一種離體誘導(dǎo)同源四倍體青花菜的育種方法
【專利摘要】本發(fā)明屬農(nóng)作物育種領(lǐng)域，公開(kāi)了一種離體誘導(dǎo)同源四倍體青花菜的育種方法。該育種方法是以青花菜子葉期保留下胚軸0.4‐0.6cm的幼苗為外植體，將外植體接種至含秋水仙素的雙層分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)45‐50h，直接誘導(dǎo)產(chǎn)生四倍體芽，進(jìn)而可以快速穩(wěn)定的獲得同源四倍體青花菜。本發(fā)明首次采用液體培養(yǎng)基（添加秋水仙素）與固體培養(yǎng)基（不添加秋水仙素）雙層誘導(dǎo)并結(jié)合處理青花菜子葉期保留下胚軸0.4‐0.6cm的幼苗的無(wú)性多倍化育種途徑，獲得四倍體青花菜新種質(zhì)。其優(yōu)點(diǎn)是誘導(dǎo)率高，嵌合體少，死亡率低，污染率低，并且獲得的四倍體材料能通過(guò)分生增殖獲得大量的四倍體植株，極大的縮短了誘導(dǎo)時(shí)間。
【專利說(shuō)明】一種離體誘導(dǎo)同源四倍體青花菜的育種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)作物育種領(lǐng)域，涉及一種離體誘導(dǎo)同源四倍體青花菜的育種方法，專用于四倍體青花菜的選育。
【背景技術(shù)】
[0002]青花菜(BrassicaoleraceaL var italica Plenck)又名西蘭花、花椰菜、綠菜花，隸屬于十字花科蕓薹屬，是十字花科中甘藍(lán)中的一個(gè)變種，它主要以綠色花球?yàn)橹饕漠a(chǎn)品器官。其天然種及各栽培種都是二倍體，即2n=2x=18。青花菜是一種適宜染色體加倍改良的作物(姬丹丹，趙曉明.2007.青花菜的抗癌作用及藥用多倍體育種研究前景.中國(guó)蔬菜，(8):39-41.)。目前我國(guó)大多都是運(yùn)用一些優(yōu)勢(shì)育種、常規(guī)育種、組織培養(yǎng)等育種方法培育出許多優(yōu)質(zhì)的二倍體青花菜品種，但對(duì)于具有更大應(yīng)用價(jià)值的多倍體青花菜品種的培育卻比較匱乏?，F(xiàn)有技術(shù)中有發(fā)明人在國(guó)內(nèi)外首次人工誘變四倍體青花菜“春綠”新品種(張杰.同源四倍體青花菜的創(chuàng)制及其生物學(xué)特性的研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.);利用秋水仙素離體誘導(dǎo)獲得四倍體青花菜“海茲”新品種(張蜀寧，張麗麗，唐君，孔艷娥，侯喜林.2009.秋水仙素離體誘導(dǎo)同源四倍體青花菜.園藝學(xué)報(bào)，36(11):1681-1684.)。青花菜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其豐富，特別是它的藥用價(jià)值，它含有一種具有較強(qiáng)的抗癌作用的物質(zhì)“蘿
卜硫素”。因此，對(duì)于青花菜多倍體育種的研究是非常有意義的，并且前景非常廣闊。
[0003]多倍體是指具有2個(gè)以上基本染色體組成的個(gè)體。多倍體多個(gè)染色體組所產(chǎn)生的累積效應(yīng)使其生物量、 礦物質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分增加，在性狀上表現(xiàn)為葉大、花大、莖粗色深、細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)含量較高以及抗逆性增強(qiáng)(呂新業(yè)，王濟(jì)民.1997.我國(guó)糧食供需預(yù)測(cè)[J].農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究，18 (1):12-16.)。而目前多倍體誘導(dǎo)方法用的最多的就是秋水仙素誘導(dǎo)法。秋水仙素誘導(dǎo)可分為離體條件下的誘導(dǎo)和非離體條件下的誘導(dǎo)。非離體條件下的誘導(dǎo)有:浸潰法、注射法、瓊脂法、滴液法等。張紅亮等利用秋水仙素點(diǎn)滴處理子葉期二倍體蘿卜莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，從而獲得“穿心紅”同源四倍體蘿卜(張紅亮.