAT TTTATAAAAGTTTATTTACCGCCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCATGGTATATATGGACGTCAGAGTT TGGTTCTCTCCTTCTGCAGTGTGGCTCTTAGAGATTGAACTCAGATCATGAGCAAGCACCTTGCTGCCTGCTATGTC CCTCCAGCAGTCTGACCATGTTCCTTCCCCCAAGATTGTGGAAGCTGGACTGAAGATCACAATCTGCCAGATGGGCA GAATCTTTACTCTTTGGCACATTTGTTGCTGATGGGGAGTGAATACCCATGGGGACATGGCTGTCATGGTGTGGAAG TGATAGAAATGAAAACATGTATGGATCTGTCACAGGAGCTGGTGAGGCTGATGGGTGTGTGGGTGGCCACTGTTTGC TCTCTGCTTGTCACAGCCTCTTGTTCAGGGCTTGATCAGGGAGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGGTCACACCCATCT CAGCAGATCTGTCAGCTTTCCCGCTTTTGTTAGAGGGTGATATCATGCTTCCTGGGGGGAGCTCTGGAAGACAATGA GCAGCCACTTTCCTCTAGATACAATAGGCGGAGTCAGGAAGGTAGTATTGACATTGCTGGGGCCTAGGAGCTACTCA CTGCTCGGTGGCCGTCAGATGGTGAACCGGCGTAACCTTGGCACACAGGCCTGGGCTGTACAAGGCGTCTGGCTGCA GGGCCAAAGAGGACTCCACCCTAGGGACAGGAGTACTTCAGACATCTGGGAATCTGGGATGGGTTTTAAAATTCAGA TCCCAATATAAAAAAACAACTCCCAAACAAACAGCAGCAATTAAAAAAAAAAAAAAAACCAGCCTCCCAAGTAAAAC AATAATGGTAC。
[0033] 步驟（3)中所述的PCR鑒定的具體操作為：取鼠尾0.3cm，加450 μ 1裂解液及 10mg/ml的蛋白酶Κ50μ 1，56°C消化過(guò)夜；離心取上清，無(wú)水乙醇沉淀，70%乙醇洗滌，稍晾 干后溶解于200μ 1純水中；Pymt上設(shè)計(jì)引物Midct2和Midcl，反應(yīng)條件為：95°C 3min變性 后，95°C 30s，60°C 30s，65°C 3min進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后，65°C lOmin，陽(yáng)性小鼠應(yīng)擴(kuò)增出260bp 片段；
[0034] 小鼠基因型鑒定用引物：
[0035] 鑒定上游引物 GAACAAGTACCCCAGCTCATCCCCCCCCCTATCATTC ;
[0036] 鑒定下游引物 CTAGAAATGCCGGGAACG。
[0037] 步驟（3)中所述的血管瘤樣表型的主要表達(dá)部位為小鼠的耳、舌、皮膚、黏膜、肝 等部位。
[0038] 步驟（4)中所述的建立血管瘤動(dòng)物模型的具體操作為：將上述轉(zhuǎn)基因小鼠作為培 育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系基礎(chǔ)種群的首建鼠，與同一種系的正常小鼠交配，得到F1代子鼠；將上 述F1代子鼠與同一種系的正常小鼠交配，得到F2代子鼠。
[0039] 本發(fā)明采用血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的組織特異性啟動(dòng)子Tie2,控制目的基因 PyMT在 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)僅限于血管內(nèi)皮部位。該種方法制作的血管瘤動(dòng)物模型，由于目的 基因 PyMT僅表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，避免了其在其他組織中誘導(dǎo)發(fā)生惡性腫瘤，模型動(dòng)物 表型專一，顯示典型的血管瘤樣改變；同時(shí)，由于限制了 PyMT基因在胚胎中的表達(dá)范圍和 水平，明顯改善了 PyMT基因的胚胎毒性，該方法產(chǎn)生的陽(yáng)性首建鼠（Founder鼠）的數(shù)量明 顯高于傳統(tǒng)方法；并且，控制PyMT基因在血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)避免了目的基因?qū)τ谛?鼠生殖能力的影響，小鼠繁殖能力較傳統(tǒng)方法增加，可以穩(wěn)定傳代、建系，且子代鼠也均有 血管瘤表型。
