一種巨大芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種巨大芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于微生物領(lǐng)域，該植物促生菌（Bacillus?megaterium?ZH5），于2014年1月22日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，分類名為巨大芽孢桿菌（Bacillus?megaterium），保藏號CGMCC?No.8802。該菌株在酸堿環(huán)境中均能保持較高活性，能高產(chǎn)吲哚乙酸并能利用難溶性磷酸鹽為磷源進(jìn)行生長，提高肥料的利用率，增加土壤有效磷含量，改善土壤尤其是紅壤質(zhì)量；高產(chǎn)的吲哚乙酸促進(jìn)植物生長發(fā)育，提高植物根系發(fā)育和對肥料的吸收，土壤有效磷含量的提高也使植物對磷肥的利用率更高，因此本發(fā)明對植物尤其是花生具有良好的促生長效果。
【專利說明】一種巨大芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物領(lǐng)域，涉及一種巨大芽孢桿菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]紅壤為發(fā)育于熱帶和亞熱帶雨林、季雨林或常綠闊葉林植被下的土壤。其主要特征是缺乏堿金屬和堿土金屬而富含鐵、鋁氧化物，呈酸性紅色。在我國主要分布于長江以南的低山丘陵區(qū)，包括:江西、湖南兩省的大部分，滇南、湖北的東南部，廣東、福建北部及貴州、四川、浙江、安徽、江蘇等的一部分，以及西藏南部等地。占全國土地總面積20%以上，人口占全國40%，耕地占全國的30%。紅壤地區(qū)是我國主要糧食產(chǎn)區(qū)和熱帶-亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物一橡膠、油棕、咖啡、可可、柑橘、茶葉、油桐、桑蠶的主要產(chǎn)區(qū)，歷來在我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境建設(shè)中發(fā)揮著重要作用。但是，由于紅壤的主要肥力特征是酸、粘、瘦、旱，施入的磷肥非常容易被紅壤中的活性鐵、鋁固定從而大大地降低了利用率，因此，改善紅壤質(zhì)量，提高磷肥利用率是提高紅壤地區(qū)農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展的重要課題。
[0003]在土壤中許多微生物能夠溶解難溶態(tài)磷，促進(jìn)植物對磷的吸收，增加作物產(chǎn)量和改善作物品質(zhì)，將解磷微生物作為生物肥料，不但可以提高土壤中磷的利用效率，節(jié)肥增產(chǎn)，而且可改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤有機(jī)質(zhì)含量。植物促生菌(PlantGrowthPromotingBacteria,簡稱PGPB)被界定為在一定條件下有利于植物生長的自由生活在土壤、根際、根表、葉際的細(xì)菌。這些細(xì)菌能夠固氮、溶磷、溶鐵，并產(chǎn)生植物激素，如生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素和乙烯。此外，它們還能提高植物的抗逆性，包括干旱、高鹽、重金屬毒害和農(nóng)藥。但現(xiàn)在大部分植物促生菌還未被馴化成可有效應(yīng)用于促進(jìn)植物生長并具有較好溶磷效果的菌種，未必適應(yīng)紅壤的 土壤環(huán)境。因此從紅壤中分離得到植物促生菌，和作物形成共生體系，利用生物修復(fù)改善紅壤，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。由于紅壤土呈弱酸性，從其他土壤中篩選出來的細(xì)菌由于受土壤酸堿度的限制，很難達(dá)到預(yù)期的溶磷、促生長的目的。如中國專利CN101643704A公開了一種溶磷的草酸青霉菌P8，經(jīng)過試驗(yàn)證明，在紅壤中該菌的存活數(shù)小于黑土和潮土中的數(shù)量。因此從紅壤中分離得到植物促生菌，和作物形成共生體系，利用生物修復(fù)改善紅壤，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。
