玉米cipk21基因在提高植物抗逆性中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及玉米CIPK21基因在提高植物抗逆性中的應(yīng)用，所述玉米CIPK21基因的核苷酸序列如Seq?ID?No.1所示。將含有玉米CIPK21基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，然后用蘸花浸染的方法轉(zhuǎn)化植物，篩選轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的ZmCIPK21基因通過(guò)調(diào)控下游相關(guān)基因參與植物耐鹽堿過(guò)程，對(duì)于培育高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物具有重要意義。
【專利說(shuō)明】玉米ClPK21基因在提高植物抗逆性中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及玉米CIPK21基因在提高植物抗逆性中 的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 鹽堿脅迫是影響農(nóng)作物生產(chǎn)的重要因素。植物在含有高濃度鹽離子的土壤中，通 過(guò)水分運(yùn)輸，會(huì)導(dǎo)致植物組織中離子積累。過(guò)多的可溶性離子包括鈉離子、鉀離子等會(huì)影響 植物正常發(fā)育。另外，高濃度的鹽導(dǎo)致的離子脅迫還會(huì)引起滲透脅迫，進(jìn)而嚴(yán)重影響植物產(chǎn) 量。植物可以通過(guò)多種方式平衡鹽離子吸收，包括限制攝入、增加鈉離子排泄、將鹽離子區(qū) 室化到液泡，以及控制鈉離子從根到地上部分的長(zhǎng)途運(yùn)輸，從而減弱地上部分細(xì)胞質(zhì)中鈉 含量。
[0003] 研究表明，在非生物逆境脅迫信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中，鈣離子是最重要的第二信使之一。植 物受到干旱、冷害、鹽脅迫時(shí)，胞內(nèi)Ca 2+濃度會(huì)迅速升高，并能夠調(diào)控許多脅迫誘導(dǎo)基因的 表達(dá)。因此，現(xiàn)在普遍認(rèn)為Ca2+作為第二信使將脅迫信號(hào)傳輸?shù)秸{(diào)控通路的下游，Ca 2+信 使的傳遞是通過(guò)鈣結(jié)合蛋白介導(dǎo)的。目前，在植物中已鑒定出許多Ca2+結(jié)合蛋白（calcium sensors)。主要有三類：興調(diào)素（calmodulin, CaM)及興調(diào)素相關(guān)蛋白（CaM-related proteins) ;|丐依賴蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases, CDPK);類似于動(dòng)物?丐 調(diào)憐酸酶B亞基的蛋白（calcineurinB-likeproteins，CBLs)。Ca 2+結(jié)合蛋白-CBL，是最 近幾年才發(fā)現(xiàn)的，目前只發(fā)現(xiàn)存在于高等植物中。與CaM-樣，它只含有Ca2+結(jié)合域，不 含有激酶區(qū)。CBL與CaM不同的是，它調(diào)控一類特殊的蛋白激酶，稱為CBL互作蛋白激酶 (CBL-interacting protein kinases, CIPKs)。CIPK 在 N 端含有絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶 區(qū)，并通過(guò)其特有的C末端區(qū)域（C-terminal region)與CBL互作。CBL和CIPK只存在于 植物中，在模式植物擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)大部分CIPK基因受到非生物脅迫誘導(dǎo)，它們可能 在鹽堿、干旱、冷脅迫中起重要作用。
[0004] 由于CIPK基因是近幾年才發(fā)現(xiàn)的，因此對(duì)于CIPK基因的研究目前還十分有限。目 前為止，通過(guò)基因組數(shù)據(jù)的分析已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在擬南芥上有10個(gè)CBL基因，26個(gè)CIPK基因，在 水稻上有10個(gè)CBL基因，30個(gè)CIPK基因，但僅對(duì)個(gè)別基因的功能進(jìn)行研究，對(duì)于不同CBL、 CIPK基因所調(diào)控的不同信號(hào)途徑也僅限于初步了解。美國(guó)加州大學(xué)朱健康教授研究組利 用在鹽脅迫下篩選擬南芥突變體的方法，鑒定了幾個(gè)S0S(Salt Overly Sensitive)基因，其 中S0S2是一個(gè)CIPK基因（也稱為AtCIPK24)，而S0S 3為一個(gè)CBL基因（也稱為AtCBL4)。 S〇S2和sos3突變體對(duì)鹽脅迫極為敏感，說(shuō)明sos2和sos3基因在擬南芥對(duì)鹽脅迫的抗性中 起重要作用。