一種利用野生稻資源創(chuàng)制粳型水稻新種質(zhì)的育種方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于水稻遺傳改良與生物技術(shù)應(yīng)用，具體涉及一種利用野生稻資源創(chuàng)制粳型水稻新種質(zhì)的育種方法。其方法包括如下步驟：S1.野生稻基因組DNA的提?。籗2.DNA導(dǎo)入；S3.篩選性狀具有變異的植株；S4.對(duì)篩選的變異植株進(jìn)行分子鑒定。本發(fā)明提供了一種切實(shí)可行的創(chuàng)新水稻種質(zhì)的途徑，將野生稻DNA導(dǎo)入粳型水稻，獲得具有野生稻性狀的導(dǎo)入后代材料，其導(dǎo)入效率高達(dá)6.8%、變異廣泛，選擇群體大，縮短育種年限，適合育種需要，且穩(wěn)定快，導(dǎo)入的第3代就穩(wěn)定了，創(chuàng)制的新種質(zhì)可以作為粳稻育種的親本材料利用或經(jīng)定向選育后成為新品種應(yīng)用于水稻生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】一種利用野生稻資源創(chuàng)制粳型水稻新種質(zhì)的育種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水稻遺傳改良與生物技術(shù)應(yīng)用，具體涉及一種利用野生稻資源創(chuàng)制粳型水稻新種質(zhì)的育種方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是世界上重要的糧食作物，全球約站50%的人口以稻米為主糧，我國(guó)是世界上最大的水稻生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)，播種面積和產(chǎn)量占我國(guó)糧食作物的首位。水稻在馴化為栽培稻和栽培稻現(xiàn)代育種過程中，由于選擇壓力和追求高產(chǎn)，造成許多基因丟失，現(xiàn)代栽培品種的遺傳基礎(chǔ)日趨狹窄和單一，未來(lái)的育種工作能否取得持續(xù)進(jìn)展和突破，很大程度上取決于種質(zhì)資源的利用。
[0003]野生稻在長(zhǎng)期的自然選擇過程中形成了無(wú)數(shù)特異優(yōu)良性狀和遺傳多樣性，是水稻育種的寶貴遺傳資源。Sun的研究發(fā)現(xiàn)，栽培稻的等位基因數(shù)約為野生稻的60%，國(guó)際水稻所(IRRI)的研究表明，從野生稻中尋找抗性基因的機(jī)會(huì)比栽培稻多約50倍，而且野生稻中還含有與產(chǎn)量性狀有關(guān)的QTL基因，是水稻育種新基因的主要來(lái)源之一。然而由于野栽雜交的不親和性，且優(yōu)劣性狀連鎖遺傳、后代瘋狂分離，使得野生稻與栽培稻雜交育種難度大，時(shí)間長(zhǎng)。
[0004]《水稻分子育種法一穗莖注射法》中公開了穗莖注射法導(dǎo)入外源DNA在黑麥中獲得轉(zhuǎn)基因植株后，Croughan.T.P等立即在水稻上獲得了外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)基因植株(1988，1989)。我國(guó)黃興奇、周建林等報(bào)道用穗莖注射法將動(dòng)旺谷、云南野生稻及稗草等材料的總DNA導(dǎo)入水稻品種，獲得了一批性狀變異并穩(wěn)定遺傳的材料。目前粳型水稻栽培品種的遺傳基礎(chǔ)狹窄、抗逆性差，野生稻與粳型栽培稻雜交存在花期不遇、雜交不結(jié)實(shí)、雜交后代不育等問題，利用野生稻改良粳型水稻育種難度大，時(shí)間長(zhǎng)。進(jìn)行野生稻的DNA導(dǎo)入粳型水稻栽培品種的技術(shù)研究，利用穗頸`節(jié)導(dǎo)入法，將江西普通野生稻的DNA片段導(dǎo)入寧夏水稻栽培品種，創(chuàng)新粳稻種質(zhì)和育種新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種利用野生稻資源創(chuàng)制粳型水稻新種質(zhì)的育種方法。