[0004] 申請人:于2012年申請的專利號為ZL2012102458617的中國專利中雖公開了一株同樣具有分泌吲哚乙酸和解磷能力的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) JX15,但是該菌株無論是產(chǎn)吲哚乙酸的能力還是解磷能力均無法奇跡本發(fā)明的促生菌ZH5。更為關(guān)鍵的是，JX15篩選自潮土，其土壤的物化性質(zhì)、肥力情況和微生物環(huán)境與紅壤具有較大區(qū)別，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其在促進(jìn)紅壤中作物生長方面的效果并不理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種巨大芽孢桿菌，可以有效地將土壤中難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可被生物利用的可溶性磷酸鹽，促進(jìn)植物生長，尤其是改善紅壤質(zhì)量，促進(jìn)植物在紅壤中的生長。[0006]本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]一種植物促生菌ZH5,分類名為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium),于2014年I月22日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC N0.8802。
[0008]植物促生菌ZH5 (CGMCC N0.8802)，呈革蘭氏陽性，產(chǎn)芽孢，不規(guī)則桿狀排列。菌落較小為白色、隆起，邊緣整齊，表面光滑濕潤，不透明(如圖1)。嚴(yán)格好氧，化能異養(yǎng)，接觸酶陽性，M.R和VP試驗(yàn)陰性，淀粉水解陽性，明膠水解陽性。最適生長溫度為30°C，以難溶性磷酸鹽為磷源進(jìn)行生長，并將其轉(zhuǎn)化為可溶性磷酸鹽。
[0009]本發(fā)明的植物促生菌ZH5是從紅壤中分離獲得，促生菌適應(yīng)發(fā)酵溫度為28~32°C，適應(yīng)酸堿度為pH5~11。
[0010]將從江西鷹潭紅壤生態(tài)站采取的紅壤挑根過篩后置于滅菌水中，通過在搖床中保溫、振蕩、靜置，得到土壤懸浮液。該土壤懸浮液中含有若干種促生菌，采用稀釋法稀釋后涂于LB培養(yǎng)基，將平板倒置，于恒溫箱中培養(yǎng)后，挑取不同類型典型單個(gè)菌落，經(jīng)平板純化后，低溫保存在LB斜面待用。通過定性測定和定量測定篩選出可分泌吲哚乙酸的植物促生細(xì)菌。
[0011 ] 將上述方法篩選分離出的菌株，經(jīng)上海英俊生物工程有限公司測序，根據(jù)16SrDNA的測序結(jié)果，在http://www.ncb1.nlm.nih.gov在線查詢分析,利用Blast軟件在GenBank中與其它的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，選擇相近的序列與ZH5的序列用MEGA version3軟件構(gòu)建ZH5的16SrDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹。根據(jù)該菌株的生理生化特征，鑒定為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium),同源性為 98%。
[0012]本發(fā)明所述的植 物促生菌培養(yǎng)時(shí)使用的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉、硝酸鉀、硝酸銨、硫酸銨、尿素、丙氨酸；使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、木糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、葡萄糖；使用的無機(jī)組分包括但不限于氯化鉀、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸三鈣、二水氯化鈣、七水合硫酸鎂、七水和硫酸亞鐵。
[0013]本發(fā)明的植物促生菌ZH5能高產(chǎn)吲哚乙酸并能利用難溶性磷酸鹽為磷源進(jìn)行生長。
[0014]吲哚乙酸是植物激素的一種，能夠促進(jìn)根的發(fā)育。產(chǎn)吲哚乙酸的菌種，往往附著在植物根系或葉表面，利用植物代謝產(chǎn)生分泌物的同時(shí)產(chǎn)生IAA和少量GA3等植物激素來影響植物的生理過程和形態(tài)變化。表現(xiàn)為直接促進(jìn)根的伸長，從而增大了與土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的接觸的機(jī)會；可提高植物體內(nèi)原IAA的含量；誘導(dǎo)植物防衛(wèi)基因的表達(dá)，提高植物體抗病，抗旱等抗逆性。本發(fā)明所述的植物促生菌分泌吲哚乙酸(IAA)的能力強(qiáng)，達(dá)43.18 μ g.ml/1。所述促生菌的發(fā)酵在pH7~10下進(jìn)行時(shí)產(chǎn)IAA量最高。
