桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素p450基因的rna干擾載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一種桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素P450基因的RNA干擾載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明利用載體PFGC5941為框架，通過(guò)雙酶切，在其內(nèi)含子兩邊分別插入桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素P450基因的正反向特異性目的片段，構(gòu)成RNA干擾載體非常重要的區(qū)域，構(gòu)建的RNA干擾表達(dá)載體在轉(zhuǎn)化到植株后，在其強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV35S的驅(qū)動(dòng)下，在其體細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成雙鏈RNA的“發(fā)卡結(jié)構(gòu)”，使得桔小實(shí)蠅取食植株后體內(nèi)同源基因片段的正常表達(dá)和翻譯受到影響，實(shí)現(xiàn)干擾昆蟲(chóng)正常生長(zhǎng)發(fā)育，達(dá)到植株抗桔小實(shí)蠅的目的，對(duì)桔小實(shí)蠅的控制發(fā)揮重要作用，減少化學(xué)農(nóng)藥使用量。
【專利說(shuō)明】桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素 P450基因的RNA干擾載體及其構(gòu)建方法 和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種RNA干擾載體，尤其涉及一種桔小實(shí)蠅 細(xì)胞色素 P450基因的RNA干擾載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis又名東方果實(shí)蠅，是一種世界危險(xiǎn)性檢疫害蟲(chóng)，廣 泛分布于中國(guó)各大柑橘產(chǎn)區(qū)，使中國(guó)的柑橘產(chǎn)業(yè)面臨著嚴(yán)重威脅，每年都對(duì)柑橘為害造成 巨大經(jīng)濟(jì)損失，能危害250多種瓜果蔬菜。桔小實(shí)蠅寄主范圍廣，可危害柑橘、芒果和楊桃 等250多種水果蔬菜和作物。隨著氣候變化、種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整和國(guó)際貿(mào)易的增加，其危害面 積逐漸擴(kuò)大，給果蔬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前化學(xué)防治仍是控制桔小實(shí)蠅的重要措施， 然而近年來(lái)對(duì)桔小實(shí)蠅種群抗藥性監(jiān)測(cè)表明，其抗藥性上升非?？臁?br> [0003] RNA干擾（RNAinterference，RNAi)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種重要基因沉默現(xiàn)象，它是 指通過(guò)雙鏈RNA的介導(dǎo)的特異性的降解對(duì)應(yīng)序列的mRNA，從而特異性地抑制相應(yīng)基因的表 達(dá)，是植物對(duì)外來(lái)入侵者的一種重要的防御機(jī)制?；赗NA干擾技術(shù)獲得抗昆蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因 材料已在水稻、蔬菜和棉花等作物上取得成功。細(xì)胞色素 P450s是一種具有血色素類似結(jié) 構(gòu)的多功能氧化酶系，該酶系由數(shù)量眾多、功能多樣的不同成員構(gòu)成，形成了一個(gè)超家族。 一些P450基因通過(guò)對(duì)內(nèi)源激素的合成或降解，參與昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)、發(fā)育和生殖等重要的生理 代謝過(guò)程。目前還沒(méi)有人將桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素 P450基因用于構(gòu)建RNA干擾載體對(duì)桔小實(shí) 蠅進(jìn)行控制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素 P450基因的RNA干擾載體，該載體含 有桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素 P450基因目的片段，得到的轉(zhuǎn)基因植株可以使取食該植株的桔小實(shí) 蠅發(fā)生RNA沉默現(xiàn)象，使得轉(zhuǎn)基因植株對(duì)桔小實(shí)蠅具有一定抗性。
[0005] 本發(fā)明還提供干擾細(xì)胞色素 P450基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法和應(yīng)用，為利用RNA干 擾技術(shù)的植物抗蟲(chóng)育種工程提供了一種新的策略和思路。
[0006] 桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素 P450基因的RNA干擾載體，包括骨架載體和正、反義鏈，其特征 在于：以桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素 P450基因部分片段為正或反義鏈，所述細(xì)胞色素 P450基因部分 片段序列如SEQIDN0. 1，所述骨架載體為PFGC5941載體。
[0007] 所述正義鏈插入在酶切位點(diǎn)Xhol和Ncol之間，反義鏈插入在酶切位點(diǎn)Xball和 BamHI之間。
