一種分解鴿子羽毛的地衣芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種分解鴿子羽毛的地衣芽孢桿菌（Bacillus?licheniformis），其分類(lèi)命名為地衣芽孢桿菌（Bacillus?licheniformis），菌株號(hào)為NJ-01，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2013年10月23日，保藏號(hào)為CCTCC?NO：M2013489。本發(fā)明還公開(kāi)了上述菌株的應(yīng)用。本發(fā)明的新菌種可直接用于鴿子羽毛的分解，從而有利于鴿子的廢棄物回收利用，促進(jìn)鴿子的生態(tài)、循環(huán)養(yǎng)殖，屬安全微生物，可用于鴿子羽毛的分解、肉鴿養(yǎng)殖廢棄物發(fā)酵及生物肥料領(lǐng)域。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種分解鴿子羽毛的地衣芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及養(yǎng)殖業(yè)環(huán)境資源應(yīng)用領(lǐng)域，尤其涉及一種分解鴿子羽毛的菌株，具體地說(shuō)涉及一種能夠有效地分解鴿子羽毛的地衣芽孢桿菌及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著養(yǎng)禽業(yè)的集約化發(fā)展，養(yǎng)殖企業(yè)，尤其是大中型畜牧場(chǎng)在提供肉、禽、蛋的同時(shí)，每天都會(huì)產(chǎn)生糞、羽毛、骨粉、血渣等大量的廢棄物，這些廢棄物如果處理不好，常常會(huì)污染環(huán)境，傳播病原。尤其是羽毛，因其具有難以降解的特點(diǎn)，顯得比其他廢棄物更難以回收利用。而據(jù)研究報(bào)道，羽毛中的角蛋白含量高達(dá)80%，并且含有豐富的賴(lài)氨酸、色氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、組氨酸、脯氨酸、甘氨酸以及其他一些維生素、常量元素及微量元素，由于缺乏實(shí)用的降解羽毛的手段，致使大量羽毛廢棄、污染環(huán)境。盡管高壓、酸解等處理方法能夠降解羽毛，但由于成本高，不實(shí)用。
[0003]比較研究表明，生物發(fā)酵方法處理農(nóng)業(yè)廢棄物成為首選，而篩選最合適的微生物發(fā)酵降解菌株優(yōu)勢(shì)最為重要的，其根本的原因是必須要找到能夠降解羽毛角蛋白的菌株。角蛋白是外胚層細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，是一種不溶性的纖維狀動(dòng)物蛋白質(zhì)，是禽類(lèi)羽毛的主要構(gòu)成物質(zhì)。角蛋白因含有較多的氫鍵、二硫鍵、鹽鍵且折疊緊密，又不溶于水，一般不容易被酶溶解。而且由于不同禽類(lèi)羽毛角蛋白的結(jié)構(gòu)組成有所不同，因此，即便是能夠分解一種禽類(lèi)的羽毛，不一定能降解其他禽類(lèi)的羽毛。
[0004]近年來(lái)，有不少專(zhuān)利及研究報(bào)道，不少細(xì)菌，主要是枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌能夠降解雞的羽毛，少數(shù)菌可以降解鴨、鵝的羽毛，對(duì)鴿子的羽毛，尚未見(jiàn)有較好的降解菌分離鑒定。我們通過(guò)細(xì)菌分離降解試驗(yàn)表明，能夠降解雞毛的細(xì)菌用來(lái)降解鴿子羽毛，效果并不好，因此，有必要篩 選、培養(yǎng)分解效果的更好的單一菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的空白，提供一種能夠有效分解鴿子羽毛的細(xì)菌菌種。
[0006]本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述菌種的應(yīng)用，該菌種能夠有效分解鴿子羽毛中的角蛋白，變成易于吸收的氨基酸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而可用來(lái)制備有機(jī)肥和養(yǎng)殖蚯蚓、蠅蛆等動(dòng)物源飼料。
[0007]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0008]一種分解鴻子羽毛的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis),其分類(lèi)命名為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis),菌株號(hào)為NJ-01,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，郵編430072，保藏日期為2013年10月23日，保藏號(hào)為CCTCC NO:M2013489。該菌株是2012年9月從江蘇省南京市某鴿場(chǎng)鴿羽毛糞便堆積物中分離篩選獲得的、對(duì)鴿子羽毛能夠有效分解的細(xì)菌菌株，這對(duì)分解處理養(yǎng)鴿場(chǎng)的廢棄的羽毛，降低養(yǎng)鴿場(chǎng)環(huán)境污染程度，減少疾病的傳播具有重要意義。[0009]上述分解鴿子羽毛的地衣芽孢桿菌在分解鴿子羽毛中的應(yīng)用。
[0010]應(yīng)用的具體方式是，將地衣芽孢桿菌CCTCC NO:M2013489的發(fā)酵液直接用于鴿子羽毛的分解。