[0015]本發(fā)明所述的植物促生菌以難溶性磷酸鹽為磷源進(jìn)行生長，并將其轉(zhuǎn)化為可溶性磷酸鹽。在實(shí)驗(yàn)室搖瓶條件下，所述植物促生菌對磷酸三鈣的轉(zhuǎn)化量達(dá)186.15mg 相對于采用接種滅活菌作為空白對照的結(jié)果，所述植物促生菌對磷酸三鈣的轉(zhuǎn)化量比空白對照高出 164.72mg.L—1 (圖 6)。
[0016]作為本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)化，所述植物促生菌采用的碳源為蔗糖，采用的氮源為酵母粉或蛋白胨或兩者的組合。利用上述碳源和氮源制得的培養(yǎng)基，培育出的植物促生菌產(chǎn)IAA的量最高。
[0017]本發(fā)明的植物促生菌ZH5在促進(jìn)植物生長中的應(yīng)用，優(yōu)選的是促進(jìn)紅壤中花生的生長。通過室內(nèi)盆栽實(shí)驗(yàn)，將ZH5接種到盆栽中，能夠很好的促進(jìn)花生的生長，相對于對照與接種其它植物促生菌，花生株高分別高出10.48cm和9.18cm,花生植株重分別高出2.34g和 1.83g。
[0018]本發(fā)明的植物促生菌ZH5在植物栽培中的應(yīng)用，優(yōu)選的是在紅壤中花生栽培的應(yīng)用。通過室內(nèi)盆栽實(shí)驗(yàn)，將ZH5接種到盆栽中，與對照相比能夠提高紅壤的速效磷和IAA含量，促進(jìn)花生的生長。
[0019]本發(fā)明的植物促生菌ZH5在植物促生劑的應(yīng)用，優(yōu)選的是生長于紅壤中花生的促生劑。通過盆栽實(shí)驗(yàn)，接種ZH5不僅能夠分泌IAA促進(jìn)花生的生長而且能夠促進(jìn)紅壤中難溶性磷的轉(zhuǎn)化，因此可以將ZH5制備成促生劑尤其適應(yīng)于紅壤環(huán)境的促進(jìn)劑，即含有本實(shí)驗(yàn)的巨大芽孢桿菌。
[0020]本發(fā)明的有益效果為:
[0021]本發(fā)明提供的植物促生菌即ZH5 (CGMCC N0.8802)，高產(chǎn)吲哚乙酸并能將難溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)化為可溶性磷酸鹽，提高肥料的利用率，促進(jìn)植物根系發(fā)育和對肥料的吸收，增加土壤有效磷含量，改善紅壤栽培環(huán)境；本發(fā)明對植物尤其是花生具有良好的促生長效果，高產(chǎn)的吲哚乙酸促進(jìn)花生的生長發(fā)育，土壤有效磷含量的提高也使得花生對磷肥的利用率更高。與根際促生菌JX15 (CGMCC N0.5622)比較，產(chǎn)吲哚乙酸能力、解磷能力有極顯著提高，在促進(jìn)紅壤中花生的生長方面更是產(chǎn)生了預(yù)料不到的技術(shù)效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是本發(fā)明菌株ZH5的菌落圖
[0023]圖2表示不同裝液量對菌株ZH5產(chǎn)IAA的影響
[0024]圖3表示不同初始pH對ZH5菌株產(chǎn)IAA的影響
[0025]圖4表示不同碳源對菌株ZH5產(chǎn)IAA的影響
[0026]圖5表示不同氮源對ZH5菌株產(chǎn)IAA的影響
[0027]圖6表示菌株ZH5對難溶性磷的利用情況
[0028]圖7表示種植花生30天后接種ZH5菌株和JX15菌株對花生鮮重的影響
[0029]圖8表示種植花生30天后接種ZH5菌株和JX15菌株對花生株高的影響
[0030]圖9表示種植花生30天后接種ZH5菌株和JX15菌株對花生植株全P含量的影響
[0031]圖10表示種植花生30天后接種ZH5菌株和JX15菌株對花生根總長的影響
[0032]圖11表示種植花生30天后接種ZH5菌株和JX15菌株對花生根表面積的影響
[0033]圖12表示種植花生30天后接種ZH5菌株和JX15菌株對花生根平均直徑的影響
[0034]圖13表示種植花生30天后接種ZH5菌株和JX15菌株對花生根尖數(shù)的影響
[0035]圖14表示種植花生30天后接種ZH5菌株和JX15菌株對土壤IAA含量的影響
[0036]圖15表示種植花生30天后接種ZH5菌株和JX15菌株對土壤有效P含量的影響
[0037]生物材料保藏信息