[0008] 桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素 P450基因的RNA干擾載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0009] 1)細(xì)胞色素 P450基因目的片段與質(zhì)粒的連接
[0010] 提取桔小實(shí)蠅總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，以SEQIDN0. 2和SEQIDN0. 3 為引物對(duì)細(xì)胞色素 P450基因的正向目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以SEQIDN0. 4和SEQIDN0. 5 為引物對(duì)細(xì)胞色素 P450基因的反向目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，目的片段約為 600bp，回收PCR產(chǎn)物，與載體pMD-19連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α得到重組質(zhì)粒PMD-19-P1F1 和PMD-19-P2F2,進(jìn)行序列驗(yàn)證，測(cè)序正確的目的片段即可用于RNA干擾載體的構(gòu)建；所述 SEQID NO. 2?5的序列如下：
[0011] SEQIDN0. 2 :5' -GCCATGGATAGTCTGAACGAACCGAA-3' ；
[0012] SEQIDN0. 3 :5' -CCATGGGATAGATTTCGGGATCAC-3' ；
[0013] SEQIDN0. 4 :5, -GCTCTAGAGCATAGTCTGAACGAACCGAA-3,；
[0014] SEQIDN0. 5 :5' -CGGGATCCGATAGATTTCGGGATCAC-3' ；
[0015] 2)細(xì)胞色素 P450基因的RNA干擾載體的構(gòu)建
[0016] 將上述測(cè)序正確的細(xì)胞色素 P450基因正向目的片段質(zhì)粒pMD-19-PlFl與載體 PFGC5941分別用Xhol和Ncol雙酶切，將pMD-19-PlFl與載體PFGC5941的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連 接得到插入正向目的片段的重組質(zhì)粒PFGC5941-P1F1 ;將PFGC5941-P1F1和細(xì)胞色素 P450 基因反向目的片段質(zhì)粒PMD-19-P2F2分別用Xball和BamHI雙酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接， 即可得到插入正、反義鏈的RNA干擾載體PFGC5941-P1F1/P2F2,經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)、核苷酸序 列分析，目的片段序列正確的干擾載體可用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。
[0017] 所述的桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素 P450基因的RNA干擾載體在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，所述 轉(zhuǎn)基因植物為柑橘屬植物。
[0018] 所述應(yīng)用為將桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素 P450基因的RNA干擾載體轉(zhuǎn)化有關(guān)受體植物，使 之對(duì)桔小實(shí)蠅產(chǎn)生抗性，所述受體植物為柑桔。
[0019] 所述轉(zhuǎn)化的方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。
[0020] 所述農(nóng)桿菌為農(nóng)桿菌菌株EHA105。
[0021] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明構(gòu)建了含有桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素 P450基因正反向目 的片段的RNA干擾載體以及該載體的構(gòu)建方法和應(yīng)用，本發(fā)明利用載體PFGC5941為框架， 通過(guò)雙酶切，在其內(nèi)含子兩邊分別插入桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素 P450基因的正反向特異性目的 片段，構(gòu)成RNA干擾載體非常重要的區(qū)域，為形成"發(fā)卡結(jié)構(gòu)"提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本發(fā)明構(gòu)建 的RNA干擾表達(dá)載體在轉(zhuǎn)化到植株后，在其強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV35S的驅(qū)動(dòng)下，可以在其體細(xì)胞內(nèi) 轉(zhuǎn)錄形成雙鏈RNA的"發(fā)卡結(jié)構(gòu)"，使得桔小實(shí)蠅取食植株后體內(nèi)同源基因片段的正常表達(dá) 和翻譯受到影響，從而實(shí)現(xiàn)干擾昆蟲(chóng)正常生長(zhǎng)發(fā)育的目的，達(dá)到植株抗桔小實(shí)蠅的目的，對(duì) 桔小實(shí)蠅的控制發(fā)揮重要作用，能夠減少化學(xué)農(nóng)藥使用量，具有極其廣闊的市場(chǎng)前景。載體 PFGC5941還攜帶能抗除草劑的Bar基因，為轉(zhuǎn)基因苗的初步篩選提供標(biāo)記基因。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為提取的桔小實(shí)蠅總RNA的電泳圖。M :DL5000Marker。
