一種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法選取川貝母植株的幼嫩葉鞘為外植體，通過消毒后進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，將愈傷組織接入MS+頭孢噻肟鈉培養(yǎng)基中培養(yǎng)50天后愈傷組織表面產(chǎn)生有胚狀體，再將胚狀體以1～3個(gè)為1組切下，接入其快速生長培養(yǎng)基MS+6-BA0.1～1mg·L-1+頭孢噻肟鈉100～450mg·L-1中，在培養(yǎng)溫度為15～25℃、每天光照6～20h、光照強(qiáng)度為800～2500lx的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)60天后，胚狀體可生長為綠色的川貝母小植株。本發(fā)明成功地利用了一定濃度的抗生素類化學(xué)因子誘導(dǎo)出川貝母胚狀體，為川貝母胚狀體的繁殖提供了一條新途徑。
【專利說明】一種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]川貝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)是百合科多年生草本植物，以鱗莖入藥，生長在海拔3500nT4500m的高度，主產(chǎn)于四川、西藏、云南等省區(qū)。川貝母喜冷涼氣候條件，具有耐寒、喜濕、怕高溫、喜蔭蔽的特性。川貝母是重要的治療咳嗽的良藥，用于肺熱燥咳，干咳少痰，陰虛勞嗽，咯痰帶血等癥狀。川貝母植物生長在海拔2800-4700m的高山灌叢或草地中，主要依靠種子進(jìn)行有性繁殖，但因其種子存在形態(tài)和生理后熟的特性，因此存在川貝母種苗培育難度大、栽種時(shí)間長和繁殖系數(shù)低等問題。
[0003]組織培養(yǎng)技術(shù)是一項(xiàng)重要的生物技術(shù)。當(dāng)前川貝母組培技術(shù)都是通過利用川貝母的組織器官，選擇在不同生長素和細(xì)胞分裂素配比的情況下，經(jīng)過誘導(dǎo)愈傷組織、芽分化、芽增殖和生根等多個(gè)環(huán)節(jié)獲得再生植株。如劉帆等人的《提高卷葉貝母植株再生率的研究》和高燕等人的《貝母愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生》研究。這種培養(yǎng)方法不僅存在誘導(dǎo)培養(yǎng)周期長、花費(fèi)成本高的問題，而且也存在培養(yǎng)材料在長時(shí)間的培養(yǎng)過程中易發(fā)生細(xì)胞的變異，從而難以確保原物種的穩(wěn)定性。而利用組織培養(yǎng)技術(shù)培育的胚狀體具有與植物受精卵形成合子胚相似的結(jié)構(gòu)，不僅能快速、大量地獲得川貝母的再生植株，而且由于胚狀體一般都是起源于單個(gè)細(xì)胞，因此，培育出的川貝母胚狀體都具有遺傳背景上的一致性，對于開展川貝母植物的細(xì)胞分化和形態(tài)建成過程中各種生理生化的變化，結(jié)構(gòu)變化以及基因表達(dá)等有關(guān)問題的研究具有重要的意義。當(dāng)前還未見有通過采用培育川貝母胚狀體的方式獲得再生植株的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克 服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，該方法步驟簡單，可操作性 強(qiáng)，工藝穩(wěn)定，適用于在工業(yè)化大生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
一種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，它包括以下步驟:
51:選取川貝母植株的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%~75%的酒精消毒30~60s,然后用濃度為0.1%~0.15%的升萊消毒4~1Omin,最后用無菌水震蕩洗3~6次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經(jīng)過處理的葉鞘接種于培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5 ~2.0mg.L:+2,4-D I ~2mg.L:+IAA 0.1 ~Img.L 1 + 鹿糖 20 ~60g.L 1+瓊脂5.0~7.0 g.L—1中進(jìn)行培養(yǎng)，所采用的培養(yǎng)溫度16~20°C、每天光照6~14h、光照強(qiáng)度為1000~20001x的條件下誘導(dǎo)愈傷組織；
52:選取經(jīng)過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為0.5~
