一種女貞葉中抑制脲酶成分的提取方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種女貞葉中抑制脲酶成分的提取方法及應(yīng)用，本發(fā)明提供一種女貞葉中抑制脲酶成分的提取方法及應(yīng)用，揭示了以女貞葉為原料，以有機(jī)溶劑作溶劑輔以微波作粗提，再用丙烯酰胺層析純化提取脲酶抑制成分-即尿素增效劑，并以該尿素增效劑用于抑制脲酶提高尿素氮利用的試驗(yàn)。結(jié)果表明，其抑酶率達(dá)到71.2%，尿素氮利用提高了。
【專利說明】—種女貞葉中抑制脲酶成分的提取方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種女貞葉中抑制脲酶成分的提取方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]早在40年代，人們就發(fā)現(xiàn)，往土壤中加入某些可抑制脲酶活性的化合物能延緩尿素的水解。60年代人們開始了大量的脲酶抑制劑篩選工作，發(fā)現(xiàn)氨荒酸鹽、含硼化合物、尿素衍生物、原子量大于50的重金屬、含氟化合物、多元酚及多元醌和抗代謝物等對脲酶活性具抑制作用；Burn，R.G (1978)認(rèn)為酚類和醌類是比較有希望的脲酶抑制劑，其中多元酚醌的效果好于單元酚醌；Bremner等(1971)證實(shí)，酚醌對脲酶的抑制效果比無機(jī)物好；Bundy等(1973)對醌的同系物研究表明，被鹵素取代的P-苯醌對脲酶抑制效率較高；Mishra (1979)發(fā)現(xiàn)，在IOOppm時(shí)，除蒽醌外，1.4-萘醌等許多醌類化合物均有抑制脲酶活性和抑制硝化作用；RodgerS等(1984)用5種氨基甲酚進(jìn)行試驗(yàn)表明，4-氨基鄰甲酚和4-氨基間甲酚對脲酶活性有顯著的抑制作用；Calamea等(1984)用15N標(biāo)記的尿素，開展了氫醌(HQ)對尿素氮利用率影響的研究，發(fā)現(xiàn)HQ能促進(jìn)植株對土壤氮和尿素氮的吸收；Bremner (1978)指出，HQ是最有希望的抑制劑；周禮愷(1988)等發(fā)現(xiàn)10mg/5公斤土的HQ可使春小麥增產(chǎn)10%，提高尿素氮利用率3.7%，減少尿素氮的損失率4.7% ;湯樹德等(1993)報(bào)道HQ能有效抑制土壤中尿素氮的揮發(fā)；張春興(1996)報(bào)道尿素混拌HQ作基肥施用可以減慢尿素分解速度和揮發(fā)速度，提高玉米和水稻的產(chǎn)量；從抱1(1(1977)發(fā)現(xiàn)磷酸胺類化合物可作為脲酶抑制劑以來，相繼有不少這類化合物作為脲酶抑制劑申請了專利；Martens (1984)用10余個(gè)磷酸胺類化合物進(jìn)行試驗(yàn)表明，在IOPPm時(shí),這些化合物抑制尿素水解百分率從11%至93%不等，其中O-苯基磷酰二胺(PPD)抑制率最高；Vlek (1980)發(fā)現(xiàn)，在水田中2%的PPD (與尿素重量比)與尿素一起施用，可減少氨的揮發(fā)；Kampte(1982)的工作表明，PH)可顯著減少尿素氮以氨的形式損失；ByrneS (1983)報(bào)道，5% PPD與尿素表施或混施后，氨的揮發(fā)減少了 2% ;Tomar等(1984)發(fā)現(xiàn)，2%的PH)有延緩尿素水解的趨勢；NBPT (N- 丁基硫代磷酰三胺)是另一類效果較好的脲酶抑制劑；Bremner和KrogmeieK 1988)報(bào)道，當(dāng)NBPT的用量0.01 %時(shí)，尿素肥料對種子萌發(fā)的負(fù)效應(yīng)大為減少；王小彬(1995)報(bào)道了春小麥?zhǔn)┠蛩貢r(shí)，配用NBPT因減緩了尿素的水解和減少了 NH3的揮發(fā)；Phongpans等(1995)報(bào)道，NBPT與PTO —起施用時(shí)，尿素N的揮發(fā)損失從15%降低至少3%;唐建陽等(1998)報(bào)道稻田配合尿素施用NBPT對水稻有增產(chǎn)效果；陳濟(jì)深等(1996)報(bào)道微生物代謝產(chǎn)物I36N抑制脲酶活性較NBPT特久而有效。