[0023] 圖2為細(xì)胞色素 P450基因正向反向目的片段的克隆電泳圖。1、2是細(xì)胞色素 P450 基因正向片段電泳圖；3、4是細(xì)胞色素 P450反向片段電泳圖；M :DL5000Marker。
[0024] 圖3為細(xì)胞色素 P450基因正向反向目的片段插入載體PFGC5941位置示意圖。
[0025] 圖4為載體PFGC5941經(jīng)Xhol和Ncol酶切后的電泳圖。1、2是載體PFGC5941 ;3、 4 是經(jīng) Xhol 和 Ncol 酶切后的載體 PFGC5941 ;M 是 DL5000Marker。
[0026] 圖5為細(xì)胞色素 P450基因正向片段經(jīng)Xhol和Ncol酶切后的電泳圖。1、2是經(jīng) Xhol和Ncol酶切后的細(xì)胞色素 P450基因正向片段；Μ是DL5000Marker。
[0027] 圖6為重組質(zhì)粒PFGC5941-P1F1酶切后的電泳圖1為重組質(zhì)粒PFGC5941-P1F1 ;2 為經(jīng) Xbal 和 BamHI 酶切后的重組質(zhì)粒 PFGC5941-P1F1 ;M 是 DL5000Marker。
[0028] 圖7為載體PFGC5941-P1F1/P2F2經(jīng)Xbal和BamHI酶切后的電泳圖。1、2是經(jīng) Xbal 和 BamHI 酶切后的重組質(zhì)粒 PFGC5941-P1F1/P2F2 ;M 是 DL5000Marker。
[0029] 圖8為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因苗的PCR擴(kuò)增檢測(cè)電泳圖。1是質(zhì)粒PFGC-P1F1/P2F2對(duì)照；2 是清水對(duì)照；3-6是陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物；Μ是DL5000Marker。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α (北京天根生化科技有限公司，中國(guó)）；
[0031] 農(nóng)桿菌ΕΗΑ105(中國(guó)農(nóng)科院柑橘研究所改良中心提供）；
[0032] 總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，中國(guó)）；
[0033] PrimeScriptTMRTreagentkitwithgDNAEraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司，日 本）；
[0034] DNA回收純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司，中國(guó)）；
[0035] 質(zhì)粒提取試劑盒（TaKaRa公司，日本）；
[0036] pMD19-T (TaKaRa 公司，日本）；
[0037] Ncol、Xbal、Xhol、BamHI (NEB 公司，美國(guó)）；
[0038] LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨（Tryptone) 10g/L、酵母提取物（Yeastextract) 5g/L、氯 化鈉（NaCl) 10g/L ;
[0039] LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨（Tryptone) 10g/L、酵母提取物（Yeastextract) 5g/L氯 化鈉（NaCl)10g/L、瓊脂粉 15g/L。
[0040] S0C培養(yǎng)基：胰蛋白胨20 ;酵母浸粉5 ;氯化鈉 0. 5 ;氯化鉀0. 186 ;氯化鎂0. 95 ;硫 酸鎂 1. 2 ;葡萄糖 3. 6 ; (g/L)pH7. 0
[0041] 載體PFGC5941 :本發(fā)明的載體PFGC5941由中國(guó)農(nóng)科院柑橘研究所改良中心提供， 也可向公眾提供。植物干擾表達(dá)載體PFGC5941是各研究中使用較多的植物雙元表達(dá)載體。 它含有強(qiáng)啟動(dòng)子CaMV35S可以啟動(dòng)外源基因有效表達(dá)；還有一段內(nèi)含子結(jié)構(gòu)（來(lái)源于矮牽 牛）作為間隔序列，是構(gòu)成RNA干擾載體非常重要的區(qū)域，為形成"發(fā)卡結(jié)構(gòu)"提供結(jié)構(gòu)基 礎(chǔ)；另外，PFGC5941載體還攜帶能抗除草劑的Bar基因，為轉(zhuǎn)基因苗的初步篩選提供標(biāo)記基 因。
[0042] 實(shí)施例1細(xì)胞色素 P450基因的克隆及回收純化
[0043] 一、桔小實(shí)蠅總RNA的提取及全長(zhǎng)cDNA的獲得
[0044] 采用總RNA提取試劑盒提取由西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供的桔小實(shí)蠅蟲(chóng)源的總 RNA，具體步驟參見(jiàn)總RNA提取試劑盒使用說(shuō)明。提取的總RNA電泳圖如圖1所示。
[0045] 將提取得到的總 RNA 利用 PrimeScriptTMRTreagentkitwithgDNAEraser 反轉(zhuǎn)錄試 劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體步驟參見(jiàn)反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明。
[0046] 二、細(xì)胞色素 P450基因目的片段的克隆及回收純化