2.5cm2，然后接入MS+頭孢噻肟鈉200~600mg.11培養(yǎng)基中培養(yǎng)40~60天得到愈傷組織胚狀體；S3:將愈傷組織胚狀體以I~3個(gè)為I組切下，接入其快速生長培養(yǎng)基MS+6-BA 0.1~Img-1+頭孢噻肟鈉100~450mg -1中，所采用的培養(yǎng)溫度為15~25°C、每天光照6~20小時(shí)、光照強(qiáng)度為800~25001x的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)50~60天后，得到川貝母小植株。
[0006]優(yōu)選地，SI步驟中所述的外植體是位于莖基部端的幼嫩葉鞘。
[0007]優(yōu)選地，SI步驟中所述的培養(yǎng)基為 MS+6-BA 0.58mg.L_1+2,4-D 1.5mg.L_1+IAA
0.5 mg.L-1 + 鹿糖 40g.L-1 + 瓊脂 6.0g.L'
[0008]優(yōu)選地，SI步驟中所述的培養(yǎng)溫度為20°C、每天光照10h、光照強(qiáng)度為15001x。
[0009]優(yōu)選地，S2步驟中所述的培養(yǎng)基為MS+頭孢噻肟鈉200~600mg.培養(yǎng)條件為溫度15~22°C、每天光照8~16h、光照強(qiáng)度為1500~25001x。
[0010]優(yōu)選地，S2步驟中所述的培養(yǎng)基為MS+頭孢噻肟鈉400mg.L_\培養(yǎng)條件為溫度18°C、每天光照12h、光照強(qiáng)度為18001x的條件下培養(yǎng)50天。
[0011]優(yōu)選地，S3步驟中所述的胚狀體按2個(gè)為I組切下，接入胚狀體快速生長培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5mg.L-1+頭孢噻肟鈉300mg.L-1中，所采用培養(yǎng)溫度為22°C、每天光照16小時(shí)、光照強(qiáng)度為20001的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)60天。
[0012]優(yōu)選地，在完成S3步驟 培養(yǎng)后，打開培養(yǎng)瓶蓋在室內(nèi)煉苗2~4天后，將川貝母小植株從培養(yǎng)瓶中取出，洗去植株上的培養(yǎng)基后，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0013]本發(fā)明的有益效果在于:
本發(fā)明利用了一定濃度的抗生素類化學(xué)因子誘導(dǎo)出川貝母胚狀體，為當(dāng)今利用生物技術(shù)培育植物胚狀體又提供了一條新途徑。該技術(shù)可操作性強(qiáng)，具有投入少、成本低、效率高的的優(yōu)點(diǎn)，并對有效地解決川貝母種苗短缺問題具有重要現(xiàn)實(shí)意義。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所述:
實(shí)施例1:一種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，它包括以下步驟:
51:選取川貝母植株的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%~75%的酒精消毒30~60s,然后用濃度為0.1%~0.15%的升萊消毒4~IOmin,最后用無菌水震蕩洗3~6次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經(jīng)過處理的葉鞘接種于培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5 ~2.0mg.L:+2,4-D I ~2mg.L:+IAA 0.1 ~Img.L 1 + 鹿糖 20 ~60g.L 1+瓊脂5.0~7.0 g.L—1中進(jìn)行培養(yǎng)，所采用的培養(yǎng)溫度16~20°C、每天光照6~14h、光照強(qiáng)度為1000~2000 Ix的條件下誘導(dǎo)愈傷組織；
52:選取經(jīng)過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為0.5~
2.5cm2，然后接入MS+頭孢噻肟鈉200~600mg.1培養(yǎng)基中培養(yǎng)40~60天得到愈傷組織胚狀體；
53:將愈傷組織胚狀體以I~3個(gè)為I組切下，接入其快速生長培養(yǎng)基MS+6-BA0.1~Img.1+頭孢噻肟鈉100~450mg -1中，所采用的培養(yǎng)溫度為15~25°C、每天光照6~20小時(shí)、光照強(qiáng)度為800~25001x的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)50~60天后，得到川貝母小植株。
[0015]實(shí)施例2:—種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，它包括以下步驟:
S1:選取川貝母植株的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%的酒精消毒30s，然后用濃度為0.1%的升汞消毒4min，最后用無菌水震蕩洗3次,洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經(jīng)過處理的葉鞘接種于培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5mg.L^+2,4-DImg.U1HAA 0.1mg.L-1 +蔗糖20g.L-1 +瓊脂5.0g.L-1中進(jìn)行培養(yǎng)，所采用的培養(yǎng)溫度16°C、每天光照6h、光照強(qiáng)度為1000Ιχ的條件下誘導(dǎo)愈傷組織；
