專利名稱：一種提高植物鉀利用率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域；涉及提高植物抗低鉀脅迫，提高植物鉀利用率的新方法；具體涉及利用β-氨基丁酸(DL-3-氨基丁酸，β-Amino-butyric acid, BABA)提高植物在低鉀脅迫下對鉀素的吸收利用，促進(jìn)植物的生長。
背景技術(shù)：
β -氨基丁酸(DL-3-氨基丁酸，β -Amino-butyric acid, BABA)是首先從經(jīng)暴曬的番茄根系中分離得到的一種次生代謝非蛋白氨基酸，能誘導(dǎo)多種作物產(chǎn)生對多種病害的抗性，BABA除了能提高植物抗生物脅迫的能力，對于各種非生物脅迫，如干旱和高鹽，也可以通過ABA依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮作用。BABA還能通過谷胱甘肽途徑提高擬南芥抗重金屬鎘的脅迫。有報(bào)道還指出，BABA能提高擬南芥的耐熱性。近年來的研究，越來越顯示出BABA作為一種高效、廣譜的植物誘抗劑的潛能，它不僅具有廣譜的誘導(dǎo)抗病活性，而且與多種化合物具有協(xié)同增效作用，是一種極具潛力的植物誘抗劑。近年來國內(nèi)外許多學(xué)者對BABA的誘導(dǎo)抗性尤其是誘導(dǎo)抗病性做了大量的研究工作，取得了一定的成果，但BABA的誘抗機(jī)理還有待進(jìn)一步研究，對BABA抗低鉀脅迫研究較少。鉀是植物正常生長發(fā)育必需的大量營養(yǎng)元素之一，可占到植物干重的2% 10 %，對植物的生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用，鉀對植物體內(nèi)許多酶有“激活”作用，對蛋白質(zhì)的合成、植物的經(jīng)濟(jì)用水、葉片糖分的輸送以及提高作物抗逆性等方面都起著很重要的作用。鉀對酶的活化作用是最重要的生理功能之一，K+是植物體內(nèi)60多種酶的活化劑。這些酶主要包括氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶和合成酶。鉀參與蛋白質(zhì)合成的多個步驟，包括核糖體的合成、tRNA的合成、tRNA與核糖體的結(jié)合、氨酰-tRNA的形成、肽基轉(zhuǎn)移、 GTP的利用、mRNA的移位等，鉀對提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性也起有很重要的作用。鉀是植物細(xì)胞中主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。液泡中的K+主要起滲透劑的作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞膨壓和滲透壓，增強(qiáng)植物的保水和吸水能力。K+通過選擇性通道出入保衛(wèi)細(xì)胞，改變滲透勢而導(dǎo)致水分的流動， 引起氣孔開閉，控制植物的蒸騰作用，調(diào)節(jié)體內(nèi)的水分平衡。鉀通過多方面影響光合作用。 鉀促進(jìn)合成光合作用反應(yīng)需要的ATP，提高葉綠素含量、保持葉綠體的片層結(jié)構(gòu)，提高光合作用中1，5-二磷酸核酮糖羧化酶的活性，促進(jìn)氣孔開放從而增加葉片對CO2的吸收，平衡葉綠體中光合磷酸化所需的電荷，提高光誘導(dǎo)產(chǎn)生的質(zhì)子流跨膜運(yùn)輸?shù)?。鉀能促進(jìn)光合作用的產(chǎn)物(蔗糖和氨基酸)從韌皮部向生理反應(yīng)庫(果實(shí)、根系、塊莖、種子和籽粒)運(yùn)輸，對存儲的礦物質(zhì)的移動和碳水化合物向儲藏器官的運(yùn)輸也有重要的作用。