[0040] 本發(fā)明建立的血管瘤轉(zhuǎn)基因鼠模型動(dòng)物可以穩(wěn)定傳代并且子代基因型陽(yáng)性動(dòng)物 也可出現(xiàn)血管瘤樣新生物表型。動(dòng)物平均生存時(shí)間（5. 5個(gè)月）較無(wú)啟動(dòng)子控制的PyMT轉(zhuǎn) 基因動(dòng)物（0.5個(gè)月）明顯增加。但是，陽(yáng)性動(dòng)物的生殖能力較普通野生型小鼠低，影響小 鼠的建系。這可能是由于轉(zhuǎn)基因?qū)τ趧?dòng)物生殖細(xì)胞的影響。
[0041] 有益效果：
[0042] (1)本發(fā)明中目的基因 PyMT僅表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，避免了其在其他組織中誘 導(dǎo)發(fā)生惡性腫瘤，模型動(dòng)物表型專一,顯示典型的血管瘤樣改變；
[0043] (2)由于限制了 PyMT基因在胚胎中的表達(dá)范圍和水平，明顯改善了 PyMT基因的胚 胎毒性，該方法產(chǎn)生的陽(yáng)性首建鼠（Founder鼠）的數(shù)量明顯高于傳統(tǒng)方法；
[0044] (3)控制PyMT基因在血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)避免了目的基因?qū)τ谛∈笊衬?力的影響，小鼠繁殖能力較傳統(tǒng)方法增加，可以穩(wěn)定傳代、建系，且子代鼠也均有血管瘤表 型。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0045] 圖1血管內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)的pGL3_PyMT基因質(zhì)粒的構(gòu)建。
[0046] 圖2轉(zhuǎn)基因動(dòng)物大體表型，箭頭指示在耳及掌心等皮膚部位存在血管瘤樣新生 物。
[0047] 圖3轉(zhuǎn)基因動(dòng)物血管瘤發(fā)生部位的表型、組織學(xué)變化及PyMT基因表達(dá)情況。
[0048] 圖4Tie2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的PyMT轉(zhuǎn)基因血管瘤動(dòng)物建系情況。
[0049] 圖5代表性的F1及F2小鼠表型，箭頭所指為鼠耳血管瘤樣新生物。

【具體實(shí)施方式】
[0050] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0051] 實(shí)施例1
[0052] (1)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)的PyMT基因質(zhì)粒的構(gòu)建（如圖1)。
[0053] PyMT基因質(zhì)粒構(gòu)建方法
[0054] a.材料
[0055] 質(zhì)粒與菌株：質(zhì)粒pGL3_Basic購(gòu)自Promega公司。D-H5 α為天根產(chǎn)品。pPymt購(gòu) 自 ATCC。
[0056] 試劑：各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、T4DNA polymerase、Taq酶及PCR相關(guān)試 劑購(gòu)自Takara及NEB公司；膠回收Kit購(gòu)自天根生物公司；質(zhì)粒抽提Kit購(gòu)于Qiagen公 司；
[0057] 小鼠：C57BL/6J小鼠以及轉(zhuǎn)基因小鼠由上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司提 供和繁育，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循NIH制定的關(guān)于動(dòng)物飼養(yǎng)和使用的規(guī)定，并得到上海南方 模式生物研究中心動(dòng)物飼養(yǎng)和使用管理委員會(huì)的批準(zhǔn)。
[0058] 引物：由上海英俊生物公司合成 [0059] 構(gòu)建用引物：
[0060] Tie2 啟動(dòng)子上游引物 catggtaccgcggaagcttactaagatctaatgaaaatc