S2:選取經(jīng)過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為0.5~2.5cm2，然后接入MS+頭孢噻肟鈉200mg.L-1培養(yǎng)基中培養(yǎng)40天得到愈傷組織胚狀體；
S3:將愈傷組織胚狀體以2個(gè)為I組切下，接入其快速生長培養(yǎng)基MS+6-BA 0.1mg .L-1+頭孢噻肟鈉IOOmg .L-1中，所采用的培養(yǎng)溫度為15°C、每天光照6h、光照強(qiáng)度為SOOlx的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)50天后，得到川貝母小植株。
[0016]實(shí)施例3:—種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，它包括以下步驟:
S1:選取川貝母植株的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為75%的酒精消毒60s，然后用濃度為0.15%的升汞消毒lOmin，最后用無菌水震蕩洗6次,洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經(jīng)過處理的葉鞘接種于培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg.L^+2,4-D2mg.L_1+IAA Img.L—1 +鹿糖60g.L—1 +瓊脂7.0g.L—1中進(jìn)行培養(yǎng),所采用的培養(yǎng)溫度20°C、每天光照14h、光照強(qiáng)度為20001x的條件下誘導(dǎo)愈傷組織；
S2:選取經(jīng)過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為2.5cm2，然后接入MS+頭孢噻肟鈉600mg.L-1培養(yǎng)基中培養(yǎng)60天得到愈傷組織胚狀體；
S3:將愈傷組織胚狀體以3個(gè)為I組切下，接入其快速生長培養(yǎng)基MS+6-BA Img.L-1+頭孢噻肟鈉450mg .L-1中，所采用的培養(yǎng)溫度為25°C、每天光照20h、光照強(qiáng)度為25001x的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)60天后，得到川貝母小植株。
[0017]實(shí)施例4:一種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，它包括以下步驟:
51:選取川貝母植株的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%~75%的酒精消毒30~60s，然后用濃度為0.1%~0.15%的升汞消毒6min，最后用無菌水震蕩洗5次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經(jīng)過處理的葉鞘接種于培養(yǎng)基MS+6-BA0.58 mg.L_1+2,4-D 1.5mg.L_1+IAA 0.5mg.L-1 + 鹿糖 40g.L-1 + 瓊脂 6.0g.L-1 中進(jìn)行培養(yǎng)，所采用的培養(yǎng)溫度20°C、每天光照10h、光照強(qiáng)度為15001x的條件下誘導(dǎo)愈傷組織；
52:選取經(jīng)過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為1.5cm2，然后接入MS+頭孢噻肟鈉400mg.L-1培養(yǎng)基中培養(yǎng)50天得到愈傷組織胚狀體，培養(yǎng)條件為18°C、每天光照12h、光照強(qiáng)度為20001x ；
53:將愈傷組織胚狀體以2個(gè)為I組切下，接入其快速生長培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5mg .L-1+頭孢噻肟鈉350mg噸4中，所采用的培養(yǎng)溫度為22°C、每天光照16小時(shí)、光照強(qiáng)度為20001x的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)60天后，得到川貝母小植株。
[0018]在完成S3步驟培養(yǎng)后，打開培養(yǎng)瓶蓋在室內(nèi)煉苗2~4天后，將川貝母小植株從培養(yǎng)瓶中取出，洗去植株上的培養(yǎng)基后，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0019]實(shí)施例5:—種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，它包括以下步驟:
