產(chǎn)石杉堿甲的激素自養(yǎng)型蛇足石杉離體葉狀體克隆系的制作方法
【專利摘要】一種產(chǎn)石杉堿甲的激素自養(yǎng)型蛇足石杉離體葉狀體克隆系，步驟為：（1.1）材料；（1.2）外植體取材與無菌材料的制得；（1.3）接種到準(zhǔn)備好的葉狀體分化啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)；（1.4）將誘導(dǎo)增殖的葉狀體組織分割成小塊，轉(zhuǎn)接到葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基上定向培養(yǎng)；（1.5）產(chǎn)石杉堿甲的激素自養(yǎng)型蛇足石杉離體葉狀體克隆系的繼代。本發(fā)明系植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】。直接收獲本發(fā)明的葉狀體制茶或作茶的添加物等，可開發(fā)新型抗衰老增記憶的保健品；也可由葉狀體提取藥用成分石杉堿甲，都將產(chǎn)生極為重大的經(jīng)濟價值和社會效益。
【專利說明】產(chǎn)石杉堿甲的激素自養(yǎng)型蛇足石杉離體葉狀體克隆系
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及創(chuàng)造藥物成分石杉堿甲的植物性資源及其生物技術(shù)，尤其涉及一種產(chǎn)石杉堿甲的激素自養(yǎng)型蛇足石杉離體葉狀體克隆系。
【背景技術(shù)】
[0002]蛇足石杉Huperziaserrata (Thunb.ex Murray) Trev.,又名千層塔、蛇足石松、蛇足草等，為石杉科石杉屬蕨類植物，全草入藥。自1972年國內(nèi)首次報道該植物中的生物堿-石杉堿甲(hupenine A, Hup-A)具有橫紋肌松馳作用，以后深入研究發(fā)現(xiàn)該生物堿是一種強效、可逆和高選擇性乙酰膽堿酯酶抑制劑。在低劑量Hup-A下對乙酰膽堿酯酶(AchE)有強大的抑制作用，使分布區(qū)內(nèi)神經(jīng)突觸間隙的乙酰膽堿(Ach)含量明顯升高，從而增強神經(jīng)元興奮傳導(dǎo)，強化學(xué)習(xí)與記憶腦區(qū)的興奮作用，起到提高認知功能、增強記憶保持和促進記憶再現(xiàn)的作用。石杉堿甲Hup-A是目前國內(nèi)最為成功的治療阿爾茨海默病(老年性癡呆癥)的藥物。石杉堿甲Hup-A成分主要來源于天然蛇足石杉全草，由于石杉堿甲的特殊療效，國內(nèi)外學(xué)者對它的全合成、衍生物及類似物的合成作了大量的工作，亦因Hup-A特殊的分子結(jié)構(gòu)，人工合成費時費力，代價高，至今幾乎沒有得到與天然Hup-A活性相同的衍生物和類似物，因此人工合成的Hup-A及其類似物離商品化生產(chǎn)還有較長距離，隨著老年化社會到來，阿爾茨海默病(老年性癡呆癥)已成為人類的第四大病魔，直接導(dǎo)致國際市場上Hup-A的供應(yīng)缺口越來越大，自然千層塔資源匱乏凸顯。
[0003]由于蛇足石杉等石杉科植物生長于深山密林，生境條件特殊，很難解決石杉科植物大面積的人工栽培。采取石杉科植物離體組織培養(yǎng)可能解決石杉屬植物源Hup-A資源。但植物組織培養(yǎng)中，一般都要加入外源植物生長物質(zhì)，培養(yǎng)物才能增殖生長，而外源植物生長物質(zhì)在培養(yǎng)物中的殘存則影響應(yīng)用。因此，大規(guī)模工廠化生產(chǎn)石杉堿甲時，產(chǎn)石杉堿甲的激素自養(yǎng)型蛇足石杉離體葉狀體克隆系是生產(chǎn)開發(fā)應(yīng)用所期望的資源，同時因不需添加外源植物生長物質(zhì)還具有降低生產(chǎn)成本的優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)石杉堿甲的激素自養(yǎng)型蛇足石杉離體葉狀體克隆系，解決了利用蛇足石杉離體培養(yǎng)物提取的石杉堿甲中外源生長物質(zhì)殘害問題。
[0005]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，其方法步驟為:
(1.1)材料
廬山野生蛇足石杉serrata (Thunb.ex Murray) Trev.)當(dāng)年抽生新枝； (1.2)外植體取材與無菌材料的制得
選擇健壯無病蟲害野生蛇足石杉植株，取當(dāng)年抽生約3 cm長的新枝，用自來水洗去枝葉上的灰塵后，再用洗衣粉液浸泡6~10 min，然后用軟毛筆刷洗枝葉，自來水細流水中漂洗干凈，濾紙吸干水滴后裝入無菌容器中進行表面滅菌處理；轉(zhuǎn)至超凈工作臺上，再以質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%的乙醇消毒0.5 min min，無菌水洗凈，吸干水后，先以質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.5%H202消毒5~9 min,再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%~0.5%HgCl2加0.05ml吐溫80浸泡消毒材料6~10 min,傾去藥液后，用無菌水沖洗6~8次，然后在無菌條件下，將蛇足石杉新枝分割切成長度為
0.5~Icm左右的莖小段；
(1.3)接種到準(zhǔn)備好的葉狀體分化啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)
