一種鐵皮石斛體細胞胚的增殖保存方法及培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鐵皮石斛體細胞胚增殖保存的方法及培養(yǎng)基，包括以下步驟：1）外植體的消毒；2）原球莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)；3）體細胞胚的誘導(dǎo)；4）體細胞胚的增殖保存培養(yǎng)；5）體細胞胚的恢復(fù)生長與增殖培養(yǎng)；6）體細胞胚的萌發(fā)；7）試管苗的壯苗生根培養(yǎng)。采用本發(fā)明的方法進行鐵皮石斛體細胞胚的增殖保存培養(yǎng)，培養(yǎng)物可連續(xù)保存12個月，保存期間在不需繼代的情況下可增殖40倍，操作簡單，成本低，恢復(fù)培養(yǎng)反應(yīng)快?？梢愿鶕?jù)市場和生產(chǎn)的需要，在較短時間大量增殖或控制增殖速度加以保存。
【專利說明】一種鐵皮石斛體細胞胚的增殖保存方法及培養(yǎng)基
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬植物組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種鐵皮石斛體細胞胚的增殖保存方法及培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum),俗稱鐵皮楓斗,是蘭科石斛屬多年生草本植物，為名貴的傳統(tǒng)中藥，具重要的藥用價值，有滋陰清熱、生津益胃、止咳潤肺之功效，頗具市場開發(fā)價值。近年來，由于人們對其過度采挖，導(dǎo)致其野生資源急劇減少，日趨瀕危，現(xiàn)已被列為國家重點保護植物。由于鐵皮石斛對生態(tài)環(huán)境要求高，自然條件下鐵皮石斛繁殖率低生長速度緩慢，采用傳統(tǒng)方法繁育鐵皮石斛效率很低。因此鐵皮石斛的組織培養(yǎng)研究得到了重視并獲得了較大的進展。
[0003]付傳明等開展了鐵皮石斛無菌播種產(chǎn)業(yè)化繁育技術(shù)研究，采用種子一原始球莖一完整植株一移栽的途徑快速成苗進行工廠化生產(chǎn)，對各階段培養(yǎng)基進行篩選，以及其他一些影響因子進行比較研究。結(jié)果表明:人工授粉后生長60~180天的鐵皮石斛種子在離體條件下均能萌發(fā)，其中授粉150~180天種子的萌發(fā)效果最好，萌發(fā)率為87.2%~94.4%,適宜的萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.lmg/L+馬鈴薯汁200g/L+AC1.0g/L ;原始球莖增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.lmg/L+香蕉汁100g/L+AC1.0g/L ;原始球莖在 MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.lmg/L+ 馬鈴薯汁 200g/L+ACl.0g/L 培養(yǎng)基上進行分化培養(yǎng)，分化的同時還能進行一定的增殖；將已分化的芽苗轉(zhuǎn)接到壯苗培養(yǎng)基MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+香蕉汁100g/L+ACl.0g/L上培養(yǎng)I代后，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA0.8mg/L+ 無機鹽 A0.2-0.5mg/L+ 香蕉汁 100g/L+ACl.0g/L 上，培養(yǎng) 50 ~70 天后，生根率100%，無機鹽A可以有效地控制愈傷或原始球莖的形成，明顯提高生根苗的數(shù)量和質(zhì)量。
