一種太平洋牡蠣胚胎超低溫冷凍保存方法
【專利摘要】本發(fā)明屬海洋生物【技術(shù)領域】，具體地講是一種太平洋牡蠣胚胎超低溫冷凍保存方法。選擇活力95%以上的優(yōu)質(zhì)太平洋牡蠣擔輪幼蟲，用200目的篩絹過濾收集，加入適量添加劑，按擔輪幼蟲與抗凍保護劑的體積比9：1比例稀釋混勻，在4℃孵育30分鐘，分裝于0.25ml或0.5ml麥管，分步程序降溫至-180℃后投入液氮中長期保存。解凍時采用水浴解凍法，28℃水浴解凍5-10s，然后置于室溫20℃至完全融化，加入到含5%BSA的新鮮滅菌海水檢測擔輪幼蟲活力，獲得復活的擔輪幼蟲高于70%。本發(fā)明的太平洋牡蠣胚胎長期冷凍保存方法對于太平洋牡蠣人工繁育、種質(zhì)保存、遺傳多樣性及可持續(xù)養(yǎng)殖等方面有著重要意義。
【專利說明】一種太平洋牡蠣胚胎超低溫冷凍保存方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬海洋生物【技術(shù)領域】，具體地說是一種太平洋牡蠣胚胎超低溫冷凍保存方法，把太平洋牡蠣胚胎經(jīng)過抗凍保護劑處理、降溫冷凍、置于液氮中長期保存及復溫培育的過程。
【背景技術(shù)】
[0002]太平洋牡販(Crassostrea gigas)屬于牡販科，巨販屬，俗稱真牡販，其個體較大，在我國主要分布于山東及遼寧地區(qū)，其肉質(zhì)細嫩，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，尤其蛋白質(zhì)、脂肪、肝糖、碘、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，有海洋牛奶之美稱。20世紀80年代從日本、澳洲和臺灣地區(qū)引入我國，在我國養(yǎng)殖十分廣泛，目前已經(jīng)成為我國最重要的養(yǎng)殖貝類，具有極高商業(yè)開發(fā)價值的海洋經(jīng)濟動物。近年來，由于養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，對太平洋牡蠣種質(zhì)需求也不斷擴大，然而近幾年來，由于累代養(yǎng)殖、近親交配造成了種質(zhì)退化、雜合度降低等一系列問題，致使太平洋牡蠣的生長速度與引進初期相比明顯下降，養(yǎng)成周期不斷延長。因此，選育具有優(yōu)良生長性狀的太平洋牡蠣品系、建立太平洋牡蠣的胚胎冷凍技術(shù)成為太平洋牡蠣養(yǎng)殖的當務之急。太平洋牡蠣胚胎的超低溫保存在水產(chǎn)養(yǎng)殖、遺傳育種以及種質(zhì)資源保存中具有重要的意義:太平洋牡蠣胚胎的超低溫保存對于太平洋牡蠣這種海水名貴貝類的種質(zhì)保存、遺傳多樣性和育種、可持續(xù)養(yǎng)殖、種質(zhì)的長距離運輸、貝類品的選育以及基因多樣性的保護等方面有著 重要意義

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種太平洋牡蠣胚胎超低溫冷凍保存方法。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
[0005]從養(yǎng)殖場購得太平洋牡蠣，解剖取的精液和卵子，經(jīng)人工授精獲得太平洋牡蠣擔輪幼蟲期胚胎，加入抗凍保護劑，預冷后裝入0.5ml或者0.25ml的麥管中進行分步降溫，-40°C前采用兩步慢速降溫，-40°C后采用快速降溫至-180°C后直接投入液氮中保存28°C水浴解凍復溫培育，采用計算機輔助分析(CASA)檢測太平洋牡蠣胚胎的運動率。所述太平洋牡蠣胚胎為擔輪幼蟲期胚胎，人工受精后于19±1°C溫度條件下培養(yǎng)12-14h后發(fā)育至擔輪幼蟲期，用于胚胎冷凍保存。
[0006]所述冷凍保存的太平洋牡蠣擔輪幼蟲期胚胎，是經(jīng)200目篩絹過濾濃縮獲得。
[0007]所述抗凍保護劑為10%DMS0 (V/V,DMSO體積/太平洋牡蠣胚胎體積)，太平洋牡蠣胚胎中提前添加有0.2M的海藻糖溶解混勻。
[0008]所述太平洋牡蠣擔輪幼蟲加入海藻糖和抗凍保護劑后充分混勻，在0~4°C冰箱中預冷30分鐘。
[0009]所述混合有0.2M海藻糖和10%DMS0 (V/V, DMSO體積/太平洋牡蠣胚胎體積)太平洋牡蠣胚胎預冷后加入到0.5ml或者0.25ml的麥管中，用封口粉封口后放入程序降溫儀進行程序降溫。[0010]所述兩步慢速降溫是指0~-15°c降溫速率為-l°c /分鐘，-15~-40°c降溫速率為_3°C /分鐘，并且在-15°C停留3分鐘，以便其充分形成冰核。所述快速降溫是指-40~_180°C降溫速率為-20°C /分鐘，降至_180°C后取出，立即投入液氮中長期保存。