[0038]植物促生菌ZH5,分類命名為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium ZH5),于2014年I月22日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號CGMCC N0.8802。
[0039]根際促生菌JX15，分類命名為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium JX15)，于2011年12月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號CGMCC N0.5622。
【具體實(shí)施方式】
[0040]實(shí)施例1
[0041]1.培養(yǎng)基準(zhǔn)備，包括以下四種類型的培養(yǎng)基:
[0042]LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，ρΗ7.0-7.2，121°C滅菌，20min。
[0043]LB液體培養(yǎng)基:不加瓊脂，其它條件同上。
[0044]無機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基(ΡΚ0培養(yǎng)基):磷酸三鈣5g，葡萄糖10g，硫酸銨0.5g，氯化鈉
0.3g，七水合硫酸鎂0.3g，氯化鉀0.3g，硫酸錳0.03g,七水合硫酸亞鐵0.03g, ρΗ7.0瓊脂20g，蒸餾水 1000ml, ρΗ7.0 ~7.2。121°C滅菌，20min。
[0045]無機(jī)鹽培養(yǎng)基:硫酸銨2.0g ;磷酸二氫鈉0.5g ;磷酸氫二鉀0.5g ;七水硫酸鎂
0.2g ;二水氯化鈣 0.lg，蒸餾水 1000mL, ρΗ7.0,121°C滅菌，20min。
[0046]2.促生菌 分離
[0047]將從江西鷹潭紅壤生態(tài)站采取的紅壤挑根過篩后稱取IOg置于盛有100mL滅菌水的250ml的三角瓶中，在搖床中，30°C，150r.mirT1振蕩20min，靜置lOmin，得到土壤懸浮液。該土壤懸浮液中含有若干種促生菌，采用稀釋法稀釋后涂于LB培養(yǎng)基，將平板倒置，于300C，恒溫箱中培養(yǎng)24h后，挑取不同類型典型單個(gè)菌落，經(jīng)平板純化后，4°C保存在LB斜面待用。
[0048]3.促生菌篩選
[0049]I)產(chǎn)吲哚乙酸菌定性測定:將分離純化后的細(xì)菌接種于采用含有L-色氨酸(100mg/L)的LB液體培養(yǎng)基，30°C，180r.mirT1搖床培養(yǎng)Id。取50 μ L菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時(shí)加 50μ L Salkowski 比色液(50mL35%HC104+lmL0.5M FeC13)。將加入 50 μ L50mg/L吲哚乙酸的比色液作為陽性對照。白色陶瓷板于室溫避光放置30min后觀察，顏色變紅者表示能夠分泌吲哚乙酸。
[0050]2)產(chǎn)吲哚乙酸菌定量測定:對初篩獲得的分泌IAA的細(xì)菌進(jìn)行定量測定，培養(yǎng)條件同上。首先用分光光度法測定菌懸液的0D600值，然后將菌懸液以1000Or.mirT1離心IOmin取上清液加入等體積Salkowski比色液，避光靜置30min，測定其0D530值。計(jì)算菌濃度0D600值為I時(shí)，單位體積發(fā)酵液中吲哚乙酸的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用分析純的吲哚乙酸梯度稀釋制備。
[0051]3)溶磷菌篩選:將供試菌株接種于盛有30mL無機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基的150mL三角瓶，30°C，180r.mirT1培養(yǎng)4d后，將培養(yǎng)液裝入離心管4°C下10000r.mirT1離心，15min。取上清液用鑰藍(lán)比色法測定有效磷含量。首先吸取離心后的上清液0.5ml于50ml容量瓶中，加水稀釋至約30ml，加二硝基酚指示劑2滴，用氫氧化鈉及稀硫酸溶液調(diào)節(jié)PH至溶液剛呈微黃色。然后加入鑰銻抗顯色劑5ml，搖勻，用水定容。在室溫下放置30min后，在分光光度計(jì)上用波長700nm比色。讀取吸收值，在工作曲線上查出顯色液的P mg/L數(shù)。