“穿心紅”同源四倍體蘿卜的創(chuàng)制及其生理生化特性研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.);劉學(xué)岷等通過(guò)滴液法和浸根法兩種方法對(duì)二倍體大白菜“東方夏王”進(jìn)行秋水仙素加倍誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)滴液法的誘導(dǎo)率相對(duì)于浸根法來(lái)說(shuō)，效果更好，誘導(dǎo)率更高(劉學(xué)岷，曹彩霞，王玉海，牟金貴，王明秋，劉曉東.2004.大白菜四倍體誘導(dǎo)方法的研究.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，8 (3):14-16.);雖然這些方法在不同程度上產(chǎn)生了加倍的效果，但是存在獲得的多倍體株數(shù)少，誘導(dǎo)率低，環(huán)境不易控制，工作量大，嵌合體較多等問(wèn)題。相對(duì)于非離體條件下的誘導(dǎo)，離體條件下的誘導(dǎo)可能是一個(gè)更好的途徑。離體條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞或組織染色體加倍，其途徑主要有兩條:一是浸泡法，即先用秋水仙素溶液(谷曉峰，羅正榮.2003.秋水仙素處理-羅田甜柿.獲得12倍體再生植株.園藝學(xué)報(bào)，30(3):325-327.)或者含有秋水仙素的液體培養(yǎng)基(張素芝，李紀(jì)蓉.2006.秋水仙素誘導(dǎo)大蒜四倍體的研究.核農(nóng)學(xué)報(bào)，20(4):303-308.)處理培養(yǎng)材料，然后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基；二是混培法，即在含秋水仙素的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)一段時(shí)間，誘導(dǎo)加倍，再轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(孫敏紅，張蜀寧，鄧云.2005.誘導(dǎo)二倍體和同源四倍體白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系不定芽培養(yǎng)基的篩選.植物生理學(xué)通訊，41 (6):741-744.)。離體條件下誘導(dǎo)多倍體大多都是用浸泡法，因?yàn)榛炫喾ㄕT導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)，誘導(dǎo)率低，浸泡法能獲得較多的多倍體株數(shù)，誘導(dǎo)率較高，能大大縮短誘導(dǎo)所需時(shí)間，并且能夠克服常規(guī)誘變育種易受環(huán)境條件影響的難題。但其會(huì)存在易污染，死亡率高，還有長(zhǎng)時(shí)間的浸泡處理可能會(huì)造成缺氧等問(wèn)題。范國(guó)強(qiáng)等通過(guò)雙層培養(yǎng)基(上、下層分別為IOml和30ml秋水仙素濃度相同的器官直接發(fā)生的液體(不加瓊脂粉)和固體培養(yǎng)基(上面鋪2層無(wú)菌濾紙))對(duì)蘭考泡桐的葉片進(jìn)行誘導(dǎo)加倍，但因其下層固體培養(yǎng)基也含有相同濃度的秋水仙素，所以此種方法類(lèi)似于浸泡法，在一定程度上并不能明顯降低秋水仙素的毒害作用，并且此類(lèi)方法上下層功能分配不合理，下層的固體培養(yǎng)基在雙層誘導(dǎo)中的作用范圍太窄。同時(shí)利用葉片作為外植體，如若秋水仙素濃度過(guò)高，則會(huì)在培養(yǎng)過(guò)程中褐化死亡，并且以葉片作為外植體，要經(jīng)過(guò)產(chǎn)生愈傷組織，再產(chǎn)生胚狀體，過(guò)程較為繁瑣。(范國(guó)強(qiáng)，楊志清，曹艷春，劉飛，賈峰.2006.秋水仙素誘導(dǎo)蘭考泡桐同源四倍體.核農(nóng)學(xué)報(bào)，20(6):473-476.)。