`[0004]李丹等開展了黑節(jié)鐵皮石斛原始球莖誘導(dǎo)、再分化以及腋芽萌發(fā)和生根的初步研究，認為，黑節(jié)鐵皮石斛帶芽莖段最佳的消毒方式為70%酒精處理30s后再用0.l%HgC12處理20min。黑節(jié)鐵皮石斛帶芽莖段原始球莖誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+KTlmg/L+NAA0.1mg/L0黑節(jié)鐵皮石斛帶芽莖段原始球莖再分化的最佳培養(yǎng)基為MS+KT2mg/L+NAA0.5mg/L。黑節(jié)鐵皮石斛帶芽莖段腋芽萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基為MS+KT2mg/L+NAA0.5mg/L。這些實驗結(jié)果為黑節(jié)鐵皮石斛試管苗的工廠化生產(chǎn)奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
[0005]潘超美等取繼代培養(yǎng)30天的鐵皮石斛類原始球莖作接種材料，以N6為基本培養(yǎng)基，加入植物激素，并以真菌提取物作誘導(dǎo)子，對類原始球莖和愈傷組織進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。顯微觀察結(jié)果表明鐵皮石斛體細胞胚的形成可由愈傷組織的表皮細胞或內(nèi)部細胞產(chǎn)生。認為鐵皮石斛通過類原始球莖和愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)能獲得大量的叢芽。
[0006]詹忠根等以鐵皮石斛離體根尖為外植體，研究了在不同培養(yǎng)條件下離體根尖經(jīng)愈傷組織形成體細胞胚及直接產(chǎn)生體細胞胚再生植株的細胞學(xué)過程，認為鐵皮石斛類原始球莖是單細胞起源的真正體細胞胚。[0007]盡管鐵皮石斛的組織培養(yǎng)獲得了較大的成功，利用組織培養(yǎng)技術(shù)進行鐵皮石斛種苗的快速繁育已沒有很大的技術(shù)問題，但市場需要往往與生產(chǎn)情況不一致，如何使生產(chǎn)適合市場，是組培技術(shù)成功運用于生產(chǎn)、并取得較高經(jīng)濟效益的關(guān)鍵。為此，科學(xué)家開始研究組織培養(yǎng)材料的離體保存技術(shù)研究。陳勇等報道了鐵皮石斛種質(zhì)資源的玻璃化法超低溫保存研究，對鐵皮石斛的原生質(zhì)體、原始球莖進行了玻璃化法超低溫保存研究，存活率分別達48%和88%.實驗結(jié)果表明:材料、預(yù)處理、化凍方法、凍前預(yù)培養(yǎng)基等因素都對存活率有較大影響。
[0008]史永忠等報道了鐵皮石解種質(zhì)室溫離體保存的研究，認為:鐵皮石斛試管苗在1/2MS,附加NAA0.5mg/L、20g/L蔗糖、0.5mg/L活性炭和7g/L瓊脂的培養(yǎng)基上，在普通培養(yǎng)室條件(25 士 2°C)下，連續(xù)保存12個月，存活率達100%。培養(yǎng)基中添加低濃度NAA、蔗糖和活性炭，可明顯改變保存材料的狀態(tài)。盡管史永忠等報道結(jié)果認為，經(jīng)其保存的鐵皮石斛試管苗恢復(fù)生長較快。但由于在保存試管苗期間，其基部開始生根，就不利于其增殖。雖然保存材料能較快地恢復(fù)生長，但若要進行保存材料的擴繁，需剪除根系，重新進行增殖的啟動培養(yǎng)。因此該方法只適用鐵皮石斛的保存，而不利于鐵皮石斛保存后恢復(fù)增殖。
[0009]至今，未見鐵皮石斛體細胞胚增殖保存方面的研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的在于提供一種鐵皮石斛體細胞胚的增殖保存方法及培養(yǎng)基，以鐵皮石斛八分熟種子作外植體，誘導(dǎo)原始球莖建立無菌系，無菌系繼代培養(yǎng)誘導(dǎo)體細胞胚并大量增殖，通過培養(yǎng)基成分和植物生長調(diào)節(jié)劑的調(diào)配，達到體細胞胚增殖保存的目的。
[0011]本發(fā)明的鐵皮石斛體細胞胚的增殖保存方法，包括以下步驟: [0012]I)外植體的消毒:取鐵皮石斛蒴果，在超凈工作臺上，用75%酒精消毒45~60秒后，再用15~20% (體積比)次氯酸鈉水溶液浸泡15-25分鐘，無菌水沖洗3-5遍；