S1:選取川貝母植株位于莖基部端的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為72%的酒精消毒40s，然后用濃度為0.12%~0.15%的升汞消毒5 min，最后用無菌水震蕩洗4次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經(jīng)過處理的葉鞘接種于培養(yǎng)基MS+6-BA0.8 mg.L_1+2,4-D 1.2mg.L_1+IAA 0.6mg.L-1 + 鹿糖 30g.L-1 + 瓊脂 5.5g.L-1 中進(jìn)行培養(yǎng)，所采用的培養(yǎng)溫度18°C、每天光照8h、光照強(qiáng)度為12001x的條件下誘導(dǎo)愈傷組織；
52:選取經(jīng)過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為0.5~
1.0cm2，然后接入MS+頭孢噻肟鈉300mg. 1培養(yǎng)基中培養(yǎng)45天得到愈傷組織胚狀體；
53:將愈傷組織胚狀體以2個(gè)為I組切下，接入其快速生長培養(yǎng)基MS+6-BA 0.6mg - 1+頭孢噻肟鈉250mg噸4中，所采用的培養(yǎng)溫度為18°C、每天光照10小時(shí)、光照強(qiáng)度為12001x的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)55天后，得到川貝母小植株。
[0020]在完成S3步驟培養(yǎng)后，打開培養(yǎng)瓶蓋在室內(nèi)煉苗3天后，將川貝母小植株從培養(yǎng)瓶中取出，洗去植株上的培養(yǎng)基后，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0021]實(shí)施例6:—種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，它包括以下步驟:
S1:選取川貝母植株位于莖基部端的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%~75%的酒精消毒30~60s，然后用濃度為0.1%~0.15%的升汞消毒4~lOmin，最后用無菌水震蕩洗3~6次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經(jīng)過處理的葉鞘接種于培養(yǎng)基 MS+6-BA 0.5 ~2.0mg.L:+2,4-D I ~2mg.L:+IAA 0.1 ~Img.L 1 + 鹿糖20~60g. 1 +瓊脂5.0~7.0g. 1中進(jìn)行培養(yǎng)，所采用的培養(yǎng)溫度16~18°C、每天光照10~12h、光照強(qiáng)度為1500~18001x的條件下誘導(dǎo)愈傷組織；
52:選取經(jīng)過SI步 驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為1.0~
2.0cm2,然后接入MS+頭孢噻肟鈉300~400mg.L—1培養(yǎng)基中培養(yǎng)45~50天得到愈傷組織胚狀體；
53:將愈傷組織胚狀體以3個(gè)為I組切下，接入其快速生長培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5~Img - 1+頭孢噻肟鈉300~400mg - 1中，所采用的培養(yǎng)溫度為18~20°C、每天光照10~15小時(shí)、光照強(qiáng)度為1500~20001x的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)50~55天后，得到川貝母小植株。
[0022]在完成S3步驟培養(yǎng)后，打開培養(yǎng)瓶蓋在室內(nèi)煉苗2~4天后，將川貝母小植株從培養(yǎng)瓶中取出，洗去植株上的培養(yǎng)基后，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0023]實(shí)施例7:—種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，它包括以下步驟:
51:選取川貝母植株的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%~75%的酒精消毒50~60s,然后用濃度為0.1%~0.15%的升萊消毒6~8min,最后用無菌水震蕩洗5次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經(jīng)過處理的葉鞘接種于培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg.L-1+2,4_D 2mg.L_1+IAA Img.L-1 + 鹿糖 50g.L-1 + 瓊脂 6.0g.L-1 中進(jìn)行培養(yǎng)，所采用的培養(yǎng)溫度16~18°C、每天光照10~12h、光照強(qiáng)度為1800~2000 Ix的條件下誘導(dǎo)愈傷組織；
52:選取經(jīng)過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為0.5~