當(dāng)植物受到高鹽脅迫時(shí)，引起胞內(nèi)Ca 2+濃度升高，S0S3首先感受到Ca2+所傳導(dǎo) 的脅迫信號(hào)，然后特異性地激活S0S2, S0S2進(jìn)一步作用于Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)子（即S0S1)，S0S1 將胞內(nèi)多余的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，達(dá)到抵抗Na+對(duì)植物細(xì)胞毒害作用。這一調(diào)控通路是在目前 的抗逆研究領(lǐng)域中了解的比較清楚的調(diào)控途徑。美國(guó)Luan Sheng教授研究組在1999年克 隆了擬南芥AtCBLl基因，并通過(guò)酵母雙雜交方法，克隆了與AtCBLl互作的AtCIPKl基因。 2003年，他們對(duì)擬南芥的CIPK家族成員之一，AtCIPK3基因的功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)CIPK3 基因在3-7天的幼苗期有較高表達(dá)，在成株期表達(dá)量很低。有趣的是，AtCIPK3基因在ΑΒΑ、 冷害、高鹽、干旱、機(jī)械傷害等誘導(dǎo)下高水平的表達(dá)。但是AtCIPK3的突變體在各種逆境的 脅迫下，并沒(méi)有明顯的表型變化。然而，在AtCIPK3的突變體上，對(duì)許多明顯受ΑΒΑ和各種 脅迫調(diào)控的基因表達(dá)的研究中卻發(fā)現(xiàn)，一些信號(hào)調(diào)控途徑已經(jīng)發(fā)生改變，但是干旱誘導(dǎo)的 基因表達(dá)并沒(méi)有受到影響，說(shuō)明AtCIPK3是有選擇地來(lái)調(diào)控植物在ΑΒΑ和各種脅迫下的調(diào) 控途徑。對(duì)于AtCIPK3繼續(xù)研究所得的另一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是，AtCIPK3可能是在各種脅迫下 依賴ΑΒΑ調(diào)控途徑和不依賴ΑΒΑ調(diào)控途徑調(diào)節(jié)的關(guān)鍵樞紐（cross-talk node)。Chikano等 (2001)研究發(fā)現(xiàn)另外一個(gè)擬南芥CIPK家族成員之一 AtSR2(即AtCIPK14)參與到糖的調(diào)控 途徑中，AtCIPK14的突變體對(duì)葡萄糖（Glc)非常敏感，但是對(duì)各種滲透脅迫卻沒(méi)有任何反 應(yīng)，暗示AtCIPK14可能特異性地參與糖的調(diào)控體系中。
[0005] 因此，目前對(duì)于植物CIPK基因的研究逐漸成為近年來(lái)的熱點(diǎn)領(lǐng)域，目前，這方面 的研究工作主要基于模式植物擬南芥進(jìn)行的。對(duì)于重要作物（如水稻、玉米、小麥等）的此 類基因的研究還較少，特別是有關(guān)玉米CIPK基因的功能研究尚未見(jiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供玉米CIPK21基因在提高植物抗逆性中的應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的玉米CIPK21基因在提高植物抗逆性中的應(yīng) 用，其中玉米CIPK21基因的核苷酸序列為 ：
[0008] i) Seq ID No. 1所示的核苷酸序列；或
[0009] ii) Seq ID No. 1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且 表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或
[0010] iii)在嚴(yán)格條件下與Seq ID No. 1所示序列雜交的核苷酸序列；
[0011] 所述嚴(yán)格條件為在含0. 1%SDS的0. 1XSSPE或含0. 1%SDS的0. 1XSSC溶液中， 在65 °C下雜交，并用該溶液洗膜。
[0012] 前述的應(yīng)用，優(yōu)選將含有玉米CIPK21基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，然后 用蘸花浸染的方法轉(zhuǎn)化植物，篩選轉(zhuǎn)基因植株。所述植物包括但不限于擬南芥等。
[0013] 優(yōu)選地，將玉米CIPK21基因與順式作用元件連接，克隆至表達(dá)載體（例如，植物雙 元表達(dá)載體）上，并轉(zhuǎn)化植株。
[0014] 本發(fā)明中涉及的抗逆性是指對(duì)鹽堿脅迫的抗性。
[0015] 本發(fā)明還提供用于擴(kuò)增玉米CIPK21基因的特異性PCR引物對(duì)，包括正向引物 F5' -ATGCGGATGGGCAAGTACGAGATG-3' 和反向引物 R5' -TTAAAAGCTACTATTATATCTACC-3'。
[0016] 本發(fā)明還提供能夠高效表達(dá)玉米中具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（ZmCIPK21)的 轉(zhuǎn)基因植株，該植株表現(xiàn)為對(duì)鹽脅迫的抗性。