但是由于各抑制劑或存在成本過高或存在對環(huán)境的污染和應(yīng)用效果不穩(wěn)定的情況，目前仍無一抑制劑得到大面積的推廣應(yīng)用。我們多年來在進(jìn)行脲酶抑制劑篩選工作中，首次發(fā)現(xiàn)女貞葉提取物對脲酶具強(qiáng)烈抑制作用。并且具有用量少，作用迅速且持久的特性。
[0003]尿素是目前世界及我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用面積最廣，數(shù)量最多的一種氮肥。但尿素施用到土壤中，經(jīng)脲酶分解 成碳酸銨，作物來不及吸收，碳酸銨便以氨的形式揮發(fā)，造成肥效降低，一般尿素肥效僅達(dá)30~50%。若能抑制土壤中脲酶的活性，使尿素緩慢分解成碳酸銨，作物對尿素氮的利用率則可大大提高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種女貞葉中抑制脲酶成分的提取方法及應(yīng)用，揭示了以女貞葉為原料，以有機(jī)溶劑作溶劑輔以微波作粗提，再用丙烯酰胺層析純化提取脲酶抑制成分-即尿素增效劑，并以該尿素增效劑用于抑制脲酶提高尿素氮利用的試驗(yàn)。其抑酶率達(dá)到71.2%，尿素氮利用提高了。揭示出該成果巨大的應(yīng)用前景。
[0005]其技術(shù)方案如下:
[0006]一種女貞葉中抑制脲酶成分的提取方法，包括以下步驟:
[0007]A.女貞葉中脲酶抑制成分粗提
[0008]Al女貞葉脲酶抑制劑成分的超聲波輔助提取[0009]稱取40g女貞葉粉末，加入800mL60%的乙醇溶液，進(jìn)行微波輔助提取2min，微波功率為231W，再進(jìn)行水提，水提溫度60°C，時(shí)間30min，每隔IOmin輕輕搖勻，浸提所得粗液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為5000r/min,離心時(shí)間為15min,得浸提上清液；
[0010]A2提取液減壓濃縮、萃取
[0011]將乙醇提液于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中50°C減壓濃縮至乙醇完全分離出，將濃縮液與正丁醇以體積比1:2進(jìn)行萃取，每次萃取六小時(shí)，重復(fù)萃取2次，得正丁醇(A)和水相；將水相與氯仿以體積比1:2進(jìn)行萃取，每次萃取6小時(shí)，重復(fù)萃取2次，得氯仿相(B)和水相；將水相與石油醚相以體積比1:2進(jìn)行萃取，每次萃取六小時(shí)，重復(fù)萃取2次，得石油醚相(C)和水相(D)；
[0012]B.女貞葉中脲酶抑制成分聚酰胺凝膠層析分離
[0013]BI準(zhǔn)備上樣液:將萃取得到的水相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，溫度不宜過高，45°C —55°C，超過60°C抑制脲酶活性成分會(huì)被破壞，濃縮至IOmL以下，備用；
[0014]B2基質(zhì)的處理:稱取所需的聚酰胺凝膠，以95%的乙醇浸泡24小時(shí)，充分膨脹后用乙醇法裝柱；
[0015]B3裝柱:將酒精浸泡好的基質(zhì)約50ml，通過漏斗緩慢倒入柱中，邊加邊用木夾子輕敲柱子，同時(shí)用竹簽輕輕壓實(shí)，流速控制在20滴/min，待裝至25cm柱高；