離體條件下的誘導(dǎo)，外植體材料的選擇多為葉片、圓球莖、從芽等；目前為止還沒(méi)有在離體的條件下用子葉期保留下胚軸0.4 -0.6cm的幼苗進(jìn)行誘導(dǎo)加倍的報(bào)道。通過(guò)離體組培誘導(dǎo)獲得多倍體的途徑不僅與誘導(dǎo)方式和外植體有關(guān)，還與品種，培養(yǎng)環(huán)境、秋水仙素濃度和誘導(dǎo)時(shí)間等有關(guān)。不同品種、不同外植體及不同誘導(dǎo)方式對(duì)應(yīng)不同的秋水仙素濃度和誘導(dǎo)時(shí)間。并且不同的品種其最適的培養(yǎng)環(huán)境也不同，在其最適的培養(yǎng)環(huán)境里對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)加倍可以增加染色體的加倍效率。所以，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)上的不足，我們提出一種新的無(wú)性多倍化育種技術(shù)。目前國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有技術(shù)中還沒(méi)有采用液體培養(yǎng)基(添加秋水仙素)與固體培養(yǎng)基(不添加秋水仙素)雙層誘導(dǎo)并結(jié)合處理子葉期保留下胚軸0.4 - 0.6cm的幼苗誘導(dǎo)二倍體青花菜獲得新四倍體的無(wú)性多倍化育種技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種離體誘導(dǎo)同源四倍體青花菜的育種方法。
[0005]本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0006]一種離體誘導(dǎo)同源四倍體青花菜的育種方法，包括:以青花菜子葉期保留下胚軸0.4 - 0.6cm的幼苗為外植體，將外植體接種至含秋水仙素的雙層分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)45 - 50h，再經(jīng)再生增殖直接產(chǎn)生四倍體芽，進(jìn)而經(jīng)后續(xù)培養(yǎng)獲得同源四倍體青花菜；其中，所述的含秋水仙素的雙層分化培養(yǎng)基由上層:MS基本培養(yǎng)基+ΝΑΑ0.05 - 0.1mg/L+6 - BA2.5-3mg/L+50 - 60ml/L 的椰汁 +300 - 350mg/L 秋水仙素 +30g/L 蔗糖，pH5.8 ;及下層:MS 基本培養(yǎng)基 +ΝΑΑ0.05 - 0.lmg/L+6 - BA2.5_3mg/L+50 - 60ml/L 的椰汁 +30g/L 蔗糖+7.8g/L 瓊脂，pH5.8 組成。
[0007]所述的同源四倍體青花菜的育種方法，所述的方法包括如下步驟:
[0008]I)雙層培養(yǎng)誘導(dǎo)多倍體化:切取青花菜子葉期保留下胚軸0.4 - 0.6cm的幼苗，預(yù)培養(yǎng)2d后,接種至含秋水仙素的雙層分化培養(yǎng)基中，置于搖床上處理45 _50h,培養(yǎng)溫度維持在23±2°C，光周期維持在16/8h白/黑周期，光強(qiáng)度維持在20001x ；
[0009]2)再生增殖:上一步處理后的外植體經(jīng)無(wú)菌水沖洗3次后轉(zhuǎn)到分化增殖培養(yǎng)基上分化增殖獲得四倍體芽，所使用的分化增殖培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+ΝΑΑ0.05 - 0.1mg/L+6 - BA2.5-3mg/L+ 椰汁 50 - 60ml/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7.8g/L，pH5.8 ;培養(yǎng)溫度維持在23±2°C，光周期維持在16/8h白/黑周期，光強(qiáng)度維持在20001x ；
[0010]3)再生植株的獲得:40d后，將四倍體芽培養(yǎng)在無(wú)激素的MS基本培養(yǎng)基+80 -100ml/L椰汁+0.5g/L酸水解酪蛋白+蔗糖30g/L+瓊脂7.8g/L的培養(yǎng)基中10 -15d，獲得再生植株，培養(yǎng)溫度維持在23±2°C，光周期維持在16/8h白/黑周期，光強(qiáng)度維持在20001x ；