鉀能改善植物的抗病性結(jié)構(gòu)和抗蟲的次生代謝，增強(qiáng)植物抗病蟲害能力。鉀對植物抵抗環(huán)境脅迫有良好的作用，能增強(qiáng)植物抗逆能力，所以缺鉀時，植株莖桿柔弱，易倒伏，抗旱、抗寒性降低，葉片失水，蛋白質(zhì)、葉綠素破壞，葉色變黃而逐漸壞死，缺鉀有時也會出現(xiàn)葉緣焦枯，生長緩慢的現(xiàn)象，由于葉中部生長仍較快，所以整個葉子會形成杯狀彎曲，或發(fā)生皺縮。全國耕地約有 1/4-1/5的土壤普遍缺鉀或嚴(yán)重缺鉀，而我國鉀礦資源嚴(yán)重匱乏，鉀肥的生產(chǎn)能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求，所需的鉀肥90%依賴于進(jìn)口。另外由于化學(xué)肥料迅速普及、單產(chǎn)水平
3不斷提高、鉀肥施用量不足、有機(jī)肥施用量不斷減少，導(dǎo)致農(nóng)田養(yǎng)分收支失衡，鉀素嚴(yán)重虧缺，表現(xiàn)為土壤鉀含量下降，缺鉀面積不斷擴(kuò)大。如何提高植物鉀含量成為目前亟需解決的問題。目前，提高植物鉀含量的途徑主要有增加鉀肥用量、改進(jìn)鉀肥施用技術(shù)、開發(fā)利用生物鉀肥、減少土壤固鉀、施用激素、篩選高鉀含量植物、轉(zhuǎn)基因等方法。通過土壤改良和增施鉀肥來改善作物鉀營養(yǎng)狀況雖能取得較好效果，但這既增加生產(chǎn)成本，又造成鉀資源的進(jìn)一步消耗，另外過多施用化學(xué)肥料會破壞土壤結(jié)構(gòu)，造成土壤板結(jié)，不利于作物生長。因此尋找一條提高土壤中鉀素利用率的新途徑勢在必行，我們通過研究證明BABA能誘導(dǎo)鉀吸收相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)植物對鉀的吸收利用，提高植物體內(nèi)的鉀含量，誘導(dǎo)植物抗低鉀脅迫，促進(jìn)植物的生長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種簡便有效，且適于大面積推廣應(yīng)用的提高植物鉀利用率，提高植物抗低鉀脅迫能力的全新方法。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下
一種提高植物鉀利用率的方法是用濃度0. 2-6mmol/L β -氨基丁酸(BABA)水溶液浸泡種子，浸泡時間Id ；或?qū)?-6葉期的植株進(jìn)行葉面噴施。在0. lmmol/L低鉀脅迫條件下，采用0. 2mmol/L β -氨基丁酸溶液浸泡萌發(fā)的種子 IcL在0. 5mmol/L低鉀脅迫條件下，采用5mmol/L β -氨基丁酸溶液對5_6葉期的植株進(jìn)行葉面噴施。適宜濃度β-氨基丁酸(BABA)能促進(jìn)植物根生長，葉綠素含量增加，從而促進(jìn)了植物生長。BABA通過影響鉀吸收相關(guān)基因的表達(dá)，提高植物在低鉀脅迫下對鉀素的吸收利用；通過影響抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)，提高植物對低鉀脅迫的抗性；通過誘導(dǎo)積累脯氨酸保護(hù)低鉀導(dǎo)致的葉片脫水；通過誘導(dǎo)過氧化物酶(POD)與過氧化氫酶(CAT)活性提高對低鉀產(chǎn)生的活性氧的清除能力，從而進(jìn)一步影響植物的產(chǎn)量和品質(zhì)。本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1)使用范圍廣，不僅在模式植物擬南芥中獲得了成功，在煙草中也有作用；2)提高鉀吸收相關(guān)基因4_妨和M^/的表達(dá)，提高作物對鉀肥的利用率，使植物體內(nèi)的鉀含量提高49. 