四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，該方法為：首先確定二倍體矮牽牛減數(shù)分裂前期Ⅰ時(shí)花蕾大小與形態(tài)特征以掌握最佳處理時(shí)期，誘導(dǎo)處理時(shí)最適宜的秋水仙素濃度和處理次數(shù)等因素，掌握矮牽牛2n花粉與n花粉大小、外觀特征以快速區(qū)分鑒定，對(duì)矮牽牛雜交后代植株倍性較為實(shí)用簡(jiǎn)易的細(xì)胞學(xué)鑒定方法。采用本發(fā)明育種方法，所獲得的有性多倍化雜交F1不但具有母本多倍體器官巨大性的特點(diǎn)，還具有一些來(lái)自二倍體父本的遺傳性狀，與無(wú)性多倍化途徑獲得的同源四倍體相比，具有更廣泛的遺傳多樣性、更高的觀賞性和結(jié)籽率。
【專利說(shuō)明】四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于園藝植物育種領(lǐng)域，具體涉及到一種四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法。

【背景技術(shù)】
[0002]植物多倍體是指體細(xì)胞中含有三個(gè)或三個(gè)以上染色體組，因具有巨大性、抗逆性強(qiáng)、結(jié)實(shí)性低和營(yíng)養(yǎng)成分高等特點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用，多倍體育種在現(xiàn)代育種中具有廣闊前景，目前人工誘導(dǎo)植物多倍體主要有無(wú)性多倍化和有性多倍化二種方法。
[0003](I)無(wú)性多倍化(Somatic polyploidizat1n),染色體加倍發(fā)生在有絲分裂過(guò)程中，即由染色體加倍的體細(xì)胞發(fā)育成多倍體植株。常見(jiàn)的誘導(dǎo)方式是物理和化學(xué)方式。物理方式有溫度激變、機(jī)械創(chuàng)傷、電離輻射、非電離輻射、離心力、熱沖擊、X和Y射線等；化學(xué)方式多為藥劑誘導(dǎo)，主要有秋水仙素、吲哚乙酸、萘駢乙烷、芫荽腦、苯及其衍生物、有機(jī)砷制劑、有機(jī)汞制劑(富民隆)等。秋水仙素是最為有效的化學(xué)誘導(dǎo)劑，它與正在有絲分裂的細(xì)胞接觸后，即可抑制微管的聚合過(guò)程，不能形成紡錘絲，使染色體不能排在赤道板上，也不能分向細(xì)胞的兩極，從而產(chǎn)生染色體加倍的細(xì)胞核，常處理種子、子葉、幼苗生長(zhǎng)點(diǎn)等部位，一般為浸種和滴涂生長(zhǎng)點(diǎn)。目前已在許多園藝植物種中通過(guò)秋水仙素誘變獲得了人工多倍體，培養(yǎng)出多倍體蘋果、柑橘、葡萄、金絲小棗、西瓜、白菜、黃瓜、番茄、不結(jié)球白菜、花椰菜、芹菜、蘿卜、金魚草、百合、香石竹、君子蘭等。本申請(qǐng)第一發(fā)明人曾于2005年利用秋水仙素化學(xué)誘導(dǎo)二倍體矮牽牛 ，通過(guò)無(wú)性多倍化途徑經(jīng)過(guò)多年選擇鑒定，培育出同源四倍體新品種‘紅霞’，該品種于2012年10月通過(guò)江蘇省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)鑒定通過(guò)(證書編號(hào):2012-2-9)。與原有二倍體植株相比較，具有花期延長(zhǎng)、花瓣增大和邊緣褶皺等觀賞性增強(qiáng)的特點(diǎn)，同時(shí)植株葉片增厚、長(zhǎng)勢(shì)增強(qiáng)，抗逆境能力也增加，顯示了矮牽牛多倍體育種具有較好的生產(chǎn)實(shí)踐利用前景和研究?jī)r(jià)值。
[0004]但是通過(guò)無(wú)性多倍化途徑形成的多倍體植株往往存在著混倍體、嵌合體等現(xiàn)象，誘變后代與母本的遺傳特性差異小后代變異率低，對(duì)優(yōu)良單株選擇不利，此外由于無(wú)性多倍化后結(jié)實(shí)率顯著降低對(duì)于結(jié)籽率低的有性繁殖品種不宜采用。
[0005](2)有性多倍化(Sexual polyploidizat1n)。有性多倍化是相對(duì)無(wú)性有絲分裂過(guò)程染色體加倍而言的，其途徑是誘導(dǎo)二倍體減數(shù)分裂紊亂產(chǎn)生2n配子參與受精而形成多倍體。有研究表明2n配子在植物進(jìn)化過(guò)程中起著非常重要的作用，在傳遞雜合性和上位性中具有特殊的價(jià)值。但對(duì)一年生草本花卉矮牽牛尚無(wú)有性多倍化的發(fā)明專利報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供了一種四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，采用該方法能得到遺傳多樣性、結(jié)籽率高的四倍體矮牽牛。
[0007]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，該方法包括如下步驟:
[0008](I) 二倍體矮牽牛減數(shù)分裂前期I時(shí)花蕾大小的確定；