[0013]2)原球莖的誘導(dǎo)培養(yǎng):無菌操作吸干消毒后的鐵皮石斛蒴果表面的水分，用解剖刀切開蒴果，挑取其種子，接種于原始球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行弱光照，20~30天后轉(zhuǎn)移至光照下培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)25~35天后，外植體萌發(fā)形成圓錐狀的原球莖，溫度25±2°C ；
[0014]原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方是:MS基本培養(yǎng)基，6-芐氨基腺嘌呤0.5~1.5mg/L，萘乙酸0.2~0.6mg/L，水解酪蛋白0.5~1.5g/L，活性炭0.3~0.6g/L，蔗糖2~4%，瓊脂粉
6~7g/L ；
[0015]3)體細胞胚的誘導(dǎo)與增殖:將原球莖繼代培養(yǎng)于體細胞胚的誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基上，30天后原球莖逐漸產(chǎn)生體細胞胚并不斷增殖；
[0016]體細胞胚誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基配方是:MS基本培養(yǎng)基,6-節(jié)氨基腺嘌呤0.5~
1.5mg/L,6-糖基氨基嘌呤0.2~0.8mg/L,萘乙酸0.2~0.6mg/L,水解酪蛋白0.4~0.8g/L,活性炭0.3~0.6g/L，蔗糖2~4%，瓊脂粉6~7g/L ；
[0017]4)體細胞胚的增殖保存培養(yǎng):將體細胞胚轉(zhuǎn)接培養(yǎng)于體細胞胚增殖保存培養(yǎng)基，2個月后達增殖高峰，如果要進行快速繁殖，應(yīng)轉(zhuǎn)接于新鮮的體細胞胚增殖保存培養(yǎng)基再進行增殖培養(yǎng)，如不需進行快速繁殖，而要進行種質(zhì)保存，則在達增殖高峰后不進行轉(zhuǎn)接，繼續(xù)在原增殖保存培養(yǎng)基上培養(yǎng)3~4個月，體細胞胚仍能緩慢增殖，并有少量體細胞胚開始萌發(fā)，培養(yǎng)10~12個月后,培養(yǎng)基大大減少,培養(yǎng)物聚集在一起,處于半饑餓狀態(tài),但仍保持良好的生命力；
[0018]體細胞胚增殖保存培養(yǎng)基配方是；MS基本培養(yǎng)基，6-芐氨基腺嘌呤0.5~1.5mg/L, 6-糖基氨基嘌呤0.2~0.8mg/L,萘乙酸0.2~0.6mg/L,水解酪蛋白0.4~0.8g/L，活性炭0.3~0.6g/L，蔗糖2~4%，瓊脂粉6~7g/L ；
[0019]5)體細胞胚的恢復(fù)生長與增殖培養(yǎng):將增殖保存培養(yǎng)的體細胞胚，分散培養(yǎng)于新鮮的體細胞胚恢復(fù)生長與增殖培養(yǎng)基，I周后，體細胞胚即開始恢復(fù)生長，2周后逐漸增殖，獲得鐵皮石斛體細胞胚；
[0020]體細胞胚恢復(fù)生長與增殖培養(yǎng)基配方是:MS基本培養(yǎng)基，6-芐氨基腺嘌呤0.8~
1.2mg/L,6-糖基氨基嘌呤0.2~0.8mg/L,萘乙酸0.2~0.6mg/L,水解酪蛋白0.5~1.0g/L,香蕉泥80~120g/L,鹿糖2~4%,瓊脂粉6~7g/L ；
[0021]6)體細胞胚的萌發(fā):將增殖培養(yǎng)獲得的鐵皮石斛體細胞胚轉(zhuǎn)接培養(yǎng)于體細胞胚萌發(fā)培養(yǎng)基，2周后體細胞胚逐漸萌發(fā)成幼苗；
[0022]體細胞胚萌發(fā)的培養(yǎng)基配方是:MS基本培養(yǎng)基，6-芐氨基腺嘌呤0.3~0.6mg/L,6-糖基氨基嘌呤0.3~0.6mg/L，萘乙酸0.1~0.2mg/L，水解酪蛋白0.6~0.8g/L，活性炭0.3~0.4g/L，蔗糖2~4%，瓊脂粉6~7g/L ；
[0023]7)壯苗生根培養(yǎng):將鐵皮石斛幼苗培養(yǎng)于壯苗生根培養(yǎng)基，30天后發(fā)育為完整的鐵皮石斛組培苗；
[0024]壯苗生根的培養(yǎng)基配方是:1/2MS基本培養(yǎng)基，萘乙酸0.3~0.5mg/L,活性炭0.3~0.5g/L，蔗糖2~4%，瓊脂粉6~7g/L ；
[0025]所有培養(yǎng)基的pH為5.4~5.8。