[0011]4)再生植株的生根和馴化:將再生植株轉(zhuǎn)入1/2MS基本培養(yǎng)基+NAA0.2mg/L+椰汁20 -30ml/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.8g/L的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度維持在23±2°C，光周期維持在16/8h白/黑周期，光強(qiáng)度維持在20001x培養(yǎng)15~20d生根，然后馴化、練苗并移栽；
[0012]5)再生植株的鑒定:移栽之前，取再生植株的根尖，在流式細(xì)胞儀鑒定后進(jìn)行染色體鑒定，移栽I個(gè)月后對(duì)再生植株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、氣孔鑒定和流式細(xì)胞儀鑒定。
[0013]所述的同源四倍體青花菜的育種方法中，所述的含秋水仙素的雙層分化培養(yǎng)基中秋水仙素濃度優(yōu)選為300mg/L,外植體在含秋水仙素的雙層分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選 48h。
[0014]所述的同源四倍體青花菜的育種方法中，所述的含秋水仙素的雙層分化培養(yǎng)基中上層液體培養(yǎng)基的體積與下層固體培養(yǎng)基的體積的比例為2:9 - 2:7，將外植體的下胚軸垂直插入到固體培養(yǎng)基里，子葉期莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)浸在上層液體培養(yǎng)基中，而子葉暴露于液體培養(yǎng)基上面。
[0015]所述的同源四倍體青花菜的育種方法，所述的青花菜子葉期保留下胚軸
0.4-0.6cm的幼苗優(yōu)選通過(guò)`以下方法獲得:將青花菜種子用75%酒精處理lmin，0.1%升汞處理15min，無(wú)菌水沖洗3 - 4次，接種到無(wú)激素的MS基本培養(yǎng)基+椰汁20 - 30ml/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.8g/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6d，幼苗子葉完全展開(kāi)，取出無(wú)菌苗，在距離子葉柄末端0.4 -0.6cm下胚軸處切開(kāi)，保留帶有子葉的部分作為外植體；培養(yǎng)溫度維持在23±2°C，光周期維持在16/8h白/黑周期，光強(qiáng)度維持在20001x。
[0016]所述的同源四倍體青花菜的育種方法，所述的預(yù)培養(yǎng)方法優(yōu)選:切取子葉期保留下胚軸0.4 -0.6cm的幼苗接種到MS基本培養(yǎng)基+ΝΑΑ0.05 -0.lmg/L+6 -BA2.5_3mg/L+椰汁50 - 60ml/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.8g/L的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2天，培養(yǎng)溫度維持在23±2°C，光周期維持在16/8h白/黑周期，光強(qiáng)度維持在20001x。
[0017]本發(fā)明的有益效果:
[0018]本發(fā)明首次采用液體培養(yǎng)基(添加秋水仙素)與固體培養(yǎng)基(不添加秋水仙素)雙層誘導(dǎo)并結(jié)合處理子葉期保留下胚軸0.4 -0.6cm的幼苗的無(wú)性多倍化育種途徑，獲得四倍體青花菜新種質(zhì)。與有性多倍化的方法相比誘導(dǎo)率更高，能快速穩(wěn)定的獲得大量四倍體植株。在現(xiàn)代多倍化技術(shù)研究中，秋水仙素濃度和誘導(dǎo)時(shí)間一直是影響誘導(dǎo)率的關(guān)鍵。秋水仙素濃度越高，處理時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)植物組織的抑制程度越大。本發(fā)明通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，預(yù)培養(yǎng)兩天，以300-350mg/L秋水仙素離體組培雙層誘導(dǎo)，既可增強(qiáng)處理材料對(duì)所處環(huán)境的適應(yīng)性及其對(duì)秋水仙素毒害作用的抗性，又能成功誘導(dǎo)染色體加倍。