[0016]B4平衡:用95%乙醇洗柱，不時(shí)檢查流出的乙醇液，待乙醇液與去離子水以1:3的體積比混合，振搖至不顯白色渾濁，結(jié)束洗柱，用純水將柱中樹脂洗至無醇味后備用；
[0017]B5上樣與吸附:將A步驟準(zhǔn)備的樣液緩慢上柱，吸附20min，流速20滴/min，去離子水洗脫；
[0018]B6洗脫:先用蒸餾水進(jìn)行洗脫，將試管放在試管架上按序接收洗脫液，每管接收SmL洗脫液，每接收3管吸取少量試樣進(jìn)行生化檢測試驗(yàn)；待水洗樣液顏色很淺檢測不出任何成分時(shí)，再依次用95%、80%、70%、60%、50%、40%的乙醇溶液洗脫，每管接收8mL洗脫液，每接收3管吸取少量試樣進(jìn)行生化檢測試驗(yàn)；待洗脫樣液顏色很淺檢測不出任何成分時(shí)，結(jié)束洗脫；
[0019]B7聚酰胺再生。
[0020]一種本發(fā)明所述的女貞葉中抑制脲酶成分的應(yīng)用方法，水稻全生育期氮肥用尿素，分基肥、分蘗肥、長粗肥3次施用，各次比例為0.42:0.28:0.3，在各次施尿素2天后，施以3750g/hm2量的女貞葉中脲酶抑制成分，使用方法為將女貞葉中脲酶抑制成分溶解于水中再潑澆到稻田。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果:
[0022](I)本發(fā)明產(chǎn)品女貞葉中抑制脲酶成分為一生物制品，其原料為植物女貞葉片，產(chǎn)品制備過程也不涉及有毒有害產(chǎn)品，提取工藝也不致引起所提取脲酶抑制劑成分的致毒變化。與現(xiàn)有的已報(bào)道的一百多種脲酶抑制劑多為無機(jī)或有機(jī)化學(xué)成分比較，具有不污染環(huán)境的特點(diǎn)；
[0023](2)本發(fā)明產(chǎn)品由于抑制脲酶效果好，較之目前公認(rèn)最好的幾種脲酶抑制劑，如O-苯基磷酰二胺(pro)、N-丁基硫代磷酰三胺(NBPT)、氫醌(HQ)的抑酶效果要高10~30% ；
[0024](3)本發(fā)明提取脲酶抑制劑工藝采取了微波輔助提取的工藝，較與不加微波輔助工藝可以較大幅度地提高其提取效率，大約可以降低生產(chǎn)成本的10~20% ；
[0025](4)本發(fā)明提取脲酶抑制劑工藝采取了聚酰胺凝膠精制工藝，聚酰胺凝膠可以反復(fù)使用，可降低產(chǎn)品生產(chǎn)成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1是女貞葉中脲酶抑制成分的分離純化流程圖；
[0027]圖2是微波功率單因素抑制率；
[0028]圖3是料液比單因素抑制率；
[0029]圖4是微波助提時(shí)間單因素抑制率；
[0030]圖5是乙醇濃度單因素抑制率；
[0031]圖6是女貞葉提取物對脲酶的抑制作用動(dòng)力學(xué)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0033]實(shí)施例1、女貞葉抑制脲酶活性成分提取工藝條件試驗(yàn)
[0034]1、不同微波功率對脲酶抑制物提取的影響
[0035]精確稱取10份女貞葉粉末，每份1.5g，分兩組，每個(gè)料液比處理2瓶，用60%乙醇浸提，以料液比1:20投料，在不同微波功率(119W、231W、385W、539W、700W)下提取2min，再進(jìn)行水提，水提溫度60°C，時(shí)間30min，每隔IOmin輕輕搖勻。浸提所得粗液進(jìn)行離心(5000r/min, 15min)，得浸提上清液，70°C水浴5min。移液管移取2mL上清液置于試管中，加