[0026]優(yōu)選地，步驟I)所述的鐵皮石斛蒴果的成熟度為八分熟。
[0027]優(yōu)選地，步驟2)所述的弱光照，光照強度為300~500勒克斯。
[0028]優(yōu)選地，步驟2)所述的光照培養(yǎng)，光照強度為2000~2500勒克斯。
[0029]優(yōu)選地，步驟4)所述的培養(yǎng)溫度為20~25V。
[0030]本發(fā)明的一種用于鐵皮石斛體細胞胚誘導(dǎo)與增殖的培養(yǎng)基，其配方是:MS基本培養(yǎng)基，6-芐氨基腺嘌呤0.5~1.5mg/L，6-糖基氨基嘌呤0.2~0.8mg/L，萘乙酸0.2~0.6mg/L，水解酪蛋白0.4~0.8g/L，活性炭0.3~0.6g/L，蔗糖2~4%，瓊脂粉6~7g/L。
[0031]本發(fā)明的一種用于鐵皮石斛體細胞胚增殖保存的培養(yǎng)基，其配方是:MS基本培養(yǎng)基，6-芐氨基腺嘌呤0.5~1.5mg/L，6-糖基氨基嘌呤0.2~0.8mg/L,萘乙酸0.2~
0.6mg/L，水解酪蛋白0.4~0.8g/L，活性炭0.3~0.6g/L，蔗糖2~4%，瓊脂粉6~7g/L。
[0032]本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的MS或1/2MS基本培養(yǎng)基為鐵皮石斛培養(yǎng)物生長提供了 N、P、K等無機營養(yǎng)元素，以滿足其生長的基本需求；
[0033]其中，所述的 MS基本培養(yǎng)基配方如下表1所示，mg/L表示每升MS培養(yǎng)基中含各成分的暈克數(shù)。
[0034]表1
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種鐵皮石斛體細胞胚的增殖保存方法，包括以下步驟: 1)外植體的消毒: 取鐵皮石斛蒴果，在超凈工作臺上，用75%酒精消毒45~60秒后，再用體積比為15~20%的次氯酸鈉水溶液浸泡15~25分鐘，無菌水沖洗3~5遍； 2)原球莖的誘導(dǎo)培養(yǎng): 無菌操作吸干消毒后的鐵皮石斛蒴果表面的水分，用解剖刀切開蒴果，挑取其種子，接種于原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，先進行弱光照培養(yǎng)，20~30天后轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng).25~35天后，外植體萌發(fā)成圓錐狀的原球莖，培養(yǎng)溫度為25±2°C;原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方是:MS基本培養(yǎng)基，6-芐氨基腺嘌呤0.5~1.5mg/L，萘乙酸0.2~0.6mg/L，水解酪蛋白.0.5~1.5g/L，活性炭0.3~0.6g/L，蔗糖2~4%，瓊脂粉6~7g/L ； 3)體細胞胚的誘導(dǎo)與增殖: 將原球莖繼代培養(yǎng)于體細胞胚的誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基上，30天后原球莖產(chǎn)生體細胞胚并逐漸增殖； 體細胞胚誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基配方是:MS基本培養(yǎng)基，6-芐氨基腺嘌呤0.5~1.5mg/L,.6-糖基氨基嘌呤0.2~0.8mg/L，萘乙酸0.2~0.6mg/L，水解酪蛋白0.4~0.8g/L，活性炭0.3~0.6g/L,鹿糖2~4%,瓊脂粉6~7g/L ； 4)體細胞胚的增殖保存培養(yǎng): 將體細胞胚轉(zhuǎn)接培養(yǎng)于體細胞胚增殖保存培養(yǎng)基，2個月后達增殖高峰；如果要進行快速繁殖，應(yīng)轉(zhuǎn)接于新鮮的體細胞胚增殖保存培養(yǎng)基再進行增殖培養(yǎng)；如不需進行快速繁殖，而要進行種質(zhì)保存，則在達增殖高峰后不進行轉(zhuǎn)接，繼續(xù)在原增殖保存培養(yǎng)基上培養(yǎng).3~4個月，體細胞胚仍能緩慢增殖，并有少量體細胞胚開始萌發(fā)，培養(yǎng)10~12個月后，培養(yǎng)基大大減少，培養(yǎng)物聚集在一起，處于半饑餓狀態(tài)，但基本保持良好的生命力，培養(yǎng)溫度為 