[0052]通過以上測定即可篩選出高產(chǎn)吲哚乙酸，并且溶磷能力強(qiáng)的菌株，株型命名為ZH5。[0053]將上述方法篩選分離出的菌株，經(jīng)上海英俊生物工程有限公司測序，根據(jù)16SrDNA的測序結(jié)果，在http://www.ncb1.nlm.nih.gov在線查詢分析,利用Blast軟件在GenBank中與其它的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，選擇相近的序列與ZH5的序列用MEGA version3軟件構(gòu)建ZH5的16SrDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹。根據(jù)該菌株的生理生化特征，鑒定為巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium),同源性為98%。將該菌株送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC N0.8802。
[0054]實(shí)施例2
[0055]好氧性試驗(yàn)
[0056]把滅過菌的LB培養(yǎng)基倒入3個(gè)已滅菌的試管中，大約在2/3處，在無菌操作臺上，用接種針挑取斜面培養(yǎng)的所述菌，穿刺接種到上述培養(yǎng)基中(必須穿刺到管底)。30°C培養(yǎng)，分別在3天至7天觀察結(jié)果。在瓊脂柱表面上生長者為好氧菌，如沿穿刺線生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌。試驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)，ZH5(CGMCCN0.8802)菌落沿瓊脂柱表面生長，穿刺線內(nèi)無菌落生長，為嚴(yán)格好氧。
[0057]過氧化氫酶的測定
[0058]在干凈載玻片上滴I滴3%H202，取18~24h的LB斜面培養(yǎng)物I環(huán)，在H202中涂抹，若有氣泡產(chǎn)生則為陽性，否則為陰性。試驗(yàn)結(jié)果顯示ZH5 (CGMCC N0.8802)為接觸酶陽性。
[0059]甲基紅試驗(yàn)(M.R試驗(yàn)) [0060]a.培養(yǎng)基及試劑:蛋白胨5g,葡萄糖5g,氯化鈉5g,蒸懼水1000mL,調(diào)節(jié)pH7.0~
7.2，分裝試管，每管裝4~5mL，121°C滅菌20min。試劑:甲基紅0.1g, 95%酒精300mL，蒸餾水200mL。
[0061]b.菌種培養(yǎng)及結(jié)果觀察接種菌株于上述培養(yǎng)液中，30°C培養(yǎng)I~2天。在培養(yǎng)液中加入幾滴甲基紅試劑，如培養(yǎng)液呈現(xiàn)紅色，為甲基紅陽性，黃色為陰性(甲基紅變色范圍
4.4紅色~6.0黃色)。
[0062]試驗(yàn)結(jié)果顯示ZH5 (CGMCC N0.8802)為M.R陰性。
[0063]乙酞甲基甲醇試驗(yàn)(VP試驗(yàn))
[0064]a.培養(yǎng)基培養(yǎng)基同甲基紅試驗(yàn)。
[0065]b.菌種培養(yǎng)及結(jié)果觀察接種與培養(yǎng)同甲基紅試驗(yàn)。做VP試驗(yàn)時(shí)，取培養(yǎng)液(約2mL)和等量的40%Na0H相混合，加少量肌酸，充分振蕩2~5min后，如培養(yǎng)液出現(xiàn)紅色，即為VP陽性。
[0066]試驗(yàn)結(jié)果顯示ZH5 (CGMCC N0.8802)為VP陰性。
[0067]淀粉水解試驗(yàn)
[0068]a.培養(yǎng)基及試劑在肉湯蛋白胨瓊脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分裝三角瓶，121°C滅菌20min備用。路哥氏碘液:碘片lg，碘化鉀2g，先用少量(3~5mL)蒸餾水溶解碘化鉀，現(xiàn)加入碘片，待碘完全溶解后，加水稀釋至300mL。
[0069]b.菌種培養(yǎng)及結(jié)果觀察取菌種點(diǎn)接于平板上，30°C培養(yǎng)2~4天，形成菌落后，在平板上滴加路哥氏碘液，以鋪滿菌落周圍為度，平板呈藍(lán)色，而菌落周圍如有無色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉已被水解。透明圈的大小一般說明水解淀粉能力的大小。
[0070]試驗(yàn)結(jié)果顯示ZH5 (CGMCC N0.8802)為淀粉水解陽性。[0071]明膠水解試驗(yàn)
[0072]a.培養(yǎng)基及試劑蛋白胨5g，明膠120g，蒸餾水1000mL。調(diào)節(jié)ρΗ7.2~7.4，分裝試管，培養(yǎng)基高度約為4~5cm，121°C滅菌20min。
[0073]b.菌種培養(yǎng)及結(jié)果觀察用穿刺法接種在試管中央。在30°C溫箱中培養(yǎng)一個(gè)月，觀察明膠是否液化。
