梔子組織培養(yǎng)的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及梔子組織培養(yǎng)的方法，包括：（a）以梔子種子作為外植體，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)；（b）將愈傷組織在液體分化培養(yǎng)基中分化，以得到帶芽愈傷組織；（c）將帶芽愈傷組織在芽增殖固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以獲得更多的再生芽；以及（d）將所得芽從基部切下，轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中以誘導(dǎo)生根。本發(fā)明以梔子種子為外植體，在含有不同激素配比的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織形成；采用固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)相結(jié)合的方法，誘導(dǎo)芽及根的分化，獲得梔子再生苗。本發(fā)明建立了以梔子生殖器官為外植體的組織培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步通過細(xì)胞培養(yǎng)獲得梔子高含量有效成分及為梔子轉(zhuǎn)基因研究構(gòu)建了實(shí)驗(yàn)平臺。
【專利說明】栃子組織培養(yǎng)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及茜草科藥用植物桅子的組織培養(yǎng)方法，具體涉及利用桅子未成熟種子作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]桅子(Gardeniajasminoides Ellis)為菌草科常綠灌木，其干燥成熟果實(shí)具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒等功效(國家藥典委員會，2010)，為《中華人民共和國藥典》(2010版)I部收載的臨床常用中藥材，也是生產(chǎn)“清開靈”、“安宮牛黃丸”等33種中成藥的重要原料。桅子的活性成分為桅子苷、西紅花苷、綠原酸等，其中西紅花苷還是天然色素桅子黃色素的主要成分。培養(yǎng)植物細(xì)胞可以獲得次級代謝產(chǎn)物，但培養(yǎng)的細(xì)胞來源不同，獲得的次級代謝產(chǎn)物的種類和含量不一樣。選擇目的次級代謝產(chǎn)物含量高的植物組織作培養(yǎng)材料往往能獲得高含量的目的次級代謝產(chǎn)物。桅子全果實(shí)、種子、果皮的桅子苷和西紅花苷的含量較高，以這些器官為外植體進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，有可能獲得高含量的活性成分。木本植物的組織培養(yǎng)一般比較困難，目前還沒有以桅子生殖器官為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，進(jìn)而分化再生成苗的報(bào)道。
[0003]迄今為止，有關(guān)桅子組織培養(yǎng)的報(bào)道大致分三類:第一類是由桅子帶腋芽莖段的外植體不經(jīng)愈傷組織的分化，直接獲得桅子的無菌苗；第二類是由胚軸、胚根、子葉、花苞作為外植體，誘導(dǎo)桅子愈傷組織，但未研究其分化；第三類以葉片為外植體，既誘導(dǎo)出愈傷組織，也成功使其分化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種桅子的組織培養(yǎng)方法，該方法包括:(a)以桅子種子作為外植體，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)；(b)將愈傷組織在液體分化培養(yǎng)基中分化，以得到帶芽愈傷組織；(C)將帶芽愈傷組織在芽增殖固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以獲得更多再生芽；以及(d)將所得芽從基部切下，轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中以誘導(dǎo)生根。
[0005]在優(yōu)選的方案中，所述種子是未成熟種子，該未成熟種子可取自未成熟或成熟桅子果實(shí)。
[0006]在一個實(shí)施方式中，步驟(b)中的液體分化培養(yǎng)條件為溫度25 V 土 2 °C，光照時間 10-16 h.d \ 光照強(qiáng)度 20.1 ± 4.0 μ mo I.m 2.s \ 轉(zhuǎn)速 50-150 r.min \ 培養(yǎng)基為以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加NAA 0.025-0.1 mg.-1和TDZ 0.05-0.15 mg.?Λ或以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加NAA 0.025-0.1 mg.171和6-BA 2.0 mg.?Λ優(yōu)選為MS培養(yǎng)基+ΝΑΑ0.05mg.L -TDZ 0.10 mg.L、
[0007]在一個實(shí)施方式中，步驟(C)中的固體芽增殖培養(yǎng)基為以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加瓊脂以及NAA 0.025-0.1 mg.-1和TDZ 0.05-0.15 mg.?Λ或以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加瓊脂以及NAA 0.025-0.1 mg.-1和6-BA 2 mg.?Λ優(yōu)選為MS培養(yǎng)基+瓊脂+NAA 0.05mg.L 1 +TDZ 0.1mg.L、[0008]在一個實(shí)施方式中，步驟(d)中的生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+ NAA 0.5 mg.-1 +6-BA 2.0 mg.L 1 ο
[0009]在一個實(shí)施方式中，步驟(d)中生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件:溫度25 °C ± 2 °C，濕度40% -60%,光照強(qiáng)度 33.6 ± 0.7 μ mo I.m 2.s、
[0010]在一個實(shí)施方式中，步驟(d)中從基部切下的芽的長度為1-2 cm。