[0006]本發(fā)明利穗莖節(jié)導(dǎo)入法，將普通野生稻(AA)DNA導(dǎo)入寧夏水稻栽培品種寧粳16號(hào)和寧粳23號(hào)，創(chuàng)造粳稻育種新材料和新方法。寧夏水稻栽培品種寧粳16號(hào)和寧粳23號(hào)，這兩個(gè)品種由寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所利用常規(guī)育種方法選育而成，分別于1995年和2002年通過寧夏自治區(qū)品種審定定名。
[0007]本發(fā)明一種利用野生稻資源創(chuàng)制粳型水稻新種質(zhì)的育種方法，包括如下步驟:
[0008]S1.野生稻基因組DNA的提取
[0009](a)剪取孕穗期的葉片5g放入50ml研缽；
[0010](b)向步驟(a)的研缽中加入液氮,每次加入50ml,總共3次到4次,快速研磨成細(xì)粉，將細(xì)粉倒入50ml塑料離心管；[0011](C)向步驟(b)的離心管中加入預(yù)熱提取緩沖液25ml及β -巰基乙醇25 μ 1，混勻后65°C水浴30min ；
[0012](d)向步驟(c)的離心管中加5mol/L醋酸鉀溶液5ml，溫和混勻，冰浴20min ；
[0013](e)向步驟(d)的離心管中加入等體積氯仿和異戊醇混合液，氯仿與異戊醇的體積比為 24:1，在 4°C 4500 Xg 離心 15min ；
[0014](f)吸出步驟(e)中的上清液,加_20°C預(yù)冷的等體積異丙醇,靜止3min-5min至出現(xiàn)白色DNA線團(tuán)；
[0015](g)挑起步驟(f)中DNA線團(tuán)，70%乙醇洗滌，晾干，溶于0.1ml 1XSSC，4°C保存；
[0016]S2.DNA 導(dǎo)入
[0017]在孕穗后期，花粉發(fā)育到單核中晚期，外部形態(tài)表現(xiàn)為穗頂部離劍葉葉枕2cm，利用微量注射器將DNA導(dǎo)入水稻穗頸節(jié)，從上向下呈45度角刺入穗下頸節(jié)處，注入DNA液，DNA濃度為400 μ g/ml，緩沖液為添加了 2mg/ml CaClJ^0.1 X SSC緩沖液，注射時(shí)間為上午9點(diǎn)至上午10點(diǎn)，每株導(dǎo)入10 μ 1，重復(fù)導(dǎo)入3次；待導(dǎo)入株成熟后分別收獲導(dǎo)入穗，下年種植選擇變異株；
[0018]S3.篩選性狀具有變異的植株
[0019]將收獲的導(dǎo)入穗按穗及對(duì)照穗進(jìn)行無(wú)土育秧，當(dāng)秧苗長(zhǎng)至IOcm左右，分別按穗行單株植入田間，以受體材料作為對(duì)照篩選性狀具有變異的植株，并將變異株繼續(xù)種植，直到后代性狀穩(wěn)定；
[0020]S4.對(duì)篩選的變異植株進(jìn)行分子鑒定
[0021]將篩選的具有變異性狀的植株利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行分子鑒定，以供、受體為對(duì)照，鑒定變異植株中有無(wú)供體野生稻`的DNA片段進(jìn)入。
[0022]本發(fā)明中提取緩沖液100mmol/LTris-HCl ρΗ8.0，500mmol/L NaCl，50mmol/L EDTApH8.0，質(zhì)量濃度為1.5% SDS0
[0023]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果如下:
[0024]本發(fā)明提供了一種切實(shí)可行的創(chuàng)新水稻種質(zhì)的途徑，獲得具有野生稻性狀的導(dǎo)入后代材料。
[0025]本發(fā)明提供的育種方法可以將野生稻DNA導(dǎo)入水稻中，導(dǎo)入效率高達(dá)6.8% ;后代性狀變異范圍廣，引起了水稻株高、葉片、葉色、葉角度、粒形、粒重、抗病性等性狀的變化；選擇群體大，后代穩(wěn)定快，縮短育種年限，適合粳型水稻種質(zhì)創(chuàng)新及育種需要，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)描述，但并非對(duì)本發(fā)明的限制，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1