1.0mL脲酶提取液，搖勻，室溫放置Ih后加入4mL檸檬酸鹽緩沖液(pH為6.7)及ImL0.025g/mL的尿素溶液，同時(shí)以不加尿素的為對照組，用蒸餾水定容到20mL，再加4mL苯酚鈉溶液和3mL次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻，20min后顯色、定容。Ih內(nèi)在分光光度計(jì)上于波長578nm處比色。從而確定抑酶作用最佳的微波功率。
[0036]由圖2可知，隨著微波功率的增大，抑制率逐漸上升，達(dá)到231W時(shí)，抑制率達(dá)到最大值，之后隨著微波功率的增大，抑制率逐漸降低。其原因可能是因?yàn)樵诘凸β实臅r(shí)候，細(xì)胞破壞程度較小，有效抑制成分沒有溶出，而在高功率時(shí)，溶出的有效成分失活，使得抑制率明顯降低。故可以確定最佳微波功率為231W，可選擇119W、231W、385W作為正交的三個(gè)水平。
[0037]2、不同料液比對脲酶抑制物提取的影響
[0038]精確稱取10份女貞葉粉末，每份1.5g，分兩組，每個(gè)料液比處理2瓶，微波功率設(shè)為231W，用60%乙醇浸提，按不同料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)投料，在微波輔助條件下提取2min，再進(jìn)行水提，水提溫度60°C，時(shí)間30min，每隔IOmin輕輕搖勻。浸提所得粗液進(jìn)行離心(5000r/min，15min)，得浸提上清液，70°C水浴5min。移液管移取2mL上清液置于試管中，加1.0mL脲酶提取液，搖勻，室溫放置Ih后加入4ml檸檬酸鹽緩沖液(pH為6.7)及ImL0.025g/mL的尿素溶液，同時(shí)以不加尿素的為對照組，用蒸餾水定容到20mL，再加4mL苯酚鈉溶液和3mL次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻，20min后顯色、定容。Ih內(nèi)在分光光度計(jì)上于波長578nm處比色。從而確定抑酶作用最佳料液比。
[0039]由圖3可知，女貞葉中抑制脲酶成分的抑制率隨著液料比的增加而增大，但達(dá)I: 20后，幾乎沒有太大的變化。這是因?yàn)榱弦罕冗_(dá)1:20時(shí)，基本上能將有效物質(zhì)溶出，再增大液料比時(shí)，萃取效果不明顯，也可能會(huì)增大有效成分與空氣接觸的機(jī)會(huì)，因氧化而失活，同時(shí)考慮到乙醇用量太大，溶劑消耗增大，而且還會(huì)使得后續(xù)濃縮分離操作繁瑣，浪費(fèi)時(shí)間和資源，因此最佳料液比確定為1:20。選擇1:10、1:15、1:20作為正交實(shí)驗(yàn)的三水平。
[0040]3、不同微波輔助提取時(shí)間對脲酶抑制物提取的影響
[0041]精確稱取10份女貞葉粉末，每份1.5g，分兩組，每個(gè)料液比處理2瓶，微波功率設(shè)為231W，用60%乙醇浸提 ，以料液比1:20投料，在微波輔助下提取不同的時(shí)間(lmin、2min、3min、4min、5min),再進(jìn)行水提,水提溫度60°C,時(shí)間30min,每隔IOmin輕輕搖勻。浸提所得粗液進(jìn)行離心(5000r/min，15min)，得浸提上清液，70°C水浴5min。移液管移取2mL上清液置于試管中，加1.0mL脲酶提取液,搖勻,室溫放置Ih后加入4mL檸檬酸鹽緩沖液(pH為
6.7)及ImL0.025g/mL的尿素溶液，同時(shí)以不加尿素的為對照組，用蒸懼水定容到20mL,再加4mL苯酚鈉溶液和3mL次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻，20min后顯色、定容。Ih內(nèi)在分光光度計(jì)上于波長578nm處比色。從而確定抑酶作用最佳提取時(shí)間。