[0074]試驗(yàn)結(jié)果顯示ZH5 (CGMCC N0.8802)為明膠水解陽性。
[0075]實(shí)施例3
[0076]為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)施例1得到的植物促生菌ZH5產(chǎn)吲哚乙酸的能力和最適條件，下面針對不同裝液量、pH、不同碳源、不同氮源探索對吲哚乙酸產(chǎn)量的影響。
[0077]將含有L-色氨酸(100mg/L) LB 液體培養(yǎng)基按 25ml，50ml，75ml，100ml，150ml 裝于250mL的三角瓶中，按1%(v/v)接種量接種處于對數(shù)生長期的ZH5后，置于30°C，180r.mirT1搖床培養(yǎng)24h，按定量測定的方法測定產(chǎn)IAA的量。結(jié)果如圖2所示，由于菌株ZH5 (CGMCCN0.8802)是好養(yǎng)代謝，通氣量影響菌株產(chǎn)IAA的效率，50mL裝液量時(shí)，菌株產(chǎn)IAA量最多，之后隨著裝液量增大，產(chǎn)量越少。
[0078]將含有L-色氨酸(100mg/L)的LB培養(yǎng)基分別調(diào)節(jié)到不同的pH (4、5、6、7、8、9、10、11、12)，取5011^裝于250mL的三角瓶中，按1% (v/v)接種量接種處于對數(shù)生長期的ZH5(CGMCC N0.8802)后，置于30°C，180r.mirT1搖床培養(yǎng)24h，按定量測定的方法測定產(chǎn)IAA的量，結(jié)果如圖3所示，表明pH為4和12時(shí)不產(chǎn)IAA，在強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境中，菌體無法進(jìn)行生長代謝，菌種在微堿環(huán)境中產(chǎn)IAA多于酸性環(huán)境,該菌種高產(chǎn)IAA的最適pH為8~10。
[0079]在含有L-色氨酸(100mg/L)無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別加入1% (w/v)的碳源,碳源有葡萄糖、木糖、蔗糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖等，取50ml裝于250ml的三角瓶中，按1% (v/v)接種量接種處于對數(shù)生長期的ZH5 (CGMCC N0.8802)后，置于30°C，180r.mirT1搖床培養(yǎng)24h，按定量測定的方法測定產(chǎn)IAA的量。結(jié)果如圖4所示，該菌株在供給蔗糖時(shí)，產(chǎn)IAA的能力最強(qiáng)，其次是甘露醇，木糖的利用率最低，幾乎不產(chǎn)IAA。
[0080]在含有L-色氨酸(100mg/L)無機(jī)鹽培養(yǎng)基(不包括硫酸銨)中分別加入0.1% (w/v)的氮源，氮源包括硝酸銨、硫酸銨、硝酸鉀、蛋白胨、酵母粉、尿素、丙氨酸等，取50ml裝于250ml的三角瓶中按1% (v/v)接種量接種處于對數(shù)生長期的ZH5 (CGMCC N0.8802)后，置于30°C，180r ?mirT1搖床培養(yǎng)24h，按定量測定的方法測定產(chǎn)IAA的量。結(jié)果如圖5所示，說明取酵母粉為氮源時(shí)，產(chǎn)IAA的量最多。
[0081]實(shí)施例4
[0082]本發(fā)明對花生具有明顯促生長作用，下面通過盆栽試驗(yàn)進(jìn)行說明。
[0083]紅壤獲得和含磷測定:采集自然條件下O~20cm 土層的新鮮紅壤，過5mm篩，每盆裝土 200g，種植花生，調(diào)節(jié)含水量至田間最大持水量的60%，30天后采樣，用根系掃描儀(LA1600+scanner, Canada)掃描獲得根系圖像后，用根系分析軟件(Winrhizo2003b,Canada)進(jìn)行相關(guān)根系指標(biāo)分析，用HPLC法測定土壤IAA含量，用鑰藍(lán)比色法測定土壤有效磷含量。
[0084]花生種子處理:花生種子進(jìn)行20%雙氧水表面消毒20min，無菌水沖洗多次，催芽2d，選取發(fā)芽一致的 種子備用。
[0085]接菌處理:將本發(fā)明的ZH5 (CGMCC N0.8802 )接種于LB液體培養(yǎng)基，30°C，180r.mirT1搖床培養(yǎng),培養(yǎng)菌長至對數(shù)生長期,然后將菌懸液1000Or.mirT1離心10min,再用無菌水重懸同樣離心三次，接種量為108CFU.g'