[0061] Tie2 啟動(dòng)子下游引物 catgtcgacTTCAACAACTCACAACTTTGCG
[0062] Pymt 上游引物 catctcgagagcctcaccaccatcATGGATAGAGTTCT
[0063] GAGCAGAG
[0064] Pymt 下游引物 catgctagcCTAGAAATGCCGGGAACG
[0065] 載體連接片段上游引物 GTGTAATTCTAGAGTCGGGGC
[0066] 載體連接片段下游引物 CGACGGATCCTTATCGATTTTACC
[0067] Tie2 增強(qiáng)子上游引物 catatcgatctcgaggtccagtatggcttc
[0068] Tie2 增強(qiáng)子下游引物 catgtcgacgtaccattattgttttacttgggagg
[0069] b.方法：轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒的構(gòu)建：以鼠尾DNA為模板，分別PCR擴(kuò)增Tie2啟動(dòng)子 (2086bp)，Tie2 增強(qiáng)子（1620bp)，以 pPymt 為模板 PCR 擴(kuò)增 PyMT 基因全長(zhǎng)（1266bp)，以 pGL3-Basic 為模板擴(kuò)增 A (260bp)。PCR 體系為：模板 DNA : 1 μ 1，5*PrimeSTAR buffer : 4 μ 1, dNTP ： 1 μ 1, Primer mix ：2μ 1, PrimeSTAR HS DNA Polymerase ：0.2 μ 1, dH20 ： 11. 8μ 1。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 °C 3min，98 °C 15sec，55 °C -68 °C 15sec，72 °C lmin30sec， 72°C 5min，35個(gè)循環(huán)。用Kpnl和Sail酶切Tie2啟動(dòng)子序列，Xhol和Nhel酶切PyMT基 因序列，Xbal和Clal酶切載體連接片段序列，Clal和Sail酶切Tie2增強(qiáng)子，依次連接到 pGL3-Basic載體上。通過(guò)酶切及測(cè)序驗(yàn)證最終載體。
[0070] c.結(jié)果：Pymt，TIE2 promotor，TIE2 enhancer 基因克隆到 pGL3 載體中，經(jīng)酶切 和序列分析證實(shí)，各組成元件正確，且閱讀框正確。轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒結(jié)構(gòu)見圖1。
[0071] 該質(zhì)粒包含血管內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)的啟動(dòng)子Tie2,真核生物轉(zhuǎn)錄所需Kozak序 列），PyMT基因全序列見上，SV40polyA信號(hào)（質(zhì)粒自帶），Tie2增強(qiáng)子序列。
[0072] (2)轉(zhuǎn)基因小鼠的制備：以Pvul酶切（Takara公司，大連）轉(zhuǎn)上述基因質(zhì)粒，回收 7. Okb的DNA片段用于顯微注射。取5-6周齡C57BL/6J雌鼠超排后與性成熟的C57BL/6J 雄鼠交配，挑選見栓鼠取受精卵，培養(yǎng)在M16培養(yǎng)液中，純化后的質(zhì)粒DNA溶解在TE緩沖液 中，濃度為5ng/ μ 1，以M2為體外操作液，將DNA注射到受精卵的雄原核中，注射后的受精卵 移植到0. 5天假孕鼠的輸卵管，每只假孕鼠輸卵管單側(cè)移卵約25枚。
[0073] 小鼠基因組的制備：移植后的假孕鼠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，待仔鼠出生10天左右 剪取鼠尾0. 3cm，加45〇μ 1裂解液及5〇μ 1蛋白酶K(10mg/ml)，56°C消化過(guò)夜。離心取上 清，無(wú)水乙醇沉淀，70 %乙醇洗滌，稍晾干后溶解于200 μ 1純水中。
[0074] PCR鑒定轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鼠：Pymt上設(shè)計(jì)引物Midct2和Midcl，反應(yīng)條件為：95°C 3min 變性后，95°C 30s，60°C 30s，65°C 3min進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后，65°C 10min，陽(yáng)性小鼠應(yīng)擴(kuò)增出 260bp片段