[0042]由圖4可知，女貞葉中抑制脲酶成分的抑制率隨著微波提取時(shí)間的增加，變化幅度很小。微波提取達(dá)2min時(shí)，抑制率達(dá)到最大值。當(dāng)提取時(shí)間太短時(shí)，浸提可能不充分，抑制脲酶成分的含量較少。超過2min時(shí)，抑制率反而減小，可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的延長抑制脲酶的活性成分被氧化的較多，結(jié)構(gòu)受到破壞；雖然提取充分，但雜質(zhì)增多；也可能因?yàn)樘崛r(shí)間到一定程度后會(huì)導(dǎo)致纖維結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)松散紊亂使得物質(zhì)成分進(jìn)入顯微結(jié)構(gòu)中而不易被浸提出，因此選擇2min為最佳提取時(shí)間，選擇lmin、2min、3min作為正交實(shí)驗(yàn)的三水平。
[0043]4、不同乙醇濃度對脲酶抑制物提取的影響
[0044]精確稱取10份女貞葉粉末，每份1.5g，分兩組，每個(gè)料液比處理2瓶，微波功率設(shè)為231W，以料液比1:20投料，用不同濃度(20%、40%、60%、80%)的的乙醇在微波輔助條件下提取2min，再進(jìn)行水提，水提溫度60°C，時(shí)間30min，每隔IOmin輕輕搖勻。浸提所得粗液進(jìn)行離心(5000r/min，15min)，得浸提上清液，70°C水浴5min。移液管移取2mL上清液置于試管中，加1.0mL脲酶提取液，搖勻，室溫放置Ih后加入4mL檸檬酸鹽緩沖液(pH為6.7)及ImL0.025g/mL的尿素溶液，同時(shí)以不加尿素的為對照組，用蒸懼水定容到20mL,再加4mL苯酚鈉溶液和3mL次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻，20min后顯色、定容。Ih內(nèi)在分光光度計(jì)上于波長578nm處比色。從而確定抑酶作用最佳的乙醇濃度。
[0045]由圖5可知在乙醇濃度不超過60%時(shí)，隨著乙醇濃度增大，抑制率不斷增大，即抑制脲酶成分含量在不斷增加。當(dāng)乙醇濃度達(dá)60%時(shí)，抑制率明顯下降。在乙醇濃度為60%時(shí)抑制率最大，即女貞葉中抑制脲酶成分得率最高。由此可以看出，乙醇的體積分?jǐn)?shù)不宜過高或過低，乙醇濃度低于60%時(shí)，提取液中的雜質(zhì)含量較高，提取液粘度較大，過濾、濃縮、分離較難，增加濃度有利于有效成分溶出。而乙醇濃度高于60%時(shí)，溶劑揮發(fā)過大，同時(shí)高濃度乙醇使細(xì)胞蛋白質(zhì)凝固,妨礙乙醇向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散。極性增大,會(huì)加大醇溶性雜質(zhì)、色素以及親脂性強(qiáng)的成分的溶出，這些成分與有效成分競爭同乙醇水分子結(jié)合，組織的通透性下降，從而導(dǎo)致有效成分溶解度下降。故選擇60%乙醇作提取劑為宜，選定40%、60%、80%作為正交實(shí)驗(yàn)的三水平。
[0046]實(shí)施例2、女貞葉抑制脲酶活性成分提取工藝條件優(yōu)化(正交試驗(yàn))
[0047]1、實(shí)驗(yàn)原理
[0048]經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析，各因素間的影響程度差別很大，為探索各因素間的交互作用，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。由單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，得到每個(gè)因素不同水平的前三名，如果做全面試驗(yàn)需34 = 81次試驗(yàn)，而用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)L9 (34)來做只要9次。