[0017] 轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建方法具體如下：
[0018] 1、依據(jù)目的基因的序列，設(shè)計(jì)引物，從玉米cDNA擴(kuò)增ZmCIPK21基因序列，與 Gateway入門載體pGWC-T連接，對(duì)pGWC-ZmCIPK進(jìn)行測(cè)序確定所獲得的序列與目的片段一 致。
[0019] 2、以pGWC-ZmCIPK為入門載體，pEarlyGatelOO為表達(dá)載體，進(jìn)行LR反應(yīng)，然后轉(zhuǎn) 化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組克隆，經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)后，對(duì)單克隆進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序正確的克 隆提取質(zhì)粒，將其命名為pEarlyGatel00-ZmCIPK21。
[0020] 3、將制備的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌株。
[0021] 4、轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得純合的轉(zhuǎn)化陽(yáng)性苗株系。
[0022] 5、將轉(zhuǎn)基因株系分別在含有0福、125禮、15〇1111似(：1的]^固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得 耐鹽喊的轉(zhuǎn)基因材料。
[0023] 本發(fā)明提供的玉米CIPK21基因（ZmCIPK21)，其cDNA全長(zhǎng)為1347個(gè)堿基，含一個(gè) 完整的開(kāi)放閱讀框。該基因中的激酶結(jié)構(gòu)域?yàn)樽缘?11至第567bp，共256個(gè)堿基。本發(fā)明 的ZmCIPK21基因通過(guò)調(diào)控下游相關(guān)基因參與植物耐鹽堿過(guò)程，對(duì)于培育高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因農(nóng) 作物具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中重組表達(dá)載體PEarlyGatel00-ZmCIPK21的構(gòu)建流程示 意圖。
[0025] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中ZmCIPK21轉(zhuǎn)基因擬南芥株系目的基因的PCR檢測(cè)；其 中，+ :陽(yáng)性對(duì)照（以ZmCIPK21重組表達(dá)載體為PCR模板）:陰性對(duì)照（以野生型擬南芥 DNA為PCR模板）；1、2、5、6、7、8、9、11、12、13、19 :ZmCIPK21不同轉(zhuǎn)基因株系的擴(kuò)增結(jié)果。
[0026] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例4中轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型植株在含有不同濃度NaCl的培 養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況比較。轉(zhuǎn)35S: :ZmCIPK21基因擬南芥種子點(diǎn)播在含有150mMNaCl的MS培 養(yǎng)基上，4°C春化3d后，置于22°C培養(yǎng)，10d后觀察生長(zhǎng)狀況轉(zhuǎn)基因株系在150mM NaCl的平 板上生長(zhǎng)明顯受到抑制，轉(zhuǎn)基因株系0E-1、0E-5、0E-12長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于WT，NaCl對(duì)幼苗根長(zhǎng) 也有明顯抑制作用。
[0027] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例5中轉(zhuǎn)35S: :ZmCIPK21擬南芥能夠互補(bǔ)擬南芥cipkl突變體 對(duì)鹽敏感表型。轉(zhuǎn)35S: :ZmCIPK21基因擬南芥種子點(diǎn)播在含有NaCl的MS培養(yǎng)基上，4°C春 化3d后，置于22°C培養(yǎng)，10d后觀察生長(zhǎng)狀況轉(zhuǎn)基因株系在125mM和150mM NaCl的平板上 生長(zhǎng)明顯受到抑制，互補(bǔ)株系（COM)長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于cipkl突變體。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書建議的條件。
[0029] 實(shí)施例1含有ZmCIPK21蛋白激酶基因的表達(dá)載體的構(gòu)建