特別是本發(fā)明離體組培雙層誘導(dǎo)的培養(yǎng)基，通過(guò)上層液體培養(yǎng)來(lái)達(dá)到秋水仙素誘導(dǎo)效應(yīng)，通過(guò)下層無(wú)秋水仙素的固體培養(yǎng)來(lái)減輕或緩解秋水仙素毒害，可減少秋水仙素毒害積累，能恢復(fù)或改善加倍后外植體再生能力，進(jìn)而誘導(dǎo)其分化增殖擴(kuò)繁四倍體。[0019]在雙層誘導(dǎo)培養(yǎng)中，將青花菜子葉期保留下胚軸0.4-0.6cm的幼苗的下胚軸垂直插入到固體培養(yǎng)基里，目的是固定外植體達(dá)到上層進(jìn)行誘導(dǎo)效應(yīng)而下層減輕或緩解秋水仙素毒害，同時(shí)可以通過(guò)下胚軸吸收固體培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)供植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育，其次，子葉期莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)浸在上層液體培養(yǎng)基中，而子葉暴露于液體培養(yǎng)基上面，一是子葉可以通過(guò)光合作用提供幼苗生長(zhǎng)發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)元素，二是可防止由于長(zhǎng)時(shí)間浸泡處理而造成的缺氧死亡，減少死亡率。
[0020]本發(fā)明采用直接處理子葉期保留下胚軸0.4-0.6cm的幼苗，可不經(jīng)過(guò)產(chǎn)生愈傷組織的階段，直接產(chǎn)生芽，大大縮短誘導(dǎo)時(shí)間。
[0021]本發(fā)明處理過(guò)的外植體死亡率低，平均存活率為98.41%，增值系數(shù)為2.19，誘導(dǎo)率高，四倍體誘導(dǎo)率最高達(dá)77.78%，四倍體植株經(jīng)分化增殖，可迅速擴(kuò)繁出大量四倍體。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】 [0022]圖1.二倍體氣孔(X40)
[0023]圖2.四倍體氣孔(X40)
[0024]圖3.二倍體染色體(X100)
[0025]圖4.四倍體染色體(X100)
[0026]圖5.二倍體流式細(xì)胞儀圖
[0027]圖6.四倍體流式細(xì)胞儀圖
[0028]圖7.剛組培馴化出來(lái)的四倍體植株(LQ-23)
[0029]圖8.移栽到農(nóng)場(chǎng)的二、四倍體植株對(duì)比(LQ-23，左為四倍體，右為二倍體)
【具體實(shí)施方式】
[0030]實(shí)施例1
[0031]I材料和方法
[0032]1.1供試材料
[0033]實(shí)驗(yàn)材料為二倍體青花菜(2n=2x=18)LQ_2(“綠秀80天”，生產(chǎn)廠家為廈門(mén)市翔安有力蔬菜種苗站)，S139-2 (“南秀366”，生產(chǎn)廠家美國(guó)圣尼斯)和LQ-23 (“狼眼”，生產(chǎn)廠家美國(guó)圣尼斯)。試驗(yàn)于2012年9月至2012年I月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。
[0034]1.2誘導(dǎo)方法
[0035]I)將種子用75%酒精處理lmin，0.1%升汞處理15min，無(wú)菌水沖洗3_4次，接種到無(wú)激素的MS基本培養(yǎng)基+30ml/L椰汁+蔗糖30g/L+瓊脂7.8g/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6d，幼苗子葉完全展開(kāi)。培養(yǎng)溫度維持在23±2°C，光周期維持在16/8h白/黑周期，光強(qiáng)度維持在20001x ；
[0036]2)切取子葉期保留下胚軸0.4 - 0.6cm的幼苗接種到MS基本培養(yǎng)基+NAA0.1mg/L+6 -BA2.5mg/L+椰汁50ml/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.8g/L培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2天，以備加倍處理。培養(yǎng)溫度維持在23±2°C，光周期維持在16/8h白/黑周期，光強(qiáng)度維持在20001x ；