[0075] 小鼠基因型鑒定用引物：
[0076] 鑒定上游引物 GAACAAGTACCCCAGCTCATCCCCCCCCC
[0077] TATCATTC
[0078] 鑒定下游引物 CTAGAAATGCCGGGAACG
[0079] 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物顯微注射及出生情況：采用C57BL/6品系小鼠（中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中心）作為轉(zhuǎn)基因模型動(dòng)物。注射受精卵440枚，出生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物82只，其中基因型鑒定 為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因首建鼠7只，動(dòng)物出生率（出生動(dòng)物數(shù)/注射受精卵數(shù)）18. 6 %，轉(zhuǎn)基因的 總效率（陽(yáng)性子代動(dòng)物/注射受精卵總數(shù)）為1. 6%。與無(wú)啟動(dòng)子控制的PyMT轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 比較，采用Tie2啟動(dòng)子控制目的基因表達(dá)的策略，其動(dòng)物出生率增加3. 9倍，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的 總效率增加2. 7倍（之前報(bào)道，無(wú)啟動(dòng)子控制的PyMT轉(zhuǎn)基因動(dòng)物出生率為4. 8%，轉(zhuǎn)基因 總效率為〇· 5%，Transgenic Res (2009) 18:399 - 406)。該結(jié)果表明，采用啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá) 的PyMT基因，其胚胎致死性及胚胎毒性較無(wú)啟動(dòng)子控制的基因明顯下降，從而有助于獲得 更多的陽(yáng)性動(dòng)物。
[0080] (3)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的表型：出生小鼠基因型經(jīng)PCR鑒定證實(shí)陽(yáng)性的7只轉(zhuǎn)基因小鼠， 均出現(xiàn)血管瘤樣表型（圖2)。新生物主要表達(dá)部位在小鼠的耳、舌、皮膚、黏膜、肝等部位， 組織學(xué)檢查證實(shí)為血管瘤樣改變，免疫組織化學(xué)方法鑒定證實(shí)新生物的內(nèi)皮細(xì)胞部位表達(dá) PyMT蛋白（圖3)。證實(shí)，采用Tie2啟動(dòng)子控制策略不會(huì)妨礙轉(zhuǎn)基因動(dòng)物發(fā)生血管瘤表型。
[0081] (4)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的存活及建系：利用基因型鑒定為陽(yáng)性的7只轉(zhuǎn)基因首建鼠作為 培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系的基礎(chǔ)種群。將首建鼠與同一種系的C57BL/6正常小鼠交配，得到F1 代子鼠，鼠尾DNA制備及基因型鑒定，證實(shí)并建立3個(gè)品系的陽(yáng)性F1代小鼠，3個(gè)品系的F1 代小鼠與同一種系正常小鼠交配，經(jīng)基因型鑒定，得到F2代子鼠（圖4)，F(xiàn)1代與F2代小鼠 表型與首建鼠相似，在皮膚、黏膜部位可見血管瘤樣新生物（圖5)。證實(shí)采用本策略的轉(zhuǎn)基 因方法獲得的動(dòng)物表型可以穩(wěn)定傳代。
【權(quán)利要求】
1. 一種血管瘤動(dòng)物模型的建系方法，包括： (1)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)的PyMT基因質(zhì)粒的構(gòu)建； 所述質(zhì)粒中包含血管內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)的啟動(dòng)子Tie2、真核生物轉(zhuǎn)錄所需Kozak序 列、PyMT基因全序列、SV40polyA信號(hào)和Tie2增強(qiáng)子序列； ⑵將上述構(gòu)建好的質(zhì)粒經(jīng)Pvul酶切線性化，回收7. Okb的DNA片段；然后將上述DNA 片段注射到受精卵的雄原核中，再移植到0. 