[0030] 1、依據(jù)已知目的基因的序列，設(shè)計(jì)引物（正向引物 F5' -ATGCGGATGGGCAAGTACGAGATG-3' 和反向引物 R5' -TTAAAAGCTACTATTATATCTACC-3'），從 玉米cDNA擴(kuò)增ZmCIPK21基因序列，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。
[0031] 2、將回收的片段與pGWC-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽(yáng)性單克 隆，進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)過(guò)序列比對(duì)，獲得與原序列一致的單克隆，搖菌并提取該單克隆質(zhì)粒，將其 命名為 pGWC-ZmCIPK21。
[0032] 3、以pGWC_ZmCIPK21為入門載體，以pEarlyGatelOO質(zhì)粒為表達(dá)載體，經(jīng)過(guò)LR反 應(yīng)，然后轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組克隆，經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)后，對(duì)單克隆進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè) 序正確的克隆提取質(zhì)粒，將其命名為pEarlyGatel00-ZmCIPK21。
[0033] 重組表達(dá)載體PEarlyGatel00-ZmCIPK21的構(gòu)建流程示意圖如圖1所示。
[0034] 實(shí)施例2含有ZmCIPK21蛋白激酶基因的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的篩選
[0035] 1、將構(gòu)建好的ZmCIPK12重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。
[0036] 2、用蘸花浸染（floral dipping)的方法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。
[0037] 3、將轉(zhuǎn)化后得到的?；代種子春化3天，然后直接播種到營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)，正常生長(zhǎng) 約兩周后，用0. 5%。的PPT(phosphinothricin)噴灑L代擬南芥篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0038] 4、由于所用的轉(zhuǎn)化超表達(dá)載體pEarlyGatelOO帶有抗PPT (phosphinothricin)的 Bar基因，它在轉(zhuǎn)化時(shí)能隨目的基因一起轉(zhuǎn)入植物體，所以在噴施PPT(phosphinothricin) 后大部分未轉(zhuǎn)化植株死亡，而轉(zhuǎn)化植株仍然能夠正常生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)化植株按照不同株系分別收 獲!\代種子。
[0039] 5、收獲各轉(zhuǎn)基因株系T2代種子后，用0. 5%的NaCIO對(duì)種子進(jìn)行消毒處理。然后 點(diǎn)種于含有0.5%。的PPT (phosphinothricin)的MS培養(yǎng)基平板中（每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系需要約 45粒種子），以野生型擬南芥作為陰性對(duì)照。
[0040] 6、春化3天后置于22°C光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，一周后觀察幼苗生長(zhǎng)情況。野 生型在含〇· 5 %。PPT (phosphinothricin)的MS培養(yǎng)基中無(wú)法存活；T2代雜合體轉(zhuǎn) 基因株系由于在產(chǎn)生子代的過(guò)程中會(huì)發(fā)生基因分離與自由組合，因此會(huì)有一部分無(wú) PPT (phosphinothricin)抗性種子出現(xiàn)；只有Τ2代為純合體轉(zhuǎn)基因株系的種子能全部在含 卡那霉素的MS培養(yǎng)基中存活。
[0041] 實(shí)施例3含有ZmCIPK21轉(zhuǎn)基因植株的核酸檢測(cè)
[0042] 1、以提取的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株的總DNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽(yáng)性植株能夠 擴(kuò)增出1. 35kb的條帶，而假陽(yáng)性植株則無(wú) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。野生型植株不能擴(kuò)增出目的條帶。 (圖2)