外植體接種在葉狀體分化啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)至切口處出現(xiàn)綠色小凸點，繼續(xù)在葉狀體分化啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)10~15天，綠色小凸點發(fā)育成可辨的葉狀體組織，此時的葉狀體組織迅速增殖；葉狀體分化啟動培養(yǎng)基:1/2(6,7-V) + NAA 0.1~1.0 mg/L，蔗糖用量20~30g/L ；
(1.4)將誘導(dǎo)增殖的葉狀體組織分割成小塊，轉(zhuǎn)接到葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基上定向培養(yǎng)，葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基:1/4 MS或1/2MS中添加2(T30g/L蔗糖，培養(yǎng)基的pH值5.8~6.0，并在118~120°C高溫高壓下滅菌25min ;提供培養(yǎng)環(huán)境:恒溫(23±2) V，相對濕度60%~70%，光照強度為1000~15001x，日照時長12~14 h (小時)/d (天)；
(1.5)產(chǎn)石杉堿甲的激素自養(yǎng)型蛇足石杉離體葉狀體克隆系的繼代；一小部分葉狀體切割作繼代小塊，接種到繼代增殖培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，以后每40~50天轉(zhuǎn)代一次，建成葉狀體無性繁殖系；另一大部分葉狀體作收獲提取石杉堿甲。
[0006]步驟(1.5)的培養(yǎng)條件如下:
(2.1)培養(yǎng)參數(shù):恒溫23±2°C， 相對濕度60%~70%，光照強度為1000~15001x，日照時長12~14h/d (小時/天)；
(2.2)技術(shù)參數(shù):轉(zhuǎn)代周期40~50d (天)，葉狀體生產(chǎn)收獲周期為60~80d (天)。
[0007]建立的激素自養(yǎng)型離體葉狀體克隆系，每代葉狀體生物量鮮重比接種量增加15~25倍，該葉狀體克隆系每個生產(chǎn)周期每升培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物能生產(chǎn)積累植物源的石杉喊甲78~110M-go
[0008]以上步驟(1.1)、(1.2),(1.3)為本發(fā)明人另一專利“一種產(chǎn)石杉堿甲的離體蛇足石杉葉狀體誘導(dǎo)和增殖的培養(yǎng)方法”專利號為2012100054996的公開技術(shù)方案，本發(fā)明的發(fā)明創(chuàng)造點為步驟(1.4)和(1.5)。
[0009]本發(fā)明系植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】。利用蛇足石杉莖段離體培養(yǎng)獲得的葉狀體，在無激素的培養(yǎng)基中已連續(xù)定向繼代20余月，每代鮮重或干重增長25倍左右，高效液相分析檢測激素自養(yǎng)型葉狀體提取物，表明其中含有石杉堿甲。該克隆系比添加外源生長物質(zhì)培養(yǎng)的葉狀體生產(chǎn)率高，葉狀體培養(yǎng)物I個生產(chǎn)周期的石杉堿甲生產(chǎn)量可達78~llOPg/L。鑒于激素自養(yǎng)型離體葉狀體繁殖中無外源植物生長物質(zhì)污染，又離體葉狀體中石杉堿甲含量相對低，依據(jù)“低劑量石杉堿甲(Hup-A)下對乙酰膽堿酯酶(Ach E)有強大的抑制作用”的藥用有效特點，利用這項發(fā)明擴大規(guī)模離體培養(yǎng)葉狀體，直接收獲加工制茶或作茶的添加物等，可開發(fā)新型抗衰老增記憶的保健品；也可由葉狀體提取藥用成分石杉堿甲，都將產(chǎn)生極為重大的經(jīng)濟價值和社會效益。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為本發(fā)明蛇足石杉離體培養(yǎng)激素自養(yǎng)型葉狀體培養(yǎng)物與添加外源生長素培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物對比示意圖；
在圖中，左:激素自養(yǎng)形葉狀體生長狀況；右:添加外源生長素IAA的葉狀體生長狀況；
圖2為本發(fā)明離體培養(yǎng)的葉狀體提取物與石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相分析圖。
【具體實施方式】
[0011]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細說明。
[0012]實施例1:
< 一 >、選擇健壯無病蟲害野生蛇足石杉植株，取當(dāng)年抽生約3 Cm長的新枝。
[0013]〈二〉、用自來水洗去枝葉上的灰塵后，再用洗衣粉液浸泡6~10 min，然后用軟毛筆刷洗枝葉，自來水細流水中漂洗干凈，濾紙吸干水滴后裝入無菌容器中進行表面滅菌處理；轉(zhuǎn)至超凈工作臺上，再以75%的乙醇消毒0.5 mirTl min，無菌水洗凈，吸干水后，先以
4.5%H202消毒5~9 min,再用0.1%~0.5%HgCl2加I滴吐溫80浸泡消毒材料6~10 min,傾去藥液后，用無菌水沖洗6~8次。然后在無菌條件下，將蛇足石杉新枝分割切成長度為