8%-114. 19%，解決我國鉀肥利用率普遍偏低的問題，從而有利于作物產(chǎn)量及品質(zhì)的提高；3)在提高作物吸鉀的同時，誘導(dǎo)抗逆物質(zhì)脯氨酸含量的提高，激活抗氧化酶POD和CAT的活性，提高作物抗各種脅迫的能力，減少農(nóng)藥的使用；4) β-氨基丁酸(BABA)是一種存在于自然界的非蛋白氨基酸，綠色環(huán)保型物質(zhì)，對人畜無害。5)操作簡便，易于大面積推廣。本發(fā)明對于改善我國農(nóng)田土壤普遍缺鉀導(dǎo)致作物產(chǎn)量和品質(zhì)不高的現(xiàn)狀具有重要的意義，將給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。


圖1在低鉀脅迫下β -氨基丁酸(BABA)對擬南芥葉綠素含量的影響。圖2在低鉀脅迫下β -氨基丁酸(BABA)對擬南芥生長的影響表型圖。圖3在低鉀下β -氨基丁酸(BABA)對擬南芥根生長影響的表型圖。
圖4在低鉀脅迫下β -氨基丁酸(BABA)對擬南芥?zhèn)雀L度的影響。圖5在低鉀脅迫下β -氨基丁酸(BABA)對擬南芥?zhèn)雀鶖?shù)的影響。圖6在低鉀脅迫下β -氨基丁酸(BABA)對擬南芥根中K含量的影響。圖7在低鉀脅迫下β -氨基丁酸(BABA)對擬南芥地上部分鉀含量的影響。圖8在低鉀脅迫下β -氨基丁酸(BABA)對Ji徹U和MX/基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。圖9不同β -氨基丁酸(BABA)濃度處理下煙草葉片的外觀表型。圖10不同β-氨基丁酸(BABA)濃度下葉片的葉綠素含量。圖11 β -氨基丁酸(BABA)對煙草根長的影響。圖12 β -氨基丁酸(BABA)對煙草游離脯氨酸含量的影響。圖13 β -氨基丁酸(BABA)對煙草過氧化物酶(POD)含量的影響。圖14 β -氨基丁酸(BABA)對煙草過氧化氫酶(CAT)含量的影響。圖15 β -氨基丁酸(BABA)對煙草鉀含量的影響。圖16 β -氨基丁酸(BABA)對鉀吸收相關(guān)基因表達(dá)的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。鉀對煙草尤為重要，除了影響其正常生長外，是煙草的一個重要的品質(zhì)指標(biāo)，常被稱為煙草的“品質(zhì)元素”。擬南芥是一種模式植物，廣泛用于植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)等研究領(lǐng)域。擬南芥的大多數(shù)基因在其它植物中都能找到，有關(guān)擬南芥的任何發(fā)現(xiàn)都能應(yīng)用于其它植物研究，本發(fā)明首先以擬南芥為材料，研究了 β-氨基丁酸(BABA)對擬南芥抗低鉀脅迫的保護(hù)作用，然后推廣到煙草上，研究氨基丁酸(BABA)對煙草抗低鉀脅迫的誘導(dǎo)作用。實(shí)施例1
β -氨基丁酸(BABA)保護(hù)擬南芥抗低鉀脅迫
以野生型擬南芥為實(shí)驗(yàn)材料，種子表面消毒后放在含有1%的蔗糖的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 培養(yǎng)皿先置于4°C條件下黑暗處理3天，然后放置在22°C條件下培養(yǎng)。光照強(qiáng)度是IOOymol m_2 s—1，并采用長日照照射(16小時光照/8小時黑暗)。低鉀條件的濃度是通過測試野生型擬南芥播種在含不同鉀濃度的培養(yǎng)基中的表型來確定的。