[0043] 2、收獲各轉(zhuǎn)基因株系T2代種子后，用0. 5%的NaCIO對(duì)種子進(jìn)行消毒處理。然后 點(diǎn)種于含有0.5%。PPT (phosphinothricin)的MS培養(yǎng)基平板中（每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系需要約 45粒種子），以野生型擬南芥作為陰性對(duì)照。
[0044] 3、春化3天后置于22°C光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，一周后觀察幼苗生長(zhǎng)情況。野生型在 含 0.5%。（v/v)PPT(phosphinothricin)的 MS 培養(yǎng)基中無(wú)法存活。
[0045] 4、T2代雜合體轉(zhuǎn)基因株系由于在產(chǎn)生子代的過(guò)程中會(huì)發(fā)生基因分離與自由組合， 因此會(huì)有一部分無(wú)卡那霉素抗性的種子出現(xiàn)；只有1~ 2代為純合體轉(zhuǎn)基因株系的種子能全部 在含卡那霉素的MS培養(yǎng)基中存活。
[0046] 實(shí)施例4含有ZmCIPK21轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株抗逆性比較
[0047] 將ZmCIPK21轉(zhuǎn)基因擬南芥株系分別點(diǎn)播在含有0mM、125mM、150mMNaCl的MS平板 上，4°C春化3天后，置于22°C，16小時(shí)光/8小時(shí)黑暗的培養(yǎng)箱中，5天后觀察表型并進(jìn)行分 析。從圖3所示結(jié)果中可以看出，相對(duì)野生型而言，野生型在高鹽脅迫下葉子萎蔫發(fā)黃程度 嚴(yán)重，而兩者在正常MS培養(yǎng)基中表型則無(wú)明顯差別。
[0048] 實(shí)施例5用ZmCIPK21轉(zhuǎn)化擬南芥cipkl高鹽敏感突變體可提高突變體耐鹽性
[0049] 1、將構(gòu)建好的ZmCIPK12重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，用蘸花浸染的方法轉(zhuǎn) 化擬南芥對(duì)高鹽敏感的cipkl突變體。
[0050] 2、將轉(zhuǎn)化后得到的?；代種子春化3天，然后直接播種到營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)，正常生長(zhǎng) 約兩周后，用0. 5%。的PPT(phosphinothricin)噴灑L代擬南芥篩選轉(zhuǎn)化植株。能夠存活 的植株即為代植株。
[0051] 3、按照不同株系分別收獲種子。用ΡΡΤ篩選，統(tǒng)計(jì)存活株數(shù)，取符合3:1分離的株 系，即為單拷貝的1~ 2代植株。
[0052] 4、將存活的植株移到小花盆中，每個(gè)株系移12株，繼續(xù)按照單株收獲得到^種 子，并在含有ΡΡΤ的MS培養(yǎng)基上篩選，如果能夠完全存活則為純合體株系，收獲種子則為轉(zhuǎn) 基因互補(bǔ)株系（COM)。
[0053] 將轉(zhuǎn)ZmCIPK21基因互補(bǔ)株系及突變體株系分別點(diǎn)播在含有OmM、150mM NaCl的MS 平板上，4°C春化3天后，置于22°C，16小時(shí)光/8小時(shí)黑暗的培養(yǎng)箱中，5天后觀察表型并進(jìn) 行分析。從圖4所示結(jié)果中可以看出，相對(duì)突變體株系而言，突變體在高鹽脅迫下葉子萎蔫 表現(xiàn)出鹽敏感性，而互補(bǔ)株系及過(guò)表達(dá)野生型Col株系表現(xiàn)出明顯耐鹽性。
[0054] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0055] 參考文獻(xiàn)
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[0001] 序列表 <110〉中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 <120〉玉米因在提高植物抗逆性中的應(yīng)用 <130> KHP141111659.9 <160> 4 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 1347 <212> DNA <213〉玉米（Zea mays L.) <400> 1 at.gcggatgg gcaagtacga gatggggcgg acgctcgggg a^ggccactt cggcaaggtg 60 aggctg^cgc ggcacgcgga cacgggccgg cccttcgcca tcaagatcct cgaccgccag 120 cgcatcctcg ccatgaagat ccacgaccag atcaagaggg agatcgcgac gctgaagctg 180 ctcaagcacc ccaacgtcgt ccgcctctac gaggtttccg caagcaagac caaaatatac 240 atggtgrttg agtargtrHM tggaggagag rtgtltgara HgatrtHtat graggrgttg 300 aagggtaagc tgacggagaa ggaagggagg