1.5cm2，然后接入MS+頭孢噻肟鈉400~500mg. 1培養(yǎng)基中培養(yǎng)40天得到愈傷組織胚狀體；
53:將愈傷組織胚狀體以3個(gè)為 I組切下，接入其快速生長培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5~Img - 1+頭孢噻肟鈉400~450mg - 1中，所采用的培養(yǎng)溫度為20~25°C、每天光照15~20h、光照強(qiáng)度為2000~25001x的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)50天后，得到川貝母小植株。
[0024]在完成S3步驟培養(yǎng)后，打開培養(yǎng)瓶蓋在室內(nèi)煉苗2~4天后，將川貝母小植株從培養(yǎng)瓶中取出，洗去植株上的培養(yǎng)基后，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0025]實(shí)施例8:一種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，它包括以下步驟:S1:選取川貝母植株位于莖基部端的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%~75%的酒精消毒30~60s，然后用濃度為0.1%~0.15%的升汞消毒4~lOmin，最后用無菌水震蕩洗3~6次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經(jīng)過處理的葉鞘接種于培養(yǎng)基 MS+6-BA 0.58mg.L_1+2,4-D 1.5mg.L_1+IAA 0.5mg. 1 + 蔗糖 40g. 1 + 瓊脂6.0g.L-1中進(jìn)行培養(yǎng)，所采用的培養(yǎng)溫度為20°C、每天光照10h、光照強(qiáng)度為15001x的條件下誘導(dǎo)愈傷組織；
52:選取經(jīng)過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為0.5~
2.5cm2,然后接入MS+頭孢噻肟鈉，400mg. 1培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度18°C、每天光照12h、光照強(qiáng)度為18001X的條件下培養(yǎng)50天，得到愈傷組織胚狀體；
53:將愈傷組織胚狀體以I~3個(gè)為I組切下，接入其快速生長培養(yǎng)基MS+6-BA 0.1~Img. 1+頭孢噻肟鈉100~450mg. 1中，所采用的培養(yǎng)溫度為18°C、每天光照12小時(shí)、光照強(qiáng)度為18001x的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)50天后，得到川貝母小植株。
[0026]在完成S3步驟培養(yǎng)后，打開培養(yǎng)瓶蓋在室內(nèi)煉苗3天后，將川貝母小植株從培養(yǎng)瓶中取出，洗去植株上的培養(yǎng)基后，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0027]實(shí)施例9:一種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，它包括以下步驟:
51:選取川貝母植株的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%~75%的酒精消毒40~50s,然后用濃度為0.1%~0.15%的升萊消毒6~8 min,最后用無菌水震蕩洗5次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經(jīng)過處理的葉鞘接種于培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5 ~2.0mg.L:+2,4-D I ~2mg.L:+IAA 0.1 ~Img.L 1 + 鹿糖 20 ~60g.L 1+瓊脂5.0~7.0 g.L—1中進(jìn)行培養(yǎng)，所采用的培養(yǎng)溫度16~20°C、每天光照6~14h、光照強(qiáng)度為1000~2000 Ix的條件下誘導(dǎo)愈傷組織；
52:選取經(jīng)過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為0.5~
2.5cm2，然后接入MS+頭孢噻肟鈉200~600mg. 1培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度18°C、每天光照12h、光照強(qiáng)度為18001X的條件下培養(yǎng)50天，得到愈傷組織胚狀體；
53:將愈傷組織胚狀體以I~3個(gè)為I組切下，接入其快速生長培養(yǎng)基MS+6-BA 0.1~Img- 1+頭孢噻肟鈉100~450mg -T1中，所采用的培養(yǎng)溫度為15~25°C、每天光照6~20小時(shí)、光照強(qiáng)度為800~25001x的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)50~60天后，得到川貝母小植株。