[0011]其中，所述的發(fā)酵液按如下步驟制備得到:
[0012](I)地衣芽孢桿菌菌株NJ-Ol的活化
[0013]用接種環(huán)將地衣芽孢桿菌菌株NJ-Ol劃線于活化培養(yǎng)基上，并于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，培養(yǎng)溫度設(shè)定為37°C ；
[0014](2)種子液的制備
[0015]將步驟(1)所述菌株活化后，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接I~2環(huán)單菌落于30~40mL種子培養(yǎng)基中，35~40°C震蕩培養(yǎng)24~36小時(shí)，得種子液；
[0016](3)發(fā)酵液的制備
[0017]搖瓶發(fā)酵:以5~10%的體積比的接種量，將種子液接種于裝有瓶體積40%~60%的發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，35~40°C，以120~200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速搖瓶發(fā)酵48-60小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，即得發(fā)酵液；
[0018]或者，
[0019]發(fā)酵罐發(fā)酵:以3~10%的體積比的接種量，將種子液接種于裝有罐體積65%~70%的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，35~40°C進(jìn)行通風(fēng)攪拌培養(yǎng)，其中攪拌轉(zhuǎn)速為180~220r/min,通氣量以發(fā)酵液體積`m3/(空氣體積m3*分鐘)計(jì)為1/(1.1~1.2)，罐內(nèi)壓力
0.l±0.02MPa，發(fā)酵48~72小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，即得發(fā)酵液。
[0020]其中，所述的活化培養(yǎng)基按如下方法制備得到:稱(chēng)取營(yíng)養(yǎng)瓊脂38g，蒸餾水800ml，調(diào)整pH7.5，加蒸餾水至1000ml，高壓滅菌，制得。
[0021]其中，種子培養(yǎng)基按如下方法制備得到:稱(chēng)取牛肉膏3g，蛋白胨5g，NaC15g,K2HPO4Ig,蒸懼水800ml,初始pH7.5,加蒸懼水至1000毫升,高壓滅菌,制得；
[0022]其中，發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下:鴿羽毛粉2wt%，K2HPO40.04wt%jt酸亞鐵0.01wt%,NaCl0.05wt%,溶劑為水，初始ρΗ7.5，高壓滅菌。
[0023]有益效果:本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)可直接用于鴻子羽毛的分解，從而有利于鴿子的廢棄物回收利用，促進(jìn)鴿子的生態(tài)、循環(huán)養(yǎng)殖，屬安全微生物，可用于鴿子羽毛的分解、肉鴿養(yǎng)殖廢棄物發(fā)酵及生物肥料領(lǐng)域。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1NJ-01菌落形態(tài)。
[0025]圖2NJ-01顯微鏡放大400倍菌落形態(tài)。
[0026]圖3NJ-01地衣芽孢桿菌菌體形態(tài)。
[0027]圖4NJ-1菌株16SrDNA核苷酸片段PCR產(chǎn)物電泳圖。其中，M為分子量對(duì)照；1為NJ-1菌株16SrDNA擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0028]圖5NJ-01 菌株 16SrDNA1098bp NCBI 網(wǎng) blast 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。其中，Icl | 92913為NJ-Ol菌株。
[0029]圖6NJ10菌株對(duì)鴿羽毛分解5天結(jié)果。
[0030]圖7NJ10菌株對(duì)鴿羽毛分解10天結(jié)果。[0031]圖8NJ10菌株對(duì)鴿羽毛分解15天結(jié)果。
[0032]圖9未加NJlO菌株鴿羽毛形態(tài)結(jié)構(gòu)。
【具體實(shí)施方式】
[0033]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0034]實(shí)施例1:菌株的培養(yǎng)鑒定。
[0035]1、原始菌株的獲得
[0036]從南京某鴿場(chǎng)鴿糞堆積物取樣5克，直接用滅菌接種環(huán)采取采集的土壤劃線接種于普通瓊脂平板，37°C培養(yǎng)24h后，觀察生長(zhǎng)出的單個(gè)菌落形態(tài)，細(xì)菌直徑大小2_左右，邊緣不整齊，呈淡棕色，粗造型菌落(圖1 )。進(jìn)行進(jìn)一步的分離培養(yǎng)，獲得單個(gè)菌落后進(jìn)行純培養(yǎng)。細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果:通過(guò)細(xì)菌分離培養(yǎng)，獲得一株純培養(yǎng)細(xì)菌，命名為NJ-Ol。分離到的細(xì)菌在400倍低倍顯微鏡下呈花瓣?duì)?圖2)。細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色后置于顯微鏡油鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果為有芽孢的G+中等大小的桿菌，多數(shù)單在，少數(shù)呈3~5個(gè)短鏈狀，繁殖體細(xì)菌大小0.6~0.8 μ mX 1.5~3.0 μ m,細(xì)菌芽抱為捕圓形，中生，大小為0.6~0.9 μ mX 1.0~L 5 μ m0 [0037]2、細(xì)菌的生化反應(yīng)鑒定