[0011]所述保存后的太平洋牡蠣擔輪幼蟲解凍時，用鑷子從液氮中取出裝有太平洋牡蠣擔輪幼蟲期胚胎的麥管，放入28°c水浴輕輕搖晃解凍至麥管開始呈現(xiàn)透明狀態(tài)后取出，室溫放至完全融化，剪刀剪開麥管兩端放入海水中培育，獲取復活胚胎。
[0012]所述培育胚胎的海水，是將海水經(jīng)煮沸消毒后，按海水體積計加有5%BSA。
[0013]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0014]1.本發(fā)明采用200目篩絹過濾濃縮太平洋牡蠣胚胎，保存胚胎量大；
[0015]2.本發(fā)明冷凍保存擔輪幼蟲期太平洋牡蠣的胚胎，抗凍能力強，解凍后活力高；
[0016]3.本發(fā)明采用0.25和0.5ml麥管裝太平洋牡蠣胚胎，溫度控制更加精密；
[0017]4.本發(fā)明采用10% (v/v)二甲亞砜(DMSO)為抗凍保護劑，保持較好滲透性的同時又降低了毒性；
[0018]5.本發(fā)明抗凍液中加入了 0.2M海藻糖作為添加劑，通過其非滲透性保護作用對胚胎的質(zhì)膜起到很好的保護作用；
[0019]6.本發(fā)明降溫 前太平洋牡蠣擔輪幼蟲與抗凍液混勻，4°C冰箱中預冷30分鐘，既能保證抗凍保護劑充分滲入到太平洋牡蠣胚胎內(nèi)部，又不會因抗凍保護劑本身的毒性作用對胚胎造成過大的損害；
[0020]7.本發(fā)明慢速降溫時，首先采用以_1°C /min速度降溫，降至_15°C后平衡3分鐘，以便太平洋牡蠣胚胎內(nèi)部形成冰核，又以_3°C /min降至-40°C，使冷凍胚胎安全度過“危險溫度區(qū)”節(jié)省了時間，操作簡便易行；
[0021]8.本發(fā)明采用-20°C /min的降溫速率快速進入穩(wěn)定狀態(tài)_180°C，然后投入液氮，整個降溫過程時間短，實用性強；
[0022]9.本發(fā)明冷凍胚胎從液氮中取出后，放入28°C水浴解凍至麥管呈透明狀態(tài)取出，室溫放至完全融化，可使胚胎快速度過重結(jié)晶區(qū)，同時又避免了局部溫度過高導致的損傷；
[0023]10.該技術(shù)降溫程序精密，穩(wěn)定性好，胚胎解凍后復蘇率高，激活后運動率高于70%，與鮮精活性差異不大。
[0024]11.本發(fā)明采用添加5%BSA的消毒海水復水培育太平洋牡蠣胚胎，既降低了細菌真菌等有害微生物對胚胎的損害，又有效的防止解凍后胚胎相互黏連。
【具體實施方式】
[0025]實施例1:
[0026]2013年4月份正值太平洋牡蠣生殖期，與青島嶗東海珍品良種培育有限公司，撈取同批自然產(chǎn)太平洋牡蠣受精卵，放置海水溫度19土 rc、微充氣的孵化桶內(nèi)培育，至擔輪幼蟲期胚胎，室溫培養(yǎng)12-14h ；
[0027]用200目篩絹網(wǎng)撈取胚胎，用濾紙輕蘸吸去表面海水，放入10%DMS0+0.2M海藻糖作為抗凍保護劑，混合均勻后在0~4°C冰箱中預冷30分鐘，得混合樣品；從冰箱中取2種
0.25ml、0.5ml的麥管和混合樣品,用2種麥管分別吸取0.25ml、0.5ml的混合樣品,封口粉(IMV卡蘇公司)封口后快速放入程序降溫儀(Kryo360-1.7)，開始降溫；
[0028]降溫程序為:0~-15°C，降溫速率為_1°C /min ;_15~_40°C，降溫速率為_3°C /min ;其中在-12°C時，平衡3分鐘，使其胚胎內(nèi)形成冰晶，然后以_20°C /min快速降溫達至_180°C時，迅速將麥管投入裝滿液氮的液氮罐中保存；
[0029]保存2小時后取出麥管，迅速放入28°C水浴鍋中解凍，至麥管呈現(xiàn)透亮狀態(tài)后取出，室溫放至冰核全部融化；
[0030]用剪刀剪開麥管兩端，將管內(nèi)胚胎倒入含有5%BSA的煮沸消毒的滅菌海水中，18±1°C靜水培育；
[0031]取少量液體顯微鏡下觀察，采集視頻，統(tǒng)計擔輪幼蟲運動和死亡的個數(shù)，計算運動率大于70%。
[0032]實施例2:
[0033]2013年5月份正值太平洋牡蠣生殖期，與黃島膠南增養(yǎng)殖站取得近?；\養(yǎng)牡蠣200只，帶回中國科學院海洋研究所貝類養(yǎng)殖室暫養(yǎng)(暫養(yǎng)溫度19土 1°C )，取性腺發(fā)育良好的太平洋牡蠣雌雄個體解剖取得精液和卵子進行人工授精，顯微鏡觀察大約12_14h太平洋牡蠣胚胎進入擔輪幼蟲期；