低鉀培養(yǎng)基通過MS培養(yǎng)基調(diào)制MS培養(yǎng)基中的KNO3和KH2PO4分別用NH4NO3和NHJ2PO4替代，加0. 8% (w/v)的不含鉀的瓊脂，加KNO3并用原子吸收分光光度法確定最終的鉀濃度為100 μ mol。種子在常鉀和低鉀(0. lmmol/L) MS培養(yǎng)基上萌發(fā)5d后，用濃度0. 2mmol/L的 β-氨基丁酸(BABA)和水(對照)浸泡ld，再轉(zhuǎn)移到常鉀和低鉀培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)6d后供試驗(yàn)用。 1. β -氨基丁酸(BABA)增強(qiáng)擬南芥對低鉀脅迫的抗性
提取擬南芥葉片中的葉綠素用于測定。測定結(jié)果如圖1，在低鉀脅迫下，經(jīng)過BABA處理的植株葉片葉綠素含量明顯高于對照。在正常生長條件下，經(jīng)過BABA處理的植株和對照在葉綠素含量方面沒有明顯(Ρ<0.(^)差別。這個結(jié)論說明BABA保護(hù)擬南芥對抗低鉀脅迫。 當(dāng)水處理的幼苗受到低鉀脅迫時，和對照組幼苗(水處理的不受低K+脅迫的幼苗)相比，顯示出葉片失綠癥狀(典型的鉀缺陷乏癥)，經(jīng)過BABA預(yù)處理這些失綠的植物葉片可以恢復(fù)，如圖2。2. β -氨基丁酸(BABA)對低鉀下側(cè)根生長的影響
如圖3所示，低鉀影響根的生長，測量結(jié)果如圖4和圖5所示，在低鉀下，BABA處理的幼苗，與對照相比，側(cè)根長度和數(shù)目都有增加，說明BABA能提高擬南芥抗低鉀脅迫的能力。3. β -氨基丁酸(BABA)對低鉀下擬南芥鉀積累的影響
對擬南芥根和地上部的鉀含量進(jìn)行測定。如圖6所示，在低鉀脅迫下，經(jīng)過BABA處理的比對照的植株，根系中的鉀含量有明顯提高(Ρ<0. 05)。相反，在常鉀條件下，經(jīng)過BABA處理的和對照的植株鉀含量卻沒有明顯差別。如圖7所示，莖中也是類似的結(jié)果。結(jié)果表明， 低鉀下BABA能提高擬南芥的鉀含量。4.低鉀下β -氨基丁酸(BABA)對力徹U和LKSl兩基因表達(dá)水平的影響 AtHAK5已被確定為植物鉀轉(zhuǎn)運(yùn)載體，MX/基因編碼的蛋白激酶CIH(23，在低鉀條件下
通過激活JA/7調(diào)節(jié)鉀的吸收。如圖8所示，常鉀下對照或BABA處理的幼苗中Ji徹U基因的轉(zhuǎn)錄水平非常低，而 LKSl基因在這些植株中的表達(dá)水平相對較高。在對照和BABA處理的幼苗中
表達(dá)之間沒有明顯的差異。然而，低鉀脅迫下，經(jīng)BABA處理的幼苗中Ji徹U和ZU7兩基因的表達(dá)明顯比對照組的高。這些結(jié)果表明，在低鉀脅迫下，由BABA引起的A徹U和MX/ 兩基因的活化是與鉀吸收的增加相關(guān)的。實(shí)施例2
以煙草普通栽培種云煙97為實(shí)驗(yàn)材料，研究BABA對煙草抗低鉀脅迫的作用 1. β -氨基丁酸(BABA)誘導(dǎo)煙草抗低鉀脅迫適宜濃度的篩選將煙草種子分別播于常鉀和低鉀(0. 5mM/L)培養(yǎng)液澆灌的營養(yǎng)土中，5-6葉期時分別用 0. 5mM/L, ImM/L, 3 mM/L, 5 mM/L, 7 mM/L, 10 Mm/L 的 β -氨基丁酸(BABA)水溶液噴霧處理，以噴清水為對照，2-3d后根據(jù)葉片的表觀變化如圖9所示，確定最適的BABA濃度。從圖中可以看出，BABA濃度低于5mmol/L時，葉面沒有變化，在BABA濃度為7mmol/L時，葉面開始出現(xiàn)少量失綠斑點(diǎn)，BABA為lOmmol/L時有大量的失綠斑點(diǎn)出現(xiàn)，所以我們確定BABA的最適濃度為5mmol/L。2. β -氨基丁酸(BABA)對煙草根生長的影響