[0038]取分離培養(yǎng)出的單個(gè)細(xì)菌菌落在載玻片上涂片進(jìn)行革蘭氏染色，然后置于光學(xué)顯微鏡油鏡頭下進(jìn)行觀察。挑取菌落接種于微量生化鑒定管，37°C培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。并按常規(guī)方法接種三糖鐵瓊脂斜面和進(jìn)行吲哚試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂穿刺試驗(yàn)并觀察。
[0039]表1NJ01菌株生化反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種分解鴻子羽毛的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis),其分類(lèi)命名為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis),菌株號(hào)為NJ-01,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2013年10月23日，保藏號(hào)為CCTCC NO:M2013489。
2.權(quán)利要求1所述的分解鴿子羽毛的地衣芽孢桿菌在分解鴿子羽毛中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的應(yīng)用，其特征在于，將地衣芽孢桿菌CCTCCNO:M2013489的發(fā)酵液直接用于鴿子羽毛的分解。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的發(fā)酵液按如下步驟制備得到: (1)地衣芽孢桿菌菌株NJ-Ol的活化 用接種環(huán)將地衣芽孢桿菌菌株NJ-Ol劃線于活化培養(yǎng)基上，并于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，培養(yǎng)溫度設(shè)定為37°C ； (2)種子液的制備 將步驟(1)所述菌株活化后，在無(wú)菌條件下用接種環(huán)接I~2環(huán)單菌落于30~40mL種子培養(yǎng)基中，35~40°C震蕩培養(yǎng)24~36小時(shí)，得種子液； (3)發(fā)酵液的制備 搖瓶發(fā)酵:以5~10%的體積比的接種量，將種子液接種于裝有瓶體積40%~60%的發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，35~40°C，以120~200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速搖瓶發(fā)酵48-60小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，即得發(fā)酵液； 或者， 發(fā)酵罐發(fā)酵:以3~10%的體積比的接種量，將種子液接種于裝有罐體積65%~70%的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，35~40°C進(jìn)行通風(fēng)攪拌培養(yǎng)，其中攪拌轉(zhuǎn)速為180~220r/min,通氣量以發(fā)酵液體積m3/(空氣體積m3*分鐘)計(jì)為1/(1.1~1.2)，罐內(nèi)壓力.0.l±0.02MPa，發(fā)酵48~72小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，即得發(fā)酵液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的活化培養(yǎng)基按如下方法制備得到:稱(chēng)取營(yíng)養(yǎng)瓊脂38g，蒸餾水800ml，調(diào)整pH7.5，加蒸餾水至1000ml，高壓滅菌，制得。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，種子培養(yǎng)基按如下方法制備得到:稱(chēng)取牛肉膏3g,蛋白胨5g, Na C15g, K2HPO4Ig,蒸懼水800ml,初始ρΗ7.5,加蒸懼水至1000毫升，高壓滅菌，制得。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下:鴿羽毛粉2wt%，K2HPO40.04wt%4t酸亞鐵 0.01wt%, NaCl0.05wt%，溶劑為水，初始 pH7.5，高壓滅菌。
【文檔編號(hào)】A23K1/18GK103834603SQ201410127256
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年3月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月31日
【發(fā)明者】方光遠(yuǎn), 茅慧華, 戴鼎震, 蔣加進(jìn), 張姝 申請(qǐng)人:金陵科技學(xué)院