[0027]本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)材料為野生稻DNA、寧粳16號(hào)和寧粳23號(hào)。本實(shí)施例中利用野生稻資源創(chuàng)制粳型水稻新種質(zhì)的育種方法，包括以下步驟:
[0028]本發(fā)明一種利用野生稻資源創(chuàng)制粳型水稻新種質(zhì)的育種方法，包括如下步驟:
[0029]S1.野生稻基因組DNA的提取
[0030](a)剪取孕穗期的葉片5g放入50ml研缽；[0031](b)向步驟(a)的研缽中加入液氮,每次加入50ml,總共3次到4次,快速研磨成細(xì)粉，將細(xì)粉倒入50ml塑料離心管；
[0032](c)向步驟(b)的離心管中加入預(yù)熱提取緩沖液25ml及β -巰基乙醇25 μ 1，混勻后 65°C水浴 30min ;提取緩沖液 100mmol/L Tris-HCl pH8.0,500mmol/L NaCl, 50mmol/LEDTA ρΗ8.0，質(zhì)量濃度為 1.5% SDS。
[0033](d)向步驟(c)的離心管中加5mol/L醋酸鉀溶液5ml，溫和混勻，冰浴20min ；
[0034](e)向步驟(d)的離心管中加入等體積氯仿和異戊醇混合液，氯仿與異戊醇的體積比為 24:1，在 4°C 4500 Xg 離心 15min ；
[0035](f)吸出步驟(e)中的上清液,加_20°C預(yù)冷的等體積異丙醇,靜止3min_5min至出現(xiàn)白色DNA線團(tuán)；
[0036](g)挑起步驟(f)中DNA線團(tuán)，70%乙醇洗滌，晾干，溶于0.1mll X SSC，4°C保存；
[0037]S2.DNA 導(dǎo)入
[0038]在孕穗后期，花粉發(fā)育到單核中晚期，外部形態(tài)表現(xiàn)為穗頂部離劍葉葉枕2cm，利用微量注射器將DNA導(dǎo)入水稻穗頸節(jié)，從上向下呈45度角刺入穗下頸節(jié)處，注入DNA液，DNA濃度為400 μ g/ml，緩沖液為添加了 2mg/ml CaClJ^0.1 X SSC緩沖液，注射時(shí)間為上午9點(diǎn)至上午10點(diǎn)，每株導(dǎo)入10 μ 1，重復(fù)導(dǎo)入3次；待導(dǎo)入株成熟后分別收獲導(dǎo)入穗，下年種植選擇變異株；
[0039]S3.篩選性狀具有變異的植株
[0040]將收獲的導(dǎo)入穗按穗及對(duì)照穗進(jìn)行無(wú)土育秧，當(dāng)秧苗長(zhǎng)至IOcm左右，分別按穗行單株植入田間，以受體材料作為對(duì)照篩選性狀具有變異的植株，并將變異株繼續(xù)種植，直到后代性狀穩(wěn)定。`
[0041 ] 對(duì)照試驗(yàn):在孕穗后期，利用微量注射器將添加了 2mg/ml CaCl2的0.1 X SSC緩沖液導(dǎo)入寧粳16號(hào)和寧粳23號(hào)同一株的另一個(gè)穗作為對(duì)照。
[0042]統(tǒng)計(jì)寧粳16號(hào)和寧粳23號(hào)雜交后代水稻變異材料的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)(見表1 )，變異材料的葉形及葉夾角(見表2)，變異材料的粒長(zhǎng)變化(見表3)，變異材料的粒寬變化(見表4)，野生稻DNA導(dǎo)入寧夏水稻品種后的抗病性調(diào)查(見表5)，統(tǒng)計(jì)抗病性導(dǎo)入后代與對(duì)照的比較(見表6)。
[0043]S4.對(duì)篩選的變異植株進(jìn)行分子鑒定
[0044]將篩選的具有變異性狀的植株利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行分子鑒定，以供、受體為對(duì)照，鑒定變異植株中有無(wú)供體野生稻的DNA片段進(jìn)入。