[0028]在完成S3步驟培養(yǎng)后，打開培養(yǎng)瓶蓋在室內(nèi)煉苗2~4天后，將川貝母小植株從培養(yǎng)瓶中取出，洗去植株上的培養(yǎng)基后，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0029]實(shí)施例10:—種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，它包括以下步驟:
S1:選取川貝母植株位于莖基部端的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%~75%的酒精消毒30~60s，然后用濃度為0.1%~0.15%的升汞消毒4~lOmin，最后用無菌水震蕩洗3~6次，洗后用已滅菌的濾`紙吸干材料表面的水分，將經(jīng)過處理的葉鞘接種于培養(yǎng)基 MS+6-BA 0.58mg.L_1+2,4-D 1.5mg.L_1+IAA 0.5mg. 1 + 蔗糖 40g. 1 + 瓊脂6.0g.L-1中進(jìn)行培養(yǎng)，所采用的培養(yǎng)溫度為20°C、每天光照10h、光照強(qiáng)度為15001x的條件下誘導(dǎo)愈傷組織；
S2:選取經(jīng)過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為0.5~
2.5cm2,然后接入MS+頭孢噻肟鈉400mg.?Λ培養(yǎng)條件為溫度18°C、每天光照12h、光照強(qiáng)度為18001X的條件下培養(yǎng)50天，得到愈傷組織胚狀體；S3:將愈傷組織胚狀體以3個(gè)為I組切下，接入其快速生長培養(yǎng)基MS+頭孢噻肟鈉400mg.L_\培養(yǎng)條件為溫度22°C、每天光照16h、光照強(qiáng)度為20001x的條件下培養(yǎng)60天，得到川貝母小植株。
[0030]在完成S3步驟培養(yǎng)后，打開培養(yǎng)瓶蓋在室內(nèi)煉苗2~4天后，將川貝母小植株從培養(yǎng)瓶中取出，洗去植株上的培養(yǎng)基后，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0031]實(shí)施例11:一種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，它包括以下步驟:
S1:選取川貝母植株莖基部端的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，放在超凈臺上用濃度為70%的酒精消毒40s，接著用濃度為0.1%的升汞消毒8min，最后用無菌水震蕩洗5次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，接種于MS+6-BA 0.8mg.^+2,4-D1.5mg.r+IAA 0.5mg.L-1 + 蔗糖 40g.L-1+ 瓊脂 6.0g.L-1 中，在培養(yǎng)溫度 20°C、每天光照10h、光照強(qiáng)度為15001x的條件下誘導(dǎo)愈傷組織；
52:選取顏色為白色和淡黃色、質(zhì)地較緊密和生長速度快的愈傷組織，切成大小為2cm2的大小接入MS+頭孢噻肟鈉400mg. 1培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)條件為溫度18°C、每天光照12h、光照強(qiáng)度為18001x的條件下培養(yǎng)50天后，可見在愈傷組織的表面有3~6個(gè)左右白色或黃白色、體積較大的園球形胚狀體產(chǎn)生；
53:將胚狀體按2個(gè)為I組切下，接入胚狀體快速生長培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5mg. 1+頭孢噻肟鈉300mg - 1中，在培養(yǎng)溫度為22°C、每天光照16h、光照強(qiáng)度為20001x的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)60天后，可見胚狀體快 速生長為健壯的川貝母綠色小植株。
[0032]選取生長在2cm以上的川貝母小植株，打開瓶蓋在室內(nèi)煉苗3天后，將川貝母小植株從培養(yǎng)瓶中取出，并將川貝母小植株分割為單株后，洗去植株上的培養(yǎng)基，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0033]下面通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明本發(fā)明的效果:
實(shí)驗(yàn)一:本發(fā)明川貝母胚狀體產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)