5天假孕鼠的輸卵管中，得小鼠； (3) 將出生的小鼠進(jìn)行PCR鑒定，得到鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因小鼠；所述的轉(zhuǎn)基因小 鼠出現(xiàn)血管瘤樣表型； (4) 將上述轉(zhuǎn)基因小鼠作為培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系基礎(chǔ)種群的首建鼠建立血管瘤動(dòng)物模 型。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管瘤動(dòng)物模型的建系方法，其特征在于：步驟（1)中所述 的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)的PyMT基因質(zhì)粒構(gòu)建的具體操作方法為： 以鼠尾DNA為模板，分別PCR擴(kuò)增Tie2啟動(dòng)子，Tie2增強(qiáng)子，以pPymt為模板PCR擴(kuò) 增PyMT基因全長(zhǎng)，以pGL3-Basic為模板擴(kuò)增A ;PCR體系為：模板DNA :1 μ 1，5xPCR緩沖 液：4 μ 1，三磷酸脫氧核糖核苷：1 μ 1，PCR引物混合物：2 μ 1，PCR聚合酶：0. 2 μ 1，雙蒸水： 11·8μ 1 ;反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C 3 分鐘，98°C 15 秒，55°C -68°C 15 秒，72°C 90 秒，72°C 5 分鐘， 35個(gè)循環(huán)；用ΚρηΙ和Sail酶切Tie2啟動(dòng)子序列，Xhol和Nhel酶切PyMT基因序列，Xbal 和Clal酶切載體連接片段序列，Clal和Sail酶切Tie2增強(qiáng)子，依次連接到pGL3-Basic載 體上； 上述構(gòu)建用引物如下： Tie2 弓 catggtaccgcggaagcttactaagatctaatgaaaatc ； Tie2 啟動(dòng)子下游引物 catgtcgacTTCAACAACTCACAACTTTGCG ; Pymt 上游引物 catctcgagagcctcaccaccatcATGGATAGAGTTCTGAGCAGAG ; Pymt 下游引物 catgctagcCTAGAAATGCCGGGAACG ; 載體連接片段上游引物GTGTAATTCTAGAGTCGGGGC ; 載體連接片段下游引物CGACGGATCCTTATCGATTTTACC ; Tie2 增強(qiáng)子上游引物 catatcgatctcgaggtccagtatggcttc ; Tie2 增強(qiáng)子下游引物 catgtcgacgtaccattattgttttacttgggagg。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的血管瘤動(dòng)物模型的建系方法，其特征在于：所述鼠尾DNA的 制備如下：取出生10天的C57BL/6J小鼠鼠尾0. 3cm，加 450 μ 1裂解液及10mg/ml的50 μ 1 蛋白酶Κ，56°C消化過(guò)夜；離心取上清液，無(wú)水乙醇沉淀，70%乙醇洗滌，稍晾干后溶解于 200 μ 1純水中，即可。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管瘤動(dòng)物模型的建系方法，其特征在于：步驟（1)中所述 的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)的啟動(dòng)子Tie2的序列為： AAGCTTACTAAGATCTAATGAAAATCAAGATGTTAGGCACAGTGCCAGATACTTTAACATAGTAATATGACT CTTTAGAGTTTTGAGACAGGGCCTCATATAGTTTATGATGAATTCACTGTTTTGTCAAAGATGACCTTGAACTCTTA ATCCATTCCCAAAGTGTTGTTGTCATATGTTTGCACCACTCCTGGCTTCATAGTGTTTTTAAAACACCCATGGAGAG TCGGGTGTGAAGATCCACACGTCTAACCTCAGCATCTGGTGAATCAAGGCAGGAGGGCGGGTGGTTGCAGGCTGGCT ATAATATCTAAGTTTCAGTTAGTAAGGGCTGCATAATGAAACACTGTCTTAAACACAAAACCAAAACCCATGAAGGA