[0047] (1)在NCBI網(wǎng)站上搜索桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素 P450基因全長(zhǎng)序列，比對(duì)保守序列，根 據(jù)桔小實(shí)蠅CYP6EK1序列的保守序列設(shè)計(jì)目的片段正向和反向特異性引物，引物P1和F1 擴(kuò)增細(xì)胞色素 P450基因正向目的片段，引物P2和F2擴(kuò)增反向目的片段，引物名稱和序列 及對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)如表1所示：
[0048] 表1桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素 P450基因擴(kuò)增引物
[0049]

【權(quán)利要求】
1. 桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素 P450基因的RNA干擾載體，包括骨架載體和正、反義鏈，其特征在 于：以桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素 P450基因部分片段為正或反義鏈，所述細(xì)胞色素 P450基因部分片 段序列如SEQIDNO. 1，所述骨架載體為PFGC5941載體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素 P450基因的RNA干擾載體，其特征在于： 所述正義鏈插入在酶切位點(diǎn)Xhol和Ncol之間，反義鏈插入在酶切位點(diǎn)Xball和BamHI之 間。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素 P450基因的RNA干擾載體的構(gòu)建方法，包 括如下步驟： 1) 細(xì)胞色素 P450基因目的片段與質(zhì)粒的連接 提取桔小實(shí)蠅總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，以SEQIDNO. 2和SEQIDNO. 3為 引物對(duì)細(xì)胞色素 P450基因的正向目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以SEQIDNO. 4和SEQIDNO. 5為 引物對(duì)細(xì)胞色素 P450基因的反向目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，目的片段約為 600bp，回收PCR產(chǎn)物，與載體pMD-19連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α得到重組質(zhì)粒PMD-19-P1F1 和PMD-19-P2F2,進(jìn)行序列驗(yàn)證，測(cè)序正確的目的片段即可用于RNA干擾載體的構(gòu)建；所述 SEQID NO. 2?5的序列如下： SEQIDNO. 2 :5' -GCCATGGATAGTCTGAACGAACCGAA-3' ； SEQIDNO. 3 :5' -CCATGGGATAGATTTCGGGATCAC-3' ； SEQIDNO. 4 :5' -GCTCTAGAGCATAGTCTGAACGAACCGAA-3' ； SEQIDNO. 5 :5' -CGGGATCCGATAGATTTCGGGATCAC-3' ； 2) 細(xì)胞色素 P450基因的RNA干擾載體的構(gòu)建 將上述測(cè)序正確的細(xì)胞色素 P450基因正向目的片段質(zhì)粒pMD-19-PlFl與載體 PFGC5941分別用Xhol和Ncol雙酶切，將pMD-19-PlFl與載體PFGC5941的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連 接得到插入正向目的片段的重組質(zhì)粒PFGC5941-P1F1 ;將PFGC5941-P1F1和細(xì)胞色素 P450 基因反向目的片段質(zhì)粒PMD-19-P2F2分別用Xball和BamHI雙酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接， 即可得到插入正、反義鏈的RNA干擾載體PFGC5941-P1F1/P2F2,經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)、核苷酸序 列分析，目的片段序列正確的干擾載體可用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。
4. 權(quán)利要求1-2任一所述的桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素 P450基因的RNA干擾載體在轉(zhuǎn)基因植 物中的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)基因植物為柑橘屬植物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，為將權(quán)利要求1-2任一所述的桔小實(shí)蠅細(xì)胞色素 P450 基因的RNA干擾載體轉(zhuǎn)化有關(guān)受體植物，使之對(duì)桔小實(shí)蠅產(chǎn)生抗性，所述受體植物為柑桔。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)化的方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，所述農(nóng)桿菌為農(nóng)桿菌菌株EHA105。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104059931SQ201410315113
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年7月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月3日
【發(fā)明者】冉春, 岳建蘇, 劉浩強(qiáng), 叢林, 李鴻筠 申請(qǐng)人:西南大學(xué)柑桔研究所