在BABA處理后1周觀察煙草根長的變化。將塑料盆缽浸于水中，使土壤基質(zhì)松動，小心洗去煙草根部的蛭石，比較BABA處理后煙草的根長，如圖10，從圖中可知，BABA處理后常鉀和低鉀下根長都增加。3. β -氨基丁酸(BABA)處理后煙草體內(nèi)生理生化指標(biāo)的變化 3. 1對葉綠素含量的影響
采用95%乙醇提取葉綠素，用分光光度法測定葉綠素的含量。取葉片，洗凈、烘干、去大葉脈剪碎，混勻。稱剪碎樣品0. 2g，放入研缽中，加入少量石英砂、碳酸鈣、2 3ml 95%乙醇研磨，過濾、定容，用分光光度計(jì)測OD652，計(jì)算結(jié)果。結(jié)果如圖11所示，BABA能提高常鉀和低鉀下煙草的葉綠素含量，在常鉀和低鉀下分別提高了 19. 25%和27. 43%。3. 2游離脯氨酸含量的變化
用5mmol/L的BABA噴施煙草后2_3d，取不同處理的剪碎煙草葉片各0. 3g，置于試管中，加入5ml 3%磺基水楊酸溶液于沸水浴中浸提15min。取出試管，過濾，濾液待測。吸取2ml濾液，加入2ml冰乙酸和3ml酸性茚三酮，混勻后加硅膠塞，在沸水中加熱30min，冷卻。 向各管加入5ml甲苯以萃取紅色物質(zhì)。避光靜置20min以上。待分層后，用吸管吸取甲苯層，以1號管為對照在波長520nm下比色。計(jì)算結(jié)果如圖12所示，在常鉀和低鉀下，BABA處理后脯氨酸分別提高了 34. 56%和183. 63%，說明BABA能誘導(dǎo)煙草抗低鉀脅迫。3. 3過氧化物酶活性變化
用5mmol/l的BABA噴施煙草后2_3d，取5g煙草葉片，切碎，置于預(yù)冷研缽中，用適量預(yù)冷的0. 05mol/L pH6. 0磷酸緩沖液緩沖液勻漿，離心，上清液倒入25ml容量瓶，殘?jiān)?5ml緩沖液提2次，上清液并入容量瓶，定容。在Icm比色皿中加入反應(yīng)液2. 9ml0. 05mol/ L磷酸緩沖液、0.5ml洲過氧化氫、0.1ml洲愈創(chuàng)木酚、0. Iml酶液。以不加酶液的比色皿調(diào)零，在470nm處測定OD值。以每分鐘A47tl變化0. 01為1個酶活性單位(U)。測定結(jié)果如圖13所示，BABA可提高常鉀和低鉀下的POD活性，在常鉀和低鉀下分別提高了 66. 67%和 84. 38%，在低鉀下POD活性提高得更明顯，說明BABA能誘導(dǎo)煙草抗低鉀脅迫。3.4過氧化氫酶活性變化
用5mmol/l的BABA噴施煙草后2_3d，稱取新鮮煙草葉片0. 5g，置于研缽中，加入2_;3ml 4°C下預(yù)冷的pH7. 0磷酸緩沖液(含1%聚乙烯吡咯烷酮)和少量石英砂勻漿后，轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，沖洗研缽數(shù)次，合并沖洗液，定容至刻度?；旌暇鶆?，將容量瓶置于5°C冰箱中靜置 lOmin，取上部澄清液離心，上清液即為過氧化氫酶粗提液，5°C保存?zhèn)溆谩ＨOml試管，力口入反應(yīng)體系1ml蒸餾水、1. 5ml pH7. 8磷酸緩沖液、0. 2ml粗酶液。以蒸餾水為參照。25°C預(yù)熱后，加入0.3ml 0. lmol/L H2O2，240nm下測吸光度。每隔Imin讀一次，共測4次。測定結(jié)果如圖14所示，BABA可提高常鉀和低鉀下的CAT活性，在常鉀和低鉀下分別提高了 10. 96% 和32. 46%，低鉀下提高更多。3. 5鉀含量的變化