S1:選取川貝母植株莖基部端的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，放在超凈臺上用濃度為70%的酒精消毒40s，接著用濃度為0.1%的升汞消毒8min，最后用無菌水震蕩洗5次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，接種于MS+6-BA 0.8mg.^+2,4-D1.5mg.r+IAA 0.5mg.L-1 + 蔗糖 40g.L-1+ 瓊脂 6.0g.L-1 中，在培養(yǎng)溫度 20°C、每天光照10h、光照強(qiáng)度為15001x的條件下誘導(dǎo)愈傷組織；
52:選取顏色為白色和淡黃色、質(zhì)地較緊密和生長速度快的愈傷組織，切成大小為2cm2的大小接入MS+頭孢噻肟鈉400mg. 1培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)條件為溫度18°C、每天光照12h、光照強(qiáng)度為18001x的條件下培養(yǎng)50天后，可見在愈傷組織的表面有3~6個(gè)左右白色或黃白色、體積較大的園球形胚狀體產(chǎn)生；
53:將胚狀體按2個(gè)為I組切下，接入胚狀體快速生長培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5mg. 1+頭孢噻肟鈉300mg - 1中，在培養(yǎng)溫度為22°C、每天光照16h、光照強(qiáng)度為20001x的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)60天后，可見胚狀體快速生長為健壯的川貝母綠色小植株。
[0034]選取生長 在 2cm以上的川貝母小植株，打開瓶蓋在室內(nèi)煉苗3天后，將川貝母小植株從培養(yǎng)瓶中取出，并將川貝母小植株分割為單株后，洗去植株上的培養(yǎng)基，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
[0035]實(shí)驗(yàn)二:在實(shí)驗(yàn)一 S2步驟中將誘導(dǎo)胚狀體產(chǎn)生的培養(yǎng)基改為MS+頭孢噻肟鈉200mg噸―1，其它步驟同實(shí)驗(yàn)一；經(jīng)50天培養(yǎng)后，在愈傷組織的表面上產(chǎn)生胚狀體數(shù)量較少，只有I~3個(gè)。
[0036]實(shí)驗(yàn)三:在實(shí)驗(yàn)一 S2步驟中將誘導(dǎo)胚狀體產(chǎn)生的培養(yǎng)基改為MS+頭孢噻肟鈉600mg噸―1，其它步驟同實(shí)驗(yàn)一；經(jīng)50天培養(yǎng)后，在愈傷組織的表面上產(chǎn)生胚狀體數(shù)量較多，有6~10個(gè)左右。但產(chǎn)生胚狀體的質(zhì)量不佳，形狀均為細(xì)長的圓錐形，顏色也多為黃色，并伴有少量的褐化現(xiàn)象。
[0037]實(shí)驗(yàn)四:在實(shí)驗(yàn)一 S3步驟中，將胚狀體再生川貝母小植株的培養(yǎng)條件改為:培養(yǎng)溫度為15°C、每天光照6小時(shí)和光照強(qiáng)度為SOOlx的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，其它步驟同實(shí)驗(yàn)一；經(jīng)60天培養(yǎng)后，胚狀體再生川貝母小植株為綠黃色、較矮小。[0038]實(shí)驗(yàn)五:在實(shí)驗(yàn)一 S2步驟中改選為黃色、質(zhì)地疏松的愈傷組織為外植體誘導(dǎo)胚狀體產(chǎn)生，其它步驟同實(shí)驗(yàn)一；經(jīng)50天培養(yǎng)后，可見在疏松愈傷組織的表面有形狀為細(xì)長錐形的胚狀體產(chǎn)生，但產(chǎn)生的胚狀體質(zhì)量不佳，并伴有明顯的玻璃化現(xiàn)象，使得后期培養(yǎng)的川貝母小植株不能健康生長。
[0039]實(shí)驗(yàn)六:將實(shí)驗(yàn)一 S2步驟中，誘導(dǎo)胚狀體的培養(yǎng)基改為只選擇基本培養(yǎng)基MS0，而未加任何濃度的抗生素，其它步驟同實(shí)施例1 ;經(jīng)50天培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)愈傷組織只產(chǎn)生了少量的增殖，但未見有胚狀體產(chǎn)生。
[0040]實(shí)驗(yàn)七:在實(shí)驗(yàn)一 S3步驟中，胚狀體再生川貝母小植株的培養(yǎng)基改為MS+6-BA2mg.L-1+頭孢噻肟鈉600mg.L-1中，其它步驟同實(shí)施例1 ;經(jīng)60天培養(yǎng)后，再生的川貝母小植株生長緩慢，形態(tài)矮小，并有部分出現(xiàn)褐化狀況。
[0041]實(shí)驗(yàn)八:在實(shí)驗(yàn)一 S3步驟中胚狀體再生川貝母小植株的培養(yǎng)條件改為在每天在無光照的條件下培養(yǎng)，其它步驟同實(shí)施例1 ;經(jīng)60天培養(yǎng)后，胚狀體表現(xiàn)為自身體積明顯增大，但生長出的川貝母植株為矮小的黃化苗。
[0042]實(shí)驗(yàn)九:在實(shí)驗(yàn)一 S3步驟中，胚狀體再生川貝母小植株的培養(yǎng)條件改為，在培養(yǎng)溫度為26°C、每天光照24小時(shí)以上和光照強(qiáng)度為30001x的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)60天后，盡管胚狀體抽苗較快，但抽出的川貝母植株多為細(xì)高狀，顏色也多為黃綠色、還伴有明顯的玻璃化現(xiàn)象產(chǎn)生。