[0037]3)雙層培養(yǎng)誘導(dǎo)多倍體化:預(yù)培養(yǎng)2d后，將子葉期保留下胚軸0.4 -0.6cm的幼苗接種至含秋水仙素的雙層分化培養(yǎng)基上，置于搖床上處理，其中，所述的含秋水仙素的雙層分化培養(yǎng)基由上層=MS基本培養(yǎng)基+NAA0.lmg/L+6 - BA2.5mg/L+50ml/L的椰汁+秋水仙素 +30g/L 蔗糖，pH5.8 (IOml);及下層:MS 基本培養(yǎng)基 +NAA0.lmg/L+6 - BA2.5mg/L+50ml/L的椰汁+30g/L蔗糖+7.8g/L瓊脂，pH5.8 (45ml)組成，秋水仙素濃度為100，300，450mg/L，置于搖床上處理24h，48h和96h，條件同預(yù)培養(yǎng)；每個(gè)組培瓶接種三個(gè)外植體，每個(gè)外植體
重復(fù)三次；
[0038]4)再生增殖:處理后外植體經(jīng)無(wú)菌水沖洗3次后轉(zhuǎn)到分化增殖培養(yǎng)基:MS基本培養(yǎng)基+NAA0.lmg/L+6-BA2.5mg/L+50ml/L椰汁+蔗糖30g/L+瓊脂7.8g/L上分化增殖，獲得四倍體芽，培養(yǎng)條件同預(yù)培養(yǎng)；
[0039]5)再生植株的獲得:40d后，將四倍體芽培養(yǎng)在無(wú)激素的MS基本培養(yǎng)基+100ml/L的椰汁+0.5g/L酸水解酪蛋白培養(yǎng)基中15d，獲得再生植株，培養(yǎng)條件同預(yù)培養(yǎng)。
[0040]6)再生植株的生根和馴化:將再生植株轉(zhuǎn)入1/2MS基本培養(yǎng)基+NAA0.2mg/L+椰汁30ml/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.8g/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)15d生根，培養(yǎng)條件同預(yù)培養(yǎng)；然后按照常規(guī)方法馴化、練苗并移栽；
[0041]1.3再生植株的倍性鑒定
[0042]1.3.1四倍體形態(tài)學(xué)篩選
[0043]當(dāng)葉片達(dá)到6-7片葉時(shí)，觀察處理過(guò)的植株發(fā)現(xiàn)葉片皺縮和顏色加深、葉片加寬加厚葉形變圓的植株可初定為變異株。
[0044]1.3.2氣孔鑒定
[0045]氣孔大小測(cè)定:撕取葉片一小塊下表皮，置載玻片上，滴I滴0.5%濃度1-KI溶液，蓋上載玻片，祛除氣泡，在Olympus光學(xué)顯微鏡(物鏡40 X，目鏡10 X )下，測(cè)定氣孔的大小和密度，取10個(gè)樣本做統(tǒng)計(jì)。以不加秋水仙素處理作為對(duì)照。
[0046]1.3.3流式細(xì)胞儀鑒定
[0047]使用美國(guó)Beckman公司的流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA含量測(cè)定。秤取0.2g葉片，放入培養(yǎng)皿中，加入2ml解離液，使用鋒利的單面刀片一次性快速將葉片組織切碎，經(jīng)雙層漏斗400目濾網(wǎng)過(guò)濾到2ml離心管中，抽取500 μ I過(guò)濾好的待測(cè)液，放于新的2ml離心管中，在加入1.5ml PI (碘化丙錠)染色液，充分震蕩，混勻，染色60min，隨后進(jìn)行上機(jī)測(cè)定。以上所有步驟均在4°C條件下進(jìn)行。
[0048]1.3.4染色體計(jì)數(shù)
[0049]染色體計(jì)數(shù)根尖來(lái)自生長(zhǎng)在溫室的誘導(dǎo)再生植株。取l-2cm根尖用0.002M8-羥基喹啉預(yù)處理3-4h，用卡諾固定液(乙醇:乙酸=3:1)固定24h后，在4°C，70%酒精長(zhǎng)期保存。取固定好的根尖，蒸餾水清洗3次，0.075M KCL前低滲25min，在放入IM HC160°C中解離8min，蒸餾水后滴滲處理7min，切取尖端2mm放在載玻片上，用改良卡寶染液染色5_8min，蓋上蓋玻片，敲片，在Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。