[0049]2、實(shí)驗(yàn)操作:
[0050]表1正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
【權(quán)利要求】
1.一種女貞葉中抑制脲酶成分的提取方法，其特征在于，包括以下步驟: A.女貞葉中脲酶抑制成分粗提 Al女貞葉脲酶抑制劑成分的超聲波輔助提取 稱取40g女貞葉粉末，加入800mL60%的乙醇溶液，進(jìn)行微波輔助提取2min，微波功率為231W，再進(jìn)行水提，水提溫度60°C，時(shí)間30min，每隔IOmin輕輕搖勻，浸提所得粗液進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為5000r/min，離心時(shí)間為15min，得浸提上清液； A2提取液減壓濃縮、萃取 將乙醇提液于真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中50°C減壓濃縮至乙醇完全分離出，將濃縮液與正丁醇以體積比1:2進(jìn)行萃取，每次萃取六小時(shí)，重復(fù)萃取2次，得正丁醇和水相；將水相與氯仿以體積比1:2進(jìn)行萃取，每次萃取6小時(shí)，重復(fù)萃取2次，得氯仿相和水相；將水相與石油醚相以體積比I '2進(jìn)行萃取，每次萃取六小時(shí)，重復(fù)萃取2次，得石油醚相和水相； B.女貞葉中脲酶抑制成分聚酰胺凝膠層析分離 BI準(zhǔn)備上樣液:將萃取得到的水相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，溫度為45°C — 55°C，濃縮至IOmL以下，備用； B2基質(zhì)的處理:稱取所需的聚酰胺凝膠，以95%的乙醇浸泡24小時(shí)，充分膨脹后用乙醇法裝柱； B3裝柱:將酒精浸泡好的基質(zhì)約50ml，通過漏斗緩慢倒入柱中，邊加邊用木夾子輕敲柱子，同時(shí)用竹簽輕輕壓實(shí)，`流速控制在20滴/min，待裝至25cm柱高； B4平衡:用95%乙醇洗柱，檢查流出的乙醇液，待乙醇液與去離子水以1:3的體積比混合，振搖至不顯白色渾濁，結(jié)束洗柱，用純水將柱中樹脂洗至無醇味后備用； B5上樣與吸附:將A步驟準(zhǔn)備的樣液緩慢上柱，吸附20min，流速20滴/min，去離子水洗脫； B6洗脫:先用蒸餾水進(jìn)行洗脫，將試管放在試管架上按序接收洗脫液，每管接收SmL洗脫液，每接收3管吸取少量試樣進(jìn)行生化檢測試驗(yàn)；待水洗樣液顏色很淺檢測不出任何成分時(shí)，再依次用95%、80%、70%、60%、50%、40%的乙醇溶液洗脫，每管接收8mL洗脫液，每接收3管吸取少量試樣進(jìn)行生化檢測試驗(yàn)；待洗脫樣液顏色很淺檢測不出任何成分時(shí)，結(jié)束洗脫； B7聚酰胺再生。
2.—種權(quán)利要求1所述的女貞葉中抑制脲酶成分的應(yīng)用方法，其特征在于，水稻全生育期氮肥用尿素，分基肥、分蘗肥、長粗肥3次施用，各次比例為0.42:0.28:0.3，在各次施尿素2天后，施以3750g/hm2量的女貞葉中脲酶抑制成分，使用方法為將女貞葉中脲酶抑制成分溶解于水中再潑澆到稻田。
【文檔編號】C05G3/08GK103601602SQ201310596731
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】邱業(yè)先, 汪金蓮, 黃凱玲 申請人:蘇州科技學(xué)院