aaactgttcc agcagctcat agatgccgtg 360 ggatactgcc acgagaaggg ggtttatcac agggacctca agccagagaa tgtccttgtt 420 gatgcaaaag gaaacataaa agtttctgat ttcggattaa gtgcccttcc acagaaccaa 480 caaaaagatg git tgttgca taccycatgt ggcagccc ta actacatagc ccctgaggtc 540 cttctgaaca aaggttatga cggctcgata tctgacgtat ggtcctgtgg tgttattcta 600 tatgtaatgc ttacagggaa tcttccattc gacgaccaaa atgtggttgt cctt.taccag 660 aagattctca aggggaatgc tcacattcca aagtggctct cccaaggtgc ccaagatata 720 ctgagaaaaa tcctggatcc taacccggtl acacgcatag dtgtggatgg aataagggca 780 catgattK^t tcaagcaagg ctatgctcca gctatgccat ttagcgatga tgaagaa^at 840 atcagcatgg atgaagacag cctaaacatc accgagcata atgacatcca agacaagata 900 gcciatcaacc aaatcaatgc tttccagctc attggaatgt cctcctgcct tgatctatcc 960 ggattttttg agnaagagga tgtttrtgan aggaaaatrn gatttgratr aanttiittrc 1020 ccagcttatt tatttgagaa gattgagagc attgtcagaa aaatggggtt ccaggtacat 1080 aagagcaacg gcaagctaaa agtgatccaa gactgcaagg gactagcaaa ttcaagaggg 1140 caagagtcat tattaatttc tgctgaggtg tttgagatca atgaatatct ttatgttgtc 1200 gaactaaaga agtcatctgg agactgctcc ctgtacagaa agttgtgtga gacgctctca 1260 gaggacttgg gcacatgcaa aagccagcaa tttttaaagc aggactctat cagacaagat 1320 ataggtagat ataatagtag cttttaa 1347 <210> 2 <211> 445 <212> PRT <213> 玉米（Zea mays L.) <400> 2 Met Arg Met Gly Lys Tyr Glu Met Gly Arg Thr Leu Gly Glu Gly His 15 10 15 Phe Gly Lys Val Arg Leu Ala Arg His Ala Asp Thr Gly Arg Pro Phe
[0002] 20 25 30 Ala lie Lys lie Leu Asp Arg Gin Arg lie Leu Ala Met Lys lie His 35 40 45 Asp Gin lie Lys Arg Glu lie Ala Thr Leu Lys Leu Leu Lys His Pro 50 55 60 Asn Val Val Arg Leu Tyr Glu Yal Ser Ala Ser Lys Thr Lys lie Tyr 65 70 75 80 Met Val Leu Glu Tyr Val Asn Gly Gly Glu Leu Phe Asp Lys lie Ala 85 90 95 Leu Lys Gly Lys Leu Thr Glu Lys Glu Gly Arg Lys Leu Phe Gin Gin 100 105 110 Leu lie Asp Ala Val Gly Tyr Cys His Glu Lys Gly Val Tyr His Arg 115 120 125 Asp Leu Lys Pro Glu Asn Val Leu Val Asp Ala Lys Gly Asn lie Lys 130 135 140 Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Ala Leu Pro Gin Asn Gin Gin Lys Asp 145 150 155 160 Gly Leu Leu His Thr Thr Cys Gly Ser Pro Asn Tyr lie Ala Pro Glu 165 170 175 Val Leu Le'u Asn Lys Gly Tyr Asp Gly Ser lie Ser Asp Val Trp Ser 180 185 190 Cys Gly Val He Leu Tyr Val Met Leu Thr Gly Asn Leu Pro Phe Asp 195 200 205 Asp Gin Asn Val Val Val Leu Tyr Gin Lys lie Leu Lys Gly Asn Ala 210 215 