GATACTATTGCCATTTAAAAGTCTCTGGAATGGAAATAGCTATCATAATCTTACCTCTGAGCCAGTGTCTGCCCTCA GGTGTGCCTGAGGACTGAACAGGGCTATGCACTCCTCAGGTTGGAAACATTACTAGTCCTCAGTGTCTGCTCTTGAC CTGTTAACAGCTGAGTCAGGGTCTGCCCTCAGCTGTGCCTGAGGACAGAGCTGAGCTATCTACCCCTGCAGATTGGA AGCATTACAGGCACTCAAGATCAGCCCTGAAGTGATAAAACCTAAGGCAGAAATCCACCAAGACTAGCAGTGCCTCC GTGTCTCTTCCTGTGGCTGGTGGGAAAGGGAGGGGCAGTCCTTCCTTGATGCAAGGTCGTGTGTCTAGTGGCATGCT TGCTTCATTCCCAGTGAGAGCAAGTGATCACCTGGGTAAGGAAGGTTCAGGTGCCTGAGCTTGCTGGAGAATTCATC ACTCATCCATCACTCTGCTCCTGTAGACATAATCACTTCTGTTGGGTCTTTATAGAGATGATTTATAACTTTGTTGT TTATAGTTTTTATGAATGTGTGTATTCATTTAGGTCACATGGGAGGTGCACATTTTCAGGTGTCTGTCTTTCCATCA CACGGGCTTTGAATTAAACTCAGTCTTGGTTTTACCGGCTGAGCCATCTCACCTGCCTGATTATTTAAAAATCTCCG GAGTAATCCAAGAGTGTGGTTTATGATTGTAGTATCAACACTCGGGAGGCTGAGGGAGCATCGTTATCATGAGCTCC AGGCTAGTTCCAGGCTTGCCTAAGCTGTAGAGCAAGTCACTCTCTTAAAAAGTGCCTCTCCCATATTTTTGTATATA ATTTGCATCTGAAATTCTGTTTGCCAATAACTATGAAATTATTCACATTACTAAAATCTTCCTGTGCCAAGTTCTCC AACGAATTAGATCACACTCAGATGAAATGCTAATAAAAATTAAAGCTGTAGCCAGTAGCATGCGTATATTTGGGCTC AGGGCCAACAGGCAGGCGATCTGGGTGTAAGAAAATAGGCTAATGGCTGTGGAATCTGGTCTCTAGTGGCTCCGCTG AGAGCTGACCTCAACCACGCTCCCTCAAATTGATTGCCTTCCAGGTTATGATTTCTCATCACAGGAAACTTTGTTGC CCAATTCAAACCCTGTGAGTGAAAACAAAAACAGGAGAGCAAGTGCTGCTCCCCGTGCCCCAAAGCCCCTTCTGTCA GGGATCCCAAATGCACCCCAGAGAACAGCTTAGCCTGCAAGGGCTGGTCCTCATCGCATACCATACATAGGTGGAGG GCTTGTTATTCAATTCCTGGCCTATGAGAGGATACCCCTATTGTTCCTGAAAATGCTGACCAGGACCTTACTTGTAA CAAAGATCCCTCTGCCCCACAATCCAGTTAAGGCAGGAGCAGGAGCCGGAGCAGGAGCAGAAGATAAGCCTTGGATG AAGGGCAAGATGGATAGGGCTCGCTCTGCCCCAAGCCCTGCTGATACCAAGTGCCTTTAAGATACAGCCTTTCCCAT CCTAATCTGCAAAGGAAACAGGAAAAAGGAACTTAACCCTCCCTGTGCTCAGACAGAAATGAGACTGTTACCGCCTG CTTCTGTGGTGTTTCTCCTTGCCGCCAACTTGTAAACAAGAGCGAGTGGACCATGCGAGCGGGAAGTCGCAAAGTTG TGAGTTGTTGAA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管瘤動(dòng)物模型的建系方法，其特征在于：步驟（1)中所述 的真核生物轉(zhuǎn)錄所需Kozak的序列為：AGCCTCACCACCATC ; 步驟（1)中所述的PyMT基因的全序列為： ATGGATAGAGTTCTGAGCAGAGCTGACAAAGAAAGGCTGCTAGAACTTCTAAAACTTCCCAGACAACTATGG GGGGATTTTGGAAGAATGCAGCAGGCATATAAGCAGCAGTCACTGCTACTGCACCCAGACAAAGGTGGAAGCCATGC