[0050]2、結(jié)果與分析
[0051]2.1秋水仙素對(duì)雙層培養(yǎng)子葉期保留下胚軸0.4 -0.6cm的幼苗存活和增殖的影響
[0052]本文利用三個(gè)品種，總共243個(gè)外植體(不算對(duì)照)被接種到含有不同濃度的秋水仙素的雙層培養(yǎng)基上處理24h，48h和96h，處理3周后觀察外植體的死亡情況，總共239個(gè)外植體存活(不算對(duì)照)，僅LQ-2有兩個(gè)外植體死亡和S139-2有一個(gè)外植體死亡，存活率最低77.78%，最高為100% (表1)。秋水仙素處理后，各外植體底部會(huì)逐漸變成黑色，死亡的外植體均是由于頂芽抑制生長(zhǎng)最終導(dǎo)致子葉逐漸發(fā)黃，死亡。與對(duì)照增殖系數(shù)相比較，處理過(guò)的外植體分化和生長(zhǎng)都不同程度的有所減緩，其增殖系數(shù)也不同程度的有所降低，并且隨著秋水仙素濃度逐漸增加，時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，各品種各處理間的增殖系數(shù)也相應(yīng)的降低。當(dāng)處理時(shí)間為24h，秋水仙素濃度為100，300，450mg/L時(shí)，LQ-2和S139-2的增殖系數(shù)分別為3.00,2.22、1.56和3.22,2.56、2 (表1)。當(dāng)處理時(shí)間為48h，秋水仙素濃度為450mg/L時(shí)，LQ-2和S139-2的增殖系數(shù)分別為1.11和1.71 (表1)。LQ_2，S139_2和LQ-23的增殖系數(shù)范圍分別為1.11-3.38，1-3.22和1-3.33(表1)。故秋水仙素濃度和處理時(shí)間是影響青花菜芽點(diǎn)增殖的重要因素。
[0053]表1秋水仙素對(duì)雙層培養(yǎng)子葉期保留下胚軸0.4 - 0.6cm的幼苗存活和增殖的影響
[0054]
【權(quán)利要求】
1.一種離體誘導(dǎo)同源四倍體青花菜的育種方法，其特征在于包括:以青花菜子葉期保留下胚軸0.4-0.6cm的幼苗為外植體，將外植體接種至含秋水仙素的雙層分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)45-50h，再經(jīng)再生增殖直接產(chǎn)生四倍體芽，進(jìn)而經(jīng)后續(xù)培養(yǎng)獲得同源四倍體青花菜；其中，所述的含秋水仙素的雙層分化培養(yǎng)基由上層:MS基本培養(yǎng)基+ΝΑΑ0.05-0.1mg/L+6-BA2.5-3mg/L+50-60ml/L 的椰汁 +300_350mg/L 秋水仙素 +30g/L 蔗糖，ρΗ5.8 ;及下層:MS 基本培養(yǎng)基 +ΝΑΑ0.05-0.lmg/L+6-BA2.5-3mg/L+50-60ml/L 的椰汁 +30g/L 蔗糖 +7.8g/L瓊脂，pH5.8組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同源四倍體青花菜的育種方法，其特征在于所述的方法包括如下步驟: 1)雙層培養(yǎng)誘導(dǎo)多倍體化:切取青花菜子葉期保留下胚軸0.4-0.6cm的幼苗，預(yù)培養(yǎng)2d后，接種至含秋水仙素的雙層分化培養(yǎng)基中，置于搖床上處理45-50h，培養(yǎng)溫度維持在23±2°C，光周期維持在16/8h白/黑周期，光強(qiáng)度維持在20001x ； 2)再生增殖:上一步處理后的外植體經(jīng)無(wú)菌水沖洗3次后轉(zhuǎn)到分化增殖培養(yǎng)基上分化增殖獲得四倍體芽，所使用的分化增殖培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+ΝΑΑ0.05-0.1mg/L+6-BA2.5-3mg/L+ 椰汁 50_60ml/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 7.8g/L，pH5.8 ;培養(yǎng)溫度維持在23±2°C，光周期維持在16/8h白/黑周期，光強(qiáng)度維持在20001x ； 