[0009](2)當(dāng)花蕾長(zhǎng)度為2.5-3.0mm時(shí)進(jìn)行2η雄配子的誘導(dǎo)，得到的含有2η花粉的二倍體矮牽牛作為父本；其中父本2η花粉的染色體數(shù)為2χ = 14 ;
[0010](3)有性多倍化雜交:以四倍體矮牽牛為母本，并對(duì)母本進(jìn)行去雄處理，去雄處理后的母本與步驟(2)中的父本進(jìn)行授粉雜交；得到F1 ；
[0011](4)雜交后RF1倍性的鑒定:第二年春季播種F1種子，成株后進(jìn)行農(nóng)藝性狀、解剖學(xué)鑒定，鑒定后選取配子染色體數(shù)目2χ = 14的植株即為通過(guò)有性多倍化途徑獲得的新四倍體種質(zhì)。
[0012]有益效果:采用本發(fā)明育種方法，所獲得的有性多倍化雜交F1不但具有母本多倍體器官巨大性的特點(diǎn)，還具有一些來(lái)自二倍體父本的遺傳性狀，與無(wú)性多倍化途徑獲得的同源四倍體相比，具有更廣泛的遺傳多樣性、更高的觀賞性和結(jié)籽率。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為未誘變處理的二倍體父本‘夢(mèng)幻’的η花粉；
[0014]圖2為2η與η花粉同時(shí)存在于經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)的二倍體父本‘夢(mèng)幻’花粉；
[0015]圖3匕花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂后期II中一極(箭頭示)染色體數(shù)目2x = 14 ;
[0016]圖4葉片比較圖；左為二倍體父本‘夢(mèng)幻’，右為雜交后代四倍體F1 ；
[0017]圖5花藥和柱頭比較(左為未經(jīng)秋水仙素誘變處理二倍體父本‘夢(mèng)幻’對(duì)照，中為雜交后代四倍體匕，右為四倍體母本‘紅霞’)；
[0018]圖6氣孔比較圖；左為二倍體父本‘夢(mèng)幻’，右邊的為雜交后代四倍體F1 ；
[0019]圖7花瓣比較圖；左為母本四倍體‘紅霞’，右為雜交后代四倍體F1 ；
[0020]圖8植株形態(tài):左上為二倍體父本‘夢(mèng)幻’，左下為雜交后代四倍體F1，右為四倍體母本‘紅霞’。

【具體實(shí)施方式】
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[0021]下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0022]實(shí)施例1:一種四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，方法包括如下步驟:
[0023](1) 二倍體矮牽牛減數(shù)分裂前期I時(shí)花蕾大小的確定:晴天上午8:00至10:00取二倍體矮牽牛幼小花蕾，測(cè)量其長(zhǎng)度后用卡諾氏固定液固定24h，經(jīng)體積濃度為90%、體積濃度為80%乙醇梯度脫水最后轉(zhuǎn)入體積濃度為70%乙醇4°C下保存?zhèn)溆茫挥? N鹽酸60°C恒溫水浴花蕾約2-3min，蒸餾水沖洗3_4次，從花蕾中剝?nèi)』ㄋ?，用質(zhì)量濃度為I %醋酸洋紅染色常規(guī)染色、壓片，火焰拷片2s分色，在100倍油鏡下對(duì)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期進(jìn)行觀察，確定前期I時(shí)花蕾的長(zhǎng)度；其中卡諾氏固定液是由無(wú)水乙醇與冰醋酸按體積比為3:1混合制得。
[0024](2)當(dāng)花蕾長(zhǎng)度為2.5-3.0mm時(shí)進(jìn)行2n雄配子的誘導(dǎo)，得到的含有2n花粉的二倍體矮牽牛作為父本；其中父本2n花粉的染色體數(shù)為2x = 14 ;具體方法為:采用秋水仙素溶液處理花蕾時(shí)間為早晨8:00-10:00，處理溫度25°C _32°C，誘導(dǎo)二倍體矮牽牛產(chǎn)生2n花粉的秋水仙素溶液質(zhì)量濃度分別為0.1^^0.2^^0.3%,在二倍體矮牽?；ɡ?不包括萼片)長(zhǎng)度為2.5-3.0mm時(shí)進(jìn)行處理，采用微量注射法，將注射器針頭深入花蕾中注射9-1IL秋水仙素溶液，每天處理I次，分別進(jìn)行1、2、3天處理，開(kāi)花后套袋隔離，以未誘變處理二倍體植株為對(duì)照；然后取花粉粒于載玻片上質(zhì)量濃度為I %醋酸洋紅染色3min后，在40倍鏡下用顯微測(cè)微尺測(cè)量花粉的直徑并結(jié)合外觀特征確認(rèn)2n花粉，統(tǒng)計(jì)2n花粉百分率，表1中9個(gè)處理中確定以濃度0.2%秋水仙素處理I次效果最好，2n花粉率可達(dá)29.3%，為對(duì)照1.3%的22.5倍。其中2n花粉百分率的計(jì)算公式為:
[0025]2n花粉百分率=2n花粉數(shù)/花粉總數(shù)X 100%。
[0026]表1 9種秋水仙素處理誘導(dǎo)2n花粉效果的比較