25±2°C ； 體細胞胚增殖保存培養(yǎng)基配方是:MS基本培養(yǎng)基，6-芐氨基腺嘌呤0.5~1.5mg/L,.6-糖基氨基嘌呤0.2~0.8mg/L，萘乙酸0.2~0.6mg/L,水解酪蛋白0.4~0.8g/L，活性炭0.3~0.6g/L,鹿糖2~4%,瓊脂粉6~7g/L ； 5)體細胞胚的恢復(fù)生長與增殖培養(yǎng): 將增殖保存培養(yǎng)的體細胞胚，分散培養(yǎng)于新鮮的體細胞胚恢復(fù)生長與增殖培養(yǎng)基，I周后，體細胞胚即開始恢復(fù)生長，2周后逐漸增殖，獲得鐵皮石斛體細胞胚； 體細胞胚恢復(fù)生長與增殖培養(yǎng)基配方是:MS基本培養(yǎng)基，6-芐氨基腺嘌呤0.8~1.2mg/L,6-糖基氨基嘌呤0.2~0.8mg/L,萘乙酸0.2~0.6mg/L,水解酪蛋白0.5~1.0g/L,香蕉泥80~120g/L,鹿糖2~4%,瓊脂粉6~7g/L ； 6)體細胞胚的萌發(fā): 將增殖培養(yǎng)獲得的鐵皮石斛體細胞胚轉(zhuǎn)接培養(yǎng)于體細胞胚萌發(fā)培養(yǎng)基，2~3周后體細胞胚逐漸萌發(fā)成幼苗； 體細胞胚萌發(fā)的培養(yǎng)基配方是:MS基本培養(yǎng)基，6-芐氨基腺嘌呤0.3~0.6mg/L，6-糖基氨基嘌呤0.3~0.6mg/L，萘乙酸0.1~0.2mg/L,水解酪蛋白0.6~0.8g/L，活性炭.0.3~0.4g/L,鹿糖2~4%,瓊脂粉6~7g/L ； 7)壯苗生根培養(yǎng):將鐵皮石斛幼苗培養(yǎng)于壯苗生根培養(yǎng)基，30天后發(fā)育為完整的鐵皮石斛組培苗； 壯苗生根的培養(yǎng)基配方是:1/2MS基本培養(yǎng)基，萘乙酸0.3~1.0mg/L,活性炭0.3~。0.5g/L，蔗糖2~4%，瓊脂粉6~7g/L ； 所有培養(yǎng)基的pH為5.4~5.8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛體細胞胚的增殖保存方法，其特征在于，步驟I)所述的鐵皮石斛蒴果的成熟度為八分熟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛體細胞胚的增殖保存方法，其特征在于，步驟2)所述的弱光照的光照強度為300~500勒克斯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛體細胞胚的增殖保存方法，其特征在于，步驟2)所述的光照培養(yǎng)的光照強度為2000~2500勒克斯。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛體細胞胚的增殖保存方法，其特征在于，步驟4)所述的培養(yǎng)溫度為20~25°C。
6.一種用于鐵皮石斛體細胞胚誘導(dǎo)與增殖的培養(yǎng)基，其配方是:MS基本培養(yǎng)基,6-節(jié)氨基腺嘌呤0.5~1.5mg/L, 6-糖基氨基嘌呤0.2~0.8mg/L，萘乙酸0.2~0.6mg/L,水解酪蛋白0.4~0.8g/L，活性炭0.3 ~0.6g/L，蔗糖2~4%，瓊脂粉6~7g/L。
7.一種用于鐵皮石斛體細胞胚增殖保存的培養(yǎng)基，其配方是:MS基本培養(yǎng)基,6-節(jié)氨基腺嘌呤0.5~1.5mg/L, 6-糖基氨基嘌呤0.2~0.8mg/L，萘乙酸0.2~0.6mg/L,水解酪蛋白0.4~0.8g/L，活性炭0.3~0.6g/L，蔗糖2~4%，瓊脂粉6~7g/L。
【文檔編號】A01H4/00GK103875533SQ201410113720
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月25日
【發(fā)明者】殷麗青, 孫翊, 張永春, 周音, 朱建軍, 楊柳燕, 李水根, 范曉芬 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院