[0045]表1、變異材料的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種利用野生稻資源創(chuàng)制粳型水稻新種質(zhì)的育種方法，其特征在于，包括如下步驟: 51.野生稻基因組DNA的提取 Ca)剪取孕穗期的葉片5g放入50ml研缽； (b)向步驟(a)的研缽中加入液氮，每次加入50ml，總共3次到4次，快速研磨成細(xì)粉，將細(xì)粉倒入50ml塑料離心管； (c)向步驟(b)的離心管中加入預(yù)熱提取緩沖液25ml及β-巰基乙醇25yL，混勻后65°C 水浴 30min ； (d)向步驟(c)的離心管中加5mol/L醋酸鉀溶液5ml,溫和混勻,冰浴20min； (e)向步驟(d)的離心管中加入等體積氯仿和異戊醇混合液，氯仿與異戊醇的體積比為24:1，在 4°C 4500 Xg 離心 15min ； (f)吸出步驟(e)中的上清液,加等體積_20°C預(yù)冷的異丙醇,靜止3min-5min至出現(xiàn)白色DNA線團(tuán)； (g)挑起步驟(f)中DNA線團(tuán)，70%乙醇洗滌，晾干，溶于0.1ml 1XSSC，4°C保存； 52.DNA導(dǎo)入 在孕穗后期，花粉發(fā)育到單核中晚期，外部形態(tài)表現(xiàn)為穗頂部離劍葉葉枕2cm，利用微量注射器將DNA導(dǎo)入水稻穗頸節(jié)，從上向下呈4`5度角刺入穗下頸節(jié)處，注入DNA液，DNA濃度為400 μ g/ml，緩沖液為添加了 2mg/ml CaCl2的0.1 X SSC緩沖液，注射時(shí)間為上午9點(diǎn)至上午10點(diǎn)，每株導(dǎo)入10 μ 1，重復(fù)導(dǎo)入3次；待導(dǎo)入株成熟后分別收獲導(dǎo)入穗和對(duì)照穗，下年種植選擇變異株； 53.篩選性狀具有變異的植株 將收獲的導(dǎo)入穗按穗及對(duì)照穗進(jìn)行無(wú)土育秧，當(dāng)秧苗長(zhǎng)至IOcm左右，分別按穗行單株植入田間，以受體材料作為對(duì)照篩選性狀具有變異的植株，并將變異株繼續(xù)種植，直到后代性狀穩(wěn)定； 54.對(duì)篩選的變異植株進(jìn)行分子鑒定 將篩選的具有變異性狀的植株利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行分子鑒定，以供、受體為對(duì)照，鑒定變異植株中有無(wú)供體野生稻的DNA片段進(jìn)入。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用野生稻資源創(chuàng)制粳型水稻新種質(zhì)的育種方法，其特征在于:所述粳型水稻是寧粳16號(hào)或?qū)幘?3號(hào)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用野生稻資源創(chuàng)制粳型水稻新種質(zhì)的育種方法，其特征在于:所述提取緩沖液是 100mmol/L Tris-HCl pH8.0,500mmol/L NaCl, 50mmol/L EDTAρΗ8.0，質(zhì)量濃度為1.5% SDS0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用野生稻資源創(chuàng)制粳型水稻新種質(zhì)的育種方法，其特征在于:提取DNA的材料為孕穗期的葉片，DNA導(dǎo)入時(shí)期在孕穗后期，花粉發(fā)育到單核中晚期，外部形態(tài)表現(xiàn)為穗頂部離劍葉葉枕2cm ;導(dǎo)入部位為水稻穗頸節(jié)；DNA緩沖液為添加了 2mg/mlCaCl2 的 0.1 X SSC 緩沖液。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103820499SQ201410051828
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月17日
【發(fā)明者】李樹華, 楊慶文, 呂學(xué)蓮, 白海波, 韓國(guó)敏, 李華, 馬靜, 鄭國(guó)寶, 朱永興, 張萬(wàn)霞, 孔德杰, 嚴(yán)奉坤, 王娜, 張巖, 關(guān)雅靜 申請(qǐng)人:寧夏農(nóng)林科學(xué)院