[0043]本發(fā)明采用組織培養(yǎng)技術(shù)，以川貝母植株幼嫩葉鞘誘導(dǎo)的愈傷組織為培養(yǎng)材料，建立了由抗生素類化學(xué)因子誘導(dǎo)出川貝母胚狀體的快速繁殖技術(shù)，該研究為川貝母優(yōu)良品種的培育和大量快速繁殖提供了新途徑。另外實(shí)施本發(fā)明方法，只需有簡單的植物組織培養(yǎng)設(shè)備即可進(jìn)行，因此實(shí)用性強(qiáng)，培養(yǎng)成本降，可行性高，同時(shí)也為利用組織培養(yǎng)技術(shù)培育植物胚狀體又提供了一條新途徑。
【權(quán)利要求】
1.一種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，其特征在于:它包括以下步驟: S1:選取川貝母植株的幼嫩葉鞘為外植體，用流水沖洗干凈后，用濃度為70%~75%的酒精消毒30~60s,然后用濃度為0.1%~0.15%的升萊消毒4~IOmin,最后用無菌水震蕩洗3~6次，洗后用已滅菌的濾紙吸干材料表面的水分，將經(jīng)過處理的葉鞘接種于培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5 ~2.0mg *L:+2,4-D I ~2mg *L:+IAA 0.I ~Img *L 1 + 鹿糖 20 ~60g.L1+瓊脂5.0~7.0g.1中進(jìn)行培養(yǎng)，所采用的培養(yǎng)溫度16~20°C、每天光照6~14h、光照強(qiáng)度為1000~20001x的條件下誘導(dǎo)愈傷組織； S2:選取經(jīng)過SI步驟處理的顏色為白色和淡黃色的愈傷組織，切成大小為0.5~2.5cm2，然后接入MS+頭孢噻肟鈉200~600mg.1培養(yǎng)基中培養(yǎng)40~60天得到愈傷組織胚狀體； S3:將愈傷組織胚狀體以I~3個(gè)為I組切下，接入其快速生長培養(yǎng)基MS+6-BA 0.1~Img-1+頭孢噻肟鈉100~450mg -T1中，所采用的培養(yǎng)溫度為15~25°C、每天光照6~20小時(shí)、光照強(qiáng)度為800~25001x的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)50~60天后，得到川貝母小植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，其特征在于:S1步驟中所述的外植體是位于莖基部端的幼嫩葉鞘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，其特征在于:S1步驟中所述的培養(yǎng)基為 MS+6-BA 0.58mg.L:+2,4-D 1.5mg.L:+IAA 0.5mg.L 1 + 鹿糖 40g.L 1+ 瓊脂 6.0g.L'
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，其特征在于:S1步驟中所述的培養(yǎng)溫度為20°C、每天光照10h、光照強(qiáng)度為15001x。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，其特征在于:S2步驟中所述的培養(yǎng)基為MS+頭孢噻肟鈉200~600mg.L—1，培養(yǎng)條件為溫度15~22°C、每天光照8~16h、光照強(qiáng)度為1500~25001x。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，其特征在于:S2步驟中所述的培養(yǎng)基為MS+頭孢噻肟鈉400mg.L_\培養(yǎng)條件為溫度18°C、每天光照12h、光照強(qiáng)度為18001x的條件下培養(yǎng)50天。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，其特征在于:S3步驟中所述的胚狀體按2個(gè)為I組切下，接入胚狀體快速生長培養(yǎng)基MS+6-BA 0.5mg -1+頭孢噻肟鈉300 mg.1中，所采用培養(yǎng)溫度為22°C、每天光照16小時(shí)、光照強(qiáng)度為20001x的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)60天。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)川貝母胚狀體產(chǎn)生的方法，其特征在于:在完成S3步驟培養(yǎng)后，打開培養(yǎng)瓶蓋在室內(nèi)煉苗2~4天后，將川貝母小植株從培養(yǎng)瓶中取出，洗去植株上的培養(yǎng)基后，再將其移栽至松軟的土壤中生長。
【文檔編號】A01H4/00GK103461137SQ201310436775
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日
【發(fā)明者】薛剛, 王躍華, 余強(qiáng), 王曉蓉 申請人:薛剛