BABA處理后一周，用原子吸收分光光度法測定鉀含量。稱取樣品Ig于錐形瓶中，加入 20-30ml濃硝酸，浸泡過夜。第二天將錐形瓶置于電爐上加熱消化，直至無色透明。加幾毫升去離子水，加熱以除去多余的硝酸。待錐形瓶中的液體接近5-10ml時，取下冷卻。用去離子水洗并轉(zhuǎn)移到50ml容量瓶中，定容至刻度。按上述操作做試劑空白測定。測定結(jié)果如圖 15，BABA可提高煙草的鉀含量，在常鉀和低鉀下分別提高21. 49%和114. 19%。這表明BABA 對低鉀下煙草鉀含量提高得更明顯。2. 5鉀吸收相關(guān)蛋白基因表達(dá)的變化
由圖16可以看出，徹表達(dá)量在低鉀下高于對照組，說明低鉀可以誘導(dǎo)徹基因的表達(dá)。用BABA處理后，徹的表達(dá)量提高。說明BABA參與了 HAK5調(diào)控通路，并與低鉀信號具有協(xié)同增效的作用；表達(dá)量在低鉀下高于對照組，說明低鉀可以誘導(dǎo)的表達(dá)。 用BABA處理后，NtLKS的表達(dá)量提高，與徹f的表達(dá)模式相近，說明BABA參與了 NtLKS調(diào)控通路，并與低鉀信號具有協(xié)同增效的作用-MTl在表達(dá)水平無顯著差異，說明遞77不參與轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，而可能是一種翻譯后的調(diào)節(jié)，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚不能證明；表達(dá)量在低鉀下提高，說明低鉀可以誘導(dǎo)NtKC的表達(dá)。用BABA處理后，Λ/ 從的表達(dá)量高于對照組， 說明BABA與低鉀信號都參與基因的調(diào)控通路。
權(quán)利要求
1.一種提高植物鉀利用率的方法，其特征在于用濃度0.2-6mmol/L β -氨基丁酸 (BABA)水溶液浸泡種子，浸泡時間Id ；或?qū)?-6葉期的植株進(jìn)行葉面噴施。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高植物鉀利用率的方法，其特征在于在0.lmmol/L 低鉀脅迫條件下，采用0. 2mmol/Li3-氨基丁酸溶液浸泡萌發(fā)的種子Id。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高植物鉀利用率的方法，其特征在于在0.5mmol/L 低鉀脅迫條件下，采用5mmol/Li3 -氨基丁酸溶液對5_6葉期的植株進(jìn)行葉面噴施。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高植物鉀利用率的方法。具體方法是用濃度0.2-10mmol/Lβ-氨基丁酸(BABA)水溶液浸泡種子，或?qū)?-6葉期的植株進(jìn)行葉面噴施。通過施用β-氨基丁酸，可以提高在低鉀脅迫下植物的葉綠素含量，促進(jìn)根生長，誘導(dǎo)抗逆指標(biāo)游離脯氨酸含量的提高，增加植物保護(hù)酶過氧化物酶和過氧化氫酶的活性，增強(qiáng)鉀吸收相關(guān)基因的表達(dá)，提高作物對鉀肥的利用率，有利于作物產(chǎn)量及品質(zhì)的提高，而且操作簡便，易于大面積推廣使用，減少農(nóng)藥的使用，對環(huán)境無污染，會對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益，對發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)等將具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
文檔編號A01G7/06GK102498782SQ20111031082
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月14日
發(fā)明者盧云峰, 曹樹青, 楊潤舟, 江力 申請人:合肥工業(yè)大學(xué)