[0027]

【權(quán)利要求】
1.一種四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)二倍體矮牽牛減數(shù)分裂前期I時(shí)花蕾大小的確定； (2)當(dāng)花蕾長(zhǎng)度為2.5-3.0mm時(shí)進(jìn)行2η雄配子誘導(dǎo)，得到的含有2η花粉的二倍體矮牽牛作為父本；其中父本2η花粉的染色體數(shù)為2χ =14 ； (3)有性多倍化雜交:以四倍體矮牽牛為母本，并對(duì)母本進(jìn)行去雄處理，去雄處理后的母本與步驟(2)中的父本進(jìn)行授粉雜交得到F1 ； (4)雜交后代F1倍性的鑒定:第二年春季播種F1種子，成株后進(jìn)行農(nóng)藝性狀、解剖學(xué)鑒定，鑒定后選取配子染色體數(shù)目2χ =14的植株即為通過(guò)有性多倍化途徑獲得的新四倍體種質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，其特征在于，步驟(1)中，于晴天上午8:00至10:00取二倍體矮牽牛幼小花蕾，測(cè)量其長(zhǎng)度后用卡諾氏固定液固定24 h，經(jīng)體積濃度為90%、體積濃度為80%乙醇梯度脫水最后轉(zhuǎn)入體積濃度為70%乙醇4°C下保存?zhèn)溆?；? N鹽酸60°C恒溫水浴花蕾約2-3 min，蒸餾水沖洗3_4次，從花蕾中剝?nèi)』ㄋ帲觅|(zhì)量濃度為1%醋酸洋紅染色常規(guī)染色、壓片，火焰拷片2s分色，在100倍油鏡下對(duì)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期進(jìn)行觀察，確定前期I時(shí)花蕾的長(zhǎng)度；其中卡諾氏固定液是由無(wú)水乙醇與冰醋酸按體積比為3:1混合制得。
3.根據(jù)權(quán)利 要求1所述的四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，其特征在于，步驟(2)的操作方法為:采用秋水仙素溶液處理花蕾時(shí)間為早晨8:00-10:00，處理溫度25°C -32°C,誘導(dǎo)二倍體矮牽牛產(chǎn)生2n花粉的秋水仙素溶液質(zhì)量濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%，在二倍體矮牽?；ɡ?不包括萼片)為2.5-3.0 mm時(shí)進(jìn)行處理，采用微量注射法，將注射器針頭深入花蕾中注射9-lluL秋水仙素溶液，每天處理I次，分別進(jìn)行1、2、3天處理，開(kāi)花后套袋隔離，以未誘變處理二倍體植株為對(duì)照；然后取花粉粒于載玻片上質(zhì)量濃度為1%醋酸洋紅染色3min后，在40倍鏡下用顯微測(cè)微尺測(cè)量花粉的直徑并結(jié)合外觀特征確認(rèn)2n花粉，統(tǒng)計(jì)2n花粉百分率，其中2n花粉百分率的計(jì)算公式為: 2n花粉百分率=2n花粉數(shù)/花粉總數(shù)X 100%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，其特征在于，步驟(2)中得到的父本2n花粉形態(tài)特征為圓形或近似四邊形，直徑3 40um，有4個(gè)萌發(fā)孔，染色體數(shù)為2x =14。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，其特征在于，步驟(3)中所述的四倍體矮牽牛為‘紅霞’。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四倍體矮牽牛的有性多倍化育種方法，其特征在于，步驟(4)中解剖學(xué)鑒定方法為:于晴天上午8:00-10:00取的植株上長(zhǎng)度為2.6-5.8 mm幼小花蕾(不包括萼片)，用卡諾氏固定液固定24 h后，經(jīng)體積濃度為90%、體積濃度為80%乙醇梯度脫水最后轉(zhuǎn)入體積濃度為70%乙醇4°C下保存?zhèn)溆茫挥肐 N鹽酸60°C恒溫水浴花蕾約2-3 min,蒸餾水沖洗3-4次，從花蕾中剝?nèi)』ㄋ?，用質(zhì)量濃度為1%醋酸洋紅染色常規(guī)染色、壓片，火焰拷片2s分色，在100倍油鏡下對(duì)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期染色體數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)，選取配子染色體數(shù)目2x=14的雜交后代植株即為通過(guò)有性多倍化途徑獲得的新四倍體矮牽牛種質(zhì)。
【文檔編號(hào)】A01H1/04GK104067931SQ201410268727
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】魏躍, 王全智, 顏志明, 楊寶林, 董慧, 嵇怡, 賈思振, 史紅林 申請(qǐng)人:江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院