220 His lie Pro Lys Trp Leu Ser Gin Gly Ala Gin Asp lie Leu Arg Lys 225 230 235 240 He Leu Asp Pro Asn Pro Val Thr Arg lie Asp Val Asp Gly lie Arg 245 250 255 Ala His Asp Trp Phe Lys Gin Gly Tyr Ala Pro Ala Met Pro Phe Ser 260 265 270 Asp Asp Glu Glu Asp He Ser Met Asp Glu Asp Ser Leu Asn lie Thr 275 280 285 Glu His Asn Asp lie Gin Asp Lys lie Ala lie Asn Gin lie Asn Ala 290 295 300 Phe Gin Leu lie Gly Met Ser Ser Cys Len Asp Leu Ser Gly Phe Phe 305 310 315 320 Glu i,ys Glu Asp Val Ser Glu Arg [,vs Tie Arg Phe Ala Ser Asn Tyr 325 330 335 Scr Pro Ala Tyr Leu Phe Glu Lys lie Glu Scr lie Val Arg Lys Met 34Q 345 350 Gly Phe Gin Val His Lys Ser Asn Gly Lys Leu Lys Val lie Gin Asp 355 360 365 Cys Lys Gly Leu Ala Asn Ser Arg Gly Gin Glu Ser Leu Leu lie Ser
[0003] 370 375 380 Ala Glu Val Phe Glu lie Asn Glu Tyr Leu Tyr Val Val Glu Leu Lys 385 390 395 400 Lys Ser Ser Gly Asp Cys Ser Leu Tyr Arg Lys Leu Cys Glu Thr Leu 405 410 415 Ser Glu Asp Leu Gly Thr Cys Lys Ser Gin Gin Phe Leu Lys Gin Asp 420 425 430 Ser lie Arg Gin Asp lie Gly Arg Tyr Asn Ser Ser Phe 435 440 445 <210> 3 <211> 24 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400〉 3 atgcggatgg gcaagtacga gatg 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 4 ttaaaagcta ctattatatc tacc 24
【權(quán)利要求】
1. 玉米CIPK21基因在提高植物抗逆性中的應(yīng)用，其特征在于，所述玉米CIPK21基因的 核苷酸序列為： i) Seq ID No. 1所示的核苷酸序列；或 ii) Seq ID No. 1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且表達(dá) 相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或 iii) 在嚴(yán)格條件下與Seq ID No. 1所示序列雜交的核苷酸序列； 所述嚴(yán)格條件為在含〇. 1 % SDS的0. 1 X SSPE或含0. 1 % SDS的0. 1 X SSC溶液中，在 65 °C下雜交，并用該溶液洗膜。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，將含有玉米CIPK21基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入 農(nóng)桿菌GV3101中，然后用蘸花浸染的方法轉(zhuǎn)化植物，篩選轉(zhuǎn)基因植株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗逆性是指對(duì)鹽堿脅迫的抗性。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物包括但不限于擬南芥。
5. 用于擴(kuò)增玉米CIPK21基因的特異性PCR引物對(duì)，其特征在于，包括正向引物 F5' -ATGCGGATGGGCAAGTACGAGATG-3' 和反向引物 R5' -TTAAAAGCTACTATTATATCTACC-3'。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104059929SQ201410175703
【公開(kāi)日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2014年4月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月28日
【發(fā)明者】鄭軍, 陳勛基, 黃全生, 王國(guó)英 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所