[0034]采用200目篩絹過濾濃縮太平洋牡蠣胚胎，裝入50ml離心管中，用200目的篩絹過濾收集到離心管中，按過濾后擔輪幼蟲與抗凍保護劑DMSO的體積比9:1比例稀釋混勻，加入0.2M海藻糖作為添加劑；
[0035]將混有抗凍保護`劑的太平洋牡蠣胚胎放入4°C冰箱中預冷30min后分裝于0.25ml或0.5ml麥管快速放入程序降溫儀中；
[0036]慢速分步降溫程序為:_1°C /min由0降至_15°C，平衡3分鐘后以_3°C /min由-15降至_40°C ;快速降溫程序為:-20°C /min由_40°C快速降溫至_180°C時，迅速將麥管投入液氣te中保存；
[0037]保存一周后取出麥管，放入28°C水浴鍋中解凍5-10秒后取出，室溫(20°C )放至冰核全部融化；
[0038]用剪刀剪開兩端，待里面的液體完全流到載玻片上，置于顯微鏡下觀察，采用計算機輔助精子分析(CASA)系統(tǒng)隨機取三個視野采集太平洋牡蠣擔輪幼蟲運動狀態(tài)的視頻文件，統(tǒng)計運動率，計算運動率為73.00±2.00%。
【權(quán)利要求】
1.一種太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于:太平洋牡蠣擔輪幼蟲期胚胎，加入抗凍保護劑，預冷后裝入麥管中進行分步降溫，_40°C前采用兩步慢速降溫，_40°C后采用快速降溫至_180°C后直接投入液氮中保存，28°C水浴解凍復溫培育，檢測運動率。
2.按照權(quán)利要求1所述太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于:所述太平洋牡蠣胚胎為擔輪幼蟲期胚胎，受精后于19±1°C溫度條件下培養(yǎng)12-14h后發(fā)育至擔輪幼蟲期。
3.按照權(quán)利要求1所述太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于:所述太平洋牡蠣擔輪幼蟲期胚胎，經(jīng)200目篩絹過濾濃縮。
4.按照權(quán)利要求1所述太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于:所述抗凍保護劑為10%DMS0 (V/V，DMSO體積/太平洋牡蠣胚胎體積)，太平洋牡蠣胚胎中添加有0.2M的海藻糖。
5.按照權(quán)利要求1或4所述太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于:所述太平洋牡蠣擔輪幼蟲加入海藻糖和抗凍保護劑后充分混勻，在0~4°C冰箱中預冷30分鐘。
6.按照權(quán)利要求1所述太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于:所述混合有0.2M海藻糖和10%DMS0 (V/V, DMSO體積/太平洋牡蠣胚胎體積)太平洋牡蠣胚胎預冷后加入到0.5ml或者0.25ml的麥管中，用封口粉封口后放入程序降溫儀進行程序降溫。
7.按照權(quán)利要求1所述太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于:所述兩步慢速降溫是指0~-15°c降溫速率為-rc /分鐘，-15~-40°c降溫速率為-3°c /分鐘，并且在-15°C停留3分鐘。
8.按照權(quán)利要求1所述太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于:所述快速降溫是指-40~_180°C降溫速率為-20°C /分鐘，降至_180°C后直接投入液氮中長期保存。
9.按照權(quán)利要求1所述太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于:所述保存后的太平洋牡蠣擔輪幼蟲解凍時取出裝有擔輪幼蟲的麥管，放入28°C水浴解凍至麥管呈透明狀態(tài)取出，室溫放至完全融化，剪開麥管兩端放入海水中培育，獲取復活胚胎。
10.按照權(quán)利要求1所述太平洋牡蠣胚胎冷凍保存方法，其特征在于:所述培育胚胎的海水，是將海水消毒后，按海水體積計加有5%BSA。
【文檔編號】A01N1/02GK103704204SQ201410004766
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月6日
【發(fā)明者】韓龍江, 黃雯, 劉清華, 闕華勇, 李莉, 紀利芹, 李軍, 溫海深 申請人:中國科學院海洋研究所