3)再生植株的獲得:40d后，將四倍體芽培養(yǎng)在無(wú)激素的MS基本培養(yǎng)基+80-100ml/L椰汁+0.5g/L酸水解酪蛋白+蔗糖30g/L+瓊脂7.8g/L的培養(yǎng)基中10_15d，獲得再生植株，培養(yǎng)溫度維持在23±2°C，光周期維持在16/8h白/黑周期，光強(qiáng)度維持在20001x ； 4)再生植株的生根和馴化:將再生植株轉(zhuǎn)入1/2MS基本培養(yǎng)基+NAA0.2mg/L+椰汁20-30ml/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.8g/L的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度維持在23±2°C，光周期維持在16/8h白/黑周期，光強(qiáng)度維持在20001x培養(yǎng)15-20d生根，然后馴化、練苗并移栽； 5)再生植株的鑒定:移栽之前，取再生植株的根尖，在流式細(xì)胞儀鑒定后進(jìn)行染色體鑒定，移栽I個(gè)月后對(duì)再生植株進(jìn)行``形態(tài)學(xué)鑒定、氣孔鑒定和流式細(xì)胞儀鑒定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同源四倍體青花菜的育種方法，其特征在于所述的含秋水仙素的雙層分化培養(yǎng)基中秋水仙素濃度為300mg/L，外植體在含秋水仙素的雙層分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選48h。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的同源四倍體青花菜的育種方法，其特征在于所述的含秋水仙素的雙層分化培養(yǎng)基中上層液體培養(yǎng)基的體積與下層固體培養(yǎng)基的體積的比例為2:9-2:7;接種時(shí)將外植體的下胚軸垂直插入到下層固體培養(yǎng)基里，子葉期莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)浸在上層液體培養(yǎng)基中，而子葉暴露于上層液體培養(yǎng)基上面。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的同源四倍體青花菜的育種方法，其特征在于所述的青花菜子葉期保留下胚軸0.4-0.6cm的幼苗通過(guò)以下方法獲得:將青花菜種子用75%酒精處理Imin, 0.1%升萊處理15min,無(wú)菌水沖洗3_4次,接種到無(wú)激素的MS基本培養(yǎng)基+椰汁20-30ml/L+蔗糖30g/L+瓊脂7.8g/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6d，幼苗子葉完全展開(kāi)，取出無(wú)菌苗，在距離子葉柄末端0.4-0.6cm下胚軸處切開(kāi)，保留帶有子葉的部分作為外植體；培養(yǎng)溫度維持在23±2°C，光周期維持在16/8h白/黑周期，光強(qiáng)度維持在20001x。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的同源四倍體青花菜的育種方法，其特征在于所述的預(yù)培養(yǎng)為切取子葉期保留下胚軸0.4-0.6 cm的幼苗接種到MS基本培養(yǎng)基+NAA0.05-0.lmg/L+6-BA2.5_3mg/L+ 椰汁 50_60ml/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 ?.8g/L 的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2天，培養(yǎng)溫度維持在23±2°C，光周期維持在16/8h白/黑周期，光強(qiáng)度維持在20001x。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103734016SQ201410027435
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月21日
【發(fā)明者】張蜀寧, 鄭于莉, 李英, 徐麗娟, 王雅美, 侯喜林 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)