CTTAATGCAGGAATTGAACAGTCTCTGGGGAACATTTAAAACTGAAGTATACAATCTGAGAATGAATCTAGGAGGAA CCGGCTTCCAGGTAAGAAGGCTACATGCGGATGGGTGGAATCTAAGTACCAAAGACACCTTTGGTGATAGATACTAC CAGCGGTTCTGCAGAATGCCTCTTACCTGCCTAGTAAATGTTAAATACAGCTCATGTAGTTGTATATTATGCCTGCT TAGAAAGCAACATAGAGAGCTCAAAGACAAATGTGATGCCAGGTGCCTAGTACTTGGAGAATGTTTTTGTCTTGAAT GTTACATGCAATGGTTTGGAACACCAACCCGAGATGTGCTGAACCTGTATGCAGACTTCATTGCAAGCATGCCTATA GACTGGCTGGACCTGGATGTGCACAGCGTGTATAATCCAAAACGGCGGAGCGAGGAACTGAGGAGAGCGGCCACAGT CCACTACACGATGACTACTGGTCATTCAGCTATGGAAGCAAGTACTTCACAAGGGAATGGAATGATTTCTTCAGAAA GTGGGACCCCAGCTACCAGTCGCCGCCTAAGACTGCCGAGTCTTCTGAGCAACCCGACCTATTCTGTTATGAGGAGC CACTCCTATCCCCCAACCCGAGTTCTCCAACAGATACACCCGCACATACTGCTGGAAGAAGACGAAATCCTTGTGTT GCTGAGCCCGATGACAGCATATCCCCGGACCCCCCCAGAACTCCTGTATCCAGAAAGCGACCAAGACCAGCTGGAGC CACTGGAGGAGGAGGAGGAGGAGTACATGCCAATGGAGGATCTGTATTTGGACATCCTACCGGGGGAACAAGTACCC CAGCTCATCCCCCCCCCTATCATTCCCAGGGCGGGTCTGAGTCCATGGGAGGGTCTGATTCTTCGGGATTTGCAGAG GGCTCATTTCGATCCGATCCTAGATGCGAGTCAGAGAATGAGAGCTACTCACAGAGCTGCTCTCAGAGCTCATTCAA TGCAACGCCACCTAAGAAGGCTAGGGAGGACCCTGCTCCTAGTGACTTTCCTAGCAGCCTTACTGGGTATTTGTCTC ATGCTATTTATTCTAATAAAACGTTCCCGGCATTTCTAG。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管瘤動(dòng)物模型的建系方法，其特征在于：步驟（1)中所述 的Tie2增強(qiáng)子的序列為： CTCGAGGTCCAGTATGGCTTCTCAACCTTCTTGGCAAGAAGGCTGCAGGGACGACCAGGAAGTTTGAAACAG TCTTAGAAGAAAATGCTGGCTTAGAGACAGGTGGCAATGGGGGATGGGGAGCAGTATTCTGGTTTGCATAGAGGCAG AGTCCTTCCAAGTGCTGGGAAACAAGGCAGGAGGGCAGGGATAGAGCAAATGATGGCTCTGTATGTGTCCCTGTTCA GTTTGCATTTAATCTGAGCAAAATTTGGCTTTTGACATCTGCAACTCAAAAGAAGGTAATTAGGCAAATGACTGACA CATAGATATCTTAATAGTCAAGGAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAGAGTTAGCAGTCAGGGGATGGTAGAAAC TGCAAAACCAATCCGTATTCTTTCTTGAGATTTTTAGACAGTTGATGCTACTAGCCACAAAAAGAGTTTTAAGTGGG AGGAGAGTAAGATGCAGGCACCAAGGTGACAGGCTCCAGGTCTGTAGCATTAGCTTACAGATGAGATTCTTTACAGA GAGCCAGGCAGCTGCATTGGCTAAAGCAGATCTGGGAGGGGGCCAGGAGATCAGCTGGCGGCACTCCCAGCCTCCAG GAAAGGCAACCCTTATTTCTGGAATTTTAAACTGATAACCCAATTCCCACCAGCCTGGCCAGGCTCTTCCTTAGCTC ACATCACAAACACAGAAGGATTGTTTTAGATGGAGTCATGCTTGATTCTTTCTATACCTACTTCCAAGACCAATTTT ATAAAAGTTTATTTACCGCCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCATGGTATATATGGACGTCAGAGTTTGG TTCTCTCCTTCTGCAGTGTGGCTCTTAGAGATTGAACTCAGATCATGAGCAAGCACCTTGCTGCCTGCTATGTCCCT CCAGCAGTCTGACCATGTTCCTTCCCCCAAGATTGTGGAAGCTGGACTGAAGATCACAATCTGCCAGATGGGCAGAA TCTTTACTCTTTGGCACATTTGTTGCTGATGGGGAGTGAATACCCATGGGGACATGGCTGTCATGGTGTGGAAGTGA TAGAAATGAAAACATGTATGGATCTGTCACAGGAGCTGGTGAGGCTGATGGGTGTGTGGGTGGCCACTGTTTGCTCT CTGCTTGTCACAGCCTCTTGTTCAGGGCTTGATCAGGGAGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGGTCACACCCATCTCAG CAGATCTGTCAGCTTTCCCGCTTTTGTTAGAGGGTGATATCATGCTTCCTGGGGGGAGCTCTGGAAGACAATGAGCA GCCACTTTCCTCTAGATACAATAGGCGGAGTCAGGAAGGTAGTATTGACATTGCTGGGGCCTAGGAGCTACTCACTG CTCGGTGGCCGTCAGATGGTGAACCGGCGTAACCTTGGCACACAGGCCTGGGCTGTACAAGGCGTCTGGCTGCAGGG CCAAAGAGGACTCCACCCTAGGGACAGGAGTACTTCAGACATCTGGGAATCTGGGATGGGTTTTAAAATTCAGATCC CAATATAAAAAAACAACTCCCAAACAAACAGCAGCAATTAAAAAAAAAAAAAAAACCAGCCTCCCAAGTAAAACAAT AATGGTAC。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管瘤動(dòng)物模型的建系方法，其特征在于：步驟（2)中受精 卵的制備方法為：取5-6周齡C57BL/6J雌鼠超排后與性成熟的C57BL/6J雄鼠交配，挑選見 栓鼠取受精卵，培養(yǎng)在M16培養(yǎng)液中。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管瘤動(dòng)物模型的建系方法，其特征在于：步驟（3)中所述 的PCR鑒定的具體操作為：取鼠尾0. 3cm，加450 μ 1裂解液及10mg/ml的蛋白酶K50 μ 1， 56°C消化過(guò)夜；離心取上清，無(wú)水乙醇沉淀，70 %乙醇洗滌，稍晾干后溶解于200 μ 1純水 中；Pymt上設(shè)計(jì)引物Midct2和Midcl，反應(yīng)條件為：95°C 3min變性后，95°C 30s，60°C 30s， 65°C 3min進(jìn)行35個(gè)循環(huán)后，65°C lOmin，陽(yáng)性小鼠應(yīng)擴(kuò)增出260bp片段； 小鼠基因型鑒定用引物： 鑒定上游引物 GAACAAGTACCCCAGCTCATCCCCCCCCCTATCATTC ; 鑒定下游引物 CTAGAAATGCCGGGAACG。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管瘤動(dòng)物模型的建系方法，其特征在于：步驟（3)中所述 的血管瘤樣表型的主要表達(dá)部位為小鼠的耳、舌、皮膚、黏膜、肝。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的血管瘤動(dòng)物模型的建系方法，其特征在于：步驟（4)中所述 的建立血管瘤動(dòng)物模型的具體操作為：將上述轉(zhuǎn)基因小鼠作為培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物品系基礎(chǔ)種 群的首建鼠，與同一種系的正常小鼠交配，得到F1代子鼠；將上述F1代子鼠與同一種系的 正常小鼠交配，得到F2代子鼠。
【文檔編號(hào)】A01K67/027GK104087615SQ201410315187
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月3日
【發(fā)明者】徐骎, 謝芙蓉, 余婧爽, 陳萬(wàn)濤 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院