0.5~Icm左右的莖小段，接種到準(zhǔn)備好的葉狀體分化啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)。[0014]<三 >、培養(yǎng)50天左右，莖段切口處出現(xiàn)綠色小凸點，繼續(xù)在葉狀體分化啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)10~20天，綠色小凸點發(fā)育成可辨的葉狀體組織，并且這個時期的葉狀體組織迅速增殖，生長葉狀體逐漸包圍了外植體，長成一團3 cm直徑的葉狀體組織塊。
[0015]外植體接種后培養(yǎng)90天左右，將長出的葉狀體組織分割成小塊，轉(zhuǎn)接到葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基上；
<四 >、分割繼代，葉狀體繼代培養(yǎng)，取部分葉狀體切割成鮮重約0.05至0.2g的小塊，接種到繼代增殖培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，以后每40~50天轉(zhuǎn)代一次；其余葉狀體60~80天為收獲周期，繁殖的葉狀體干或鮮重均比接種量增加15~25倍，收獲的葉狀體采取高效液相檢測石杉堿甲含量。
[0016]〈五〉培養(yǎng)條件
1.培養(yǎng)基配方
對培養(yǎng)基中添加植物生長物質(zhì)進行多次試驗的基礎(chǔ)上得到。本發(fā)明適用的基本培養(yǎng)基
(1)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基:1/2(6，7-V) + NAA 0.1~1.0 mg/L，蔗糖用量20~30g/L ；
(2)葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基:1/4MS或1/2MS中添加2(T30g/L蔗糖。培養(yǎng)基的pH值5.8~6.0,并在118~120°C高溫高壓下滅菌25min。
[0017]2.培養(yǎng)環(huán)境
提供培養(yǎng)環(huán)境:恒溫(23±2) V，相對濕度60%~70%，光照強度為1000~15001x左右，日照時長12~14 h (小時)/d (天)。
[0018]實施例2:
選擇健壯無病蟲害野生蛇足石杉植株，取當(dāng)年抽生約3 cm長的新枝，對外植體清洗消毒后在無菌條件下，將蛇足石杉新枝分割切成長度為0.5~Icm左右的莖小段，接種到準(zhǔn)備好的葉狀體分化啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)。(I)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基:1/2出，7-V) + NAA
0.1~1.0 mg/L (單位下同);(2)葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基:1/4MS或1/2MS中添加20~30g/L蔗糖+ΝΑΑ0.5其它與實施例1相同。
[0019]實施例3:
(I)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基:1/2 (6，7-V) + NAA 0.1~1.0 mg/L，蔗糖用量20~30g/L ； (2)葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基:1/4 MS或1/2MS中添加2(T30g/L蔗糖+NAA1.0，其它與實施例1相同。
[0020]實施例4:
(I)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基:1/2 (6，7-V) + NAA 0.1~1.0 mg/L，蔗糖用量20~30g/L ； (2)葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基:1/4 MS或1/2MS中添加2(T30g/L蔗糖+NAA1.5，其它與實施例1相同。
[0021]實施例5:
(I)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基:1/2 (6，7-V) + NAA 0.1~1.0 mg/L，蔗糖用量20~30g/L ； (2)葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基:1/4 MS或1/2MS中添加2(T30g/L蔗糖+NAA2.0，其它與實施例1相同。
[0022]實施例6:
(I)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基:1/2 (6，7-V) + NAA 0.1~1.0 mg/L，蔗糖用量20~30g/L ；⑵葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基:1/4 MS或1/2MS中添加2(T30g/L蔗糖+ΙΑΑ0.1，其它與實施例1相同。
[0023]實施例7:
(I)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基:1/2 (6，7-V) + NAA 0.1~1.0 mg/L，蔗糖用量20~30g/L ；⑵葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基:1/4 MS或1/2MS中添加2(T30g/L蔗糖+ΙΑΑ0.5，其它與實施例1相同。
[0024]實施例8:
(I)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基:1/2 (6，7-V) + NAA 0.1~1.0 mg/L，蔗糖用量20~30g/L ；⑵葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基:1/4 MS或1/2MS中添加2(T30g/L蔗糖+IAA1.0，其它與實施例1相同。
[0025]實施例9:
(I)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基:1/2 (6，7-V) + NAA 0.1~1.0 mg/L，蔗糖用量20~30g/L ；⑵葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基:1/4 MS或1/2MS中添加2(T30g/L蔗糖+IAA2.0，其它與實施例1相同。
[0026]實施例10:
(I)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基:1/2 (6，7-V) + NAA 0.1~1.0 mg/L,蔗糖用量20~30g/L ； (2)葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基1/4 MS或1/2MS中添加2(T30g/L蔗糖+6-BA0.5+IAA0.5，其它與實施例1相同。
[0027]實施例11:
(I)葉狀體分化啟動培養(yǎng)基:1/2 (6，7-V) + NAA 0.1~1.0 mg/L，蔗糖用量20~30g/L ； (2)葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基:1/4 MS或1/2MS中添加20~30g/L蔗糖+6-BA1.0+ΙΑΑ0.5，其它與實施例1相同。
[0028]實施例12:
(I)葉狀體分 化啟動培養(yǎng)基:1/2 (6，7-V) + NAA 0.1~1.0 mg/L，蔗糖用量20~30g/L ； (2)葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基:1/4 MS或1/2MS中添加2(T30g/L蔗糖+6-BA1.5+ΙΑΑ0.5，其它與實施例1相同。
[0029](四)實驗結(jié)果如表1:在建立的蛇足石杉離體葉狀體基礎(chǔ)上，繼續(xù)深入研究了無外源植物生長物質(zhì)與添加外源植物生長物質(zhì)組合處理的繼代培養(yǎng)葉狀體效果，定向獲得了產(chǎn)石杉堿甲的激素自養(yǎng)型葉狀體克隆系，無外源生長物質(zhì)與添加外源生長物質(zhì)兩者對葉狀體生物量增長有明顯的差異。部分試驗結(jié)果見表1。
[0030]表1外源激素對蛇足石杉葉狀體繼代增殖與累積石杉堿甲的影響
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)石杉堿甲的激素自養(yǎng)型蛇足石杉離體葉狀體克隆系，前期步驟為: (1.1)材料 廬山野生蛇足石杉serrata (Thunb.ex Murray) Trev.)當(dāng)年抽生新枝； (1.2)外植體取材與無菌材料的制得； (1.3)接種到準(zhǔn)備好的葉狀體分化啟動培養(yǎng)基上培養(yǎng)； 其特征在于:(1.4)將誘導(dǎo)增殖的葉狀體組織分割成小塊，轉(zhuǎn)接到葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基上定向培養(yǎng)，葉狀體繼代增殖培養(yǎng)基:1/4 MS或1/2MS中添加2(T30g/L蔗糖，培養(yǎng)基的pH值5.8~6.0，并在118~120°C高溫高壓下滅菌25min ;提供培養(yǎng)環(huán)境:恒溫(23±2)°C，相對濕度60%~70%，光照強度為1000~15001x，日照時長12~14 h (小時)/d (天)；(1.5)產(chǎn)石杉堿甲的激素自養(yǎng)型蛇足石杉離體葉狀體克隆系的繼代；一小部分葉狀體切割作繼代小塊，接種到繼代增殖培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，以后每40~50天轉(zhuǎn)代一次，建成葉狀體激素自養(yǎng)型克隆系；另一大部分葉狀體作收獲提取石杉堿甲。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)石杉堿甲的激素自養(yǎng)型蛇足石杉離體葉狀體克隆系，其特征在于:步驟(1.5)的培養(yǎng)條件如下: (2.1)培養(yǎng)參數(shù):恒溫23±2°C，相對濕度60%~70%，光照強度為1000~15001x，日照時長12~14h/d (小時/天)； (2.2)技術(shù)參數(shù):轉(zhuǎn)代周期40~50d (天)，葉狀體生產(chǎn)收獲周期為60~80d (天)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)石杉堿甲的激素自養(yǎng)型蛇足石杉離體葉狀體克隆系，其特征在于:建立的激素自養(yǎng)型離體葉狀體克隆系，每代葉狀體生物量鮮重比接種量增加15~25倍，該葉狀體克隆系每個生產(chǎn)周期每升培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物能生產(chǎn)積累植物源的石杉堿甲78 ~11OMg。
【文檔編號】A01H4/00GK103975857SQ201410225801
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】涂藝聲, 徐賢柱, 楊萍, 蔡險峰, 陳曼, 吉枝單 申請人:江西師范大學(xué)