[0086]對照處理:作為對照1，土壤不噴灑ZH5 (CGMCC N0.8802)菌液，加等量無菌水即對照CK。為對比ZH5 (CGMCC N0.8802)的效果，增加其他植物促生菌作為對照2 (保藏號CGMCC N0.5622的巨大芽孢桿菌JX15)。
[0087]結(jié)果如圖7、圖8、圖9、圖10、圖11、圖12、圖13、圖14、圖15所示。從圖7圖8可以看出，與對照I(CK)相比，經(jīng)接菌處理后，植株的株高及地上部鮮重增加了 10.48cm和
2.34g，促進(jìn)了花生生長，與對照2(JX15)相比，接種巨大芽孢桿菌ZH5的植株的高及地上部鮮重分別增加了 9.18cm和1.83g ;從圖9可以看出，經(jīng)接種處理后，花生植株的全磷含量較對照組明顯增加，與對照I (CK)相比，花生植株全磷含量增加了 2.8g/kg，與對照2(JX15)相比，花生植株全磷含量增加了 2.13g/kg ;從圖10、圖11、圖12、圖13可以看出，接種ZH5處理與不接菌處理、接種ZH5處理與接種JX15進(jìn)行對比，花生根系總長度，根表面積，根平均直徑和根尖數(shù)都顯著增加，促進(jìn)了花生根系的發(fā)育，并且與JX15相比，ZH5對花生根系有更好的促進(jìn)效果；從圖14可以看出，經(jīng)接菌處理后，土壤IAA含量顯著增加，比對照組分別高出0.47mg/kg和0.29mg/kg ;從圖15可以看出，經(jīng)接菌ZH5處理后，土壤有效磷含量有所提高，與對照I(CK)相比土壤速效磷含量增加了 2.62mg/kg，與對照2(JX15)相比土壤速效磷含量增加了 2.31mg/kg。
[0088]結(jié)合以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明的植物促生菌ZH5對根基的生長、發(fā)育具有明顯效果，解磷能力好，IAA產(chǎn)量高，可以有效促進(jìn)作物生長發(fā)育。并且ZH5與植物促生菌JX15相比，對環(huán)境有更好 的適應(yīng)能力，能適應(yīng)紅壤土壤環(huán)境，改善紅壤土壤質(zhì)量，對植物生長尤其是紅壤中花生的生長ZH5有更顯著的促進(jìn)效果。
[0089]結(jié)合本文以上所述，巨大芽孢桿菌ZH5與植物促生菌JX15相比，ZH5不僅在酸性環(huán)境中生存發(fā)揮對植物的促生效應(yīng)，而且在堿性環(huán)境中也有更好的促生效應(yīng)。所以巨大芽孢桿菌ZH5有更好的推廣范圍，對植物的生長環(huán)境比JX15適應(yīng)范圍更大。
[0090]可以知道，上述實(shí)施例僅為了說明發(fā)明原理而采用的示例性實(shí)施方式，然而本發(fā)明不僅限于此，本領(lǐng)域技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明實(shí)質(zhì)情況下，可以做出各種改進(jìn)和變更，這些改進(jìn)和變更也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種植物促生菌巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)ZH5,于2014年I月22日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC N0.8802。
2.權(quán)利要求1所述的巨大芽孢桿菌ZH5在促進(jìn)植物生長中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于權(quán)利要求1所述的巨大芽孢桿菌ZH5在促進(jìn)紅壤中花生生長的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的巨大芽孢桿菌ZH5在植物栽培中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于權(quán)利要求1所述的巨大芽孢桿菌ZH5在紅壤中花生栽培 的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的巨大芽孢桿菌ZH5在制備紅壤中植物促生劑中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物促生劑為花生促生劑。
【文檔編號】A01P21/00GK103992963SQ201410104044
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月19日
【發(fā)明者】王華平, 鄭文波, 李輝信, 焦加國, 閆小梅, 陳雄, 張舒玄, 劉滿強(qiáng), 陳小云, 胡鋒 申請人:南京博農(nóng)生物科技有限公司