[0011]在一個實(shí)施方式中，步驟(a)中愈傷組織誘導(dǎo)使用的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+2，4_D
0.5-1 mg.L-1+ 6-BA 0.25-1 mg.?Λ 優(yōu)選為 MS 培養(yǎng)基+2，4_D 0.5-1 mg.L-1+ 6-BA
0.25-0.5 mg.L 1 o
[0012]本發(fā)明以桅子種子為外植體，在含有不同激素配比的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織形成；采用固體培養(yǎng)與液體培養(yǎng)相結(jié)合的方法，誘導(dǎo)芽及根的分化，獲得桅子再生苗。本發(fā)明建立了以桅子生殖器官為外植體的組織培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步通過細(xì)胞培養(yǎng)獲得桅子高含量有效成分及為桅子轉(zhuǎn)基因研究構(gòu)建了實(shí)驗(yàn)平臺。
[0013]本發(fā)明通過培養(yǎng)基種類和培養(yǎng)方式的改變，只有種子愈傷組織能夠分化出芽，而果皮和種子團(tuán)愈傷組織沒有出現(xiàn)芽的分化。雖然經(jīng)過液體培養(yǎng)能從種子愈傷組織中分化出芽，也盡管分化率只有8.75%，而同樣的培養(yǎng)方式未能使果皮及種子團(tuán)愈傷組織分化，說明以桅子的生殖器官為外植體獲得的愈傷組織難以分化。如果是以桅子營養(yǎng)器官為外植體，目前只有少數(shù)報(bào)道稱能從桅子葉片愈傷組織中分化出芽。
【具體實(shí)施方式】
[0014]本發(fā)明選取桅子的果皮、種子團(tuán)、種子作為外植體，分別進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)、分化、芽增殖和生根培養(yǎng)，從而評價(jià)果實(shí)的不同部分作為外植體時，桅子組織培養(yǎng)的可行性。
[0015]1.植物材料
以桅子的果皮、種子團(tuán)、種子作為外植體。桅子采自廣東省梅州市平遠(yuǎn)縣桅子GAP基地。將青色的、未成熟新鮮桅子果實(shí)分割為果皮、種子團(tuán)(由胎座和未成熟種子組成)、種子，于自來水下沖洗，直至色素沖洗干凈為止(2-3 h)。在超凈工作臺上將3種外植體一起放入70%乙醇中浸泡30 S，然后用0.1% HgCl2浸泡9 min，最后用無菌水沖洗5_6次，轉(zhuǎn)移至消毒好的無菌濾紙上吸干外植體表面的水分，備用。
[0016]2.培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件
2.1培養(yǎng)基成分
以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加蔗糖30 g.L_\ pH5.8-6.0。各種培養(yǎng)基是在基本培養(yǎng)基中分別添加2，4-D (2，4_ 二氣苯氧基,購自Aladdin Chemistry C0.Ltd.)、NAA (萘乙酸，購自 Aladdin Chemistry C0.Ltd.)、6_BA (6-節(jié)氨基嘌呤，購自 Aladdin ChemistryC0.Ltd.)、TDZ (N-苯基-N’ -1,2，3-噻二唑-5-脲，購自上海源聚生物科技有限公司)等(表1、表2)。固體培養(yǎng)基含瓊脂7.5 g.L—1，液體培養(yǎng)基不含瓊脂。
[0017]2.2愈傷組織的誘導(dǎo)
在無菌條件下將經(jīng)消毒的果皮、種子團(tuán)切成約5 mm X 5 mm的小塊；將飽滿、白色、大小約1-2 mm的未成熟種子從種子團(tuán)中挑出，剝?nèi)シN皮，隨機(jī)切成兩半。將三種外植體分別接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(見表I)中，果皮、種子團(tuán)每瓶接種I塊，種子每瓶接種5塊。在溫度25 0C 土 2 °C、濕度40%-60%的培養(yǎng)條件下暗培養(yǎng)。培養(yǎng)30 d天后，篩選生長良好的愈傷組織，繼代3次，獲得適合液體培養(yǎng)的愈傷組織。
[0018]2.3愈傷組織的分化
將繼代所得愈傷組織塊接種于液體培養(yǎng)基(見表2)中培養(yǎng)30 d。液體培養(yǎng)條件:溫度 25 °C ±2 °C，光照時間 13 h.cf1，光照強(qiáng)度 20.1 ±4.0 μ mol.π2.s'轉(zhuǎn)速 100r.mirf1。
[0019]2.4芽的增殖
液體培養(yǎng)30 d后，將帶芽愈傷組織塊轉(zhuǎn)移至芽增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行固體培養(yǎng)。每瓶接種4塊帶芽愈傷組織，每隔30 d繼代一次。
[0020]2.5生根培養(yǎng)
將長1-2 cm的芽從基部切下，轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。培養(yǎng)條件:溫度25 V土 2 °〇，濕度40%-60%，光照強(qiáng)度33.6 ±0.7 μ mol.π2.s'
[0021]2.6結(jié)果統(tǒng)計(jì)
2.6.1愈傷組織誘導(dǎo)率 分別在外植體培養(yǎng)第10、20、30、40 d，觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率=(出愈外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))X 100%。
[0022]2.6.2愈傷組織分化率
液體培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化率。分化率=(分化出芽的愈傷組織塊數(shù)/愈傷組織總塊數(shù))X 100%。
[0023]2.6.3芽增殖系數(shù)
液體培養(yǎng)后將芽轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d，并繼代一次，分別統(tǒng)計(jì)每次固體培養(yǎng)的全部的芽數(shù)。芽增殖系數(shù)=全部增殖芽數(shù)/接種芽數(shù)。
[0024]3.結(jié)果與討論
3.1不同激素組合對三種外植體的愈傷組織誘導(dǎo)的影響
不同培養(yǎng)基對三種外植體愈傷組織誘導(dǎo)的結(jié)果見表I。適宜果皮和種子脫分化形成愈傷組織的培養(yǎng)基激素組合都是MS-A，兩者出愈時間大致相同；適宜種子團(tuán)形成愈傷組織的是MS-D，出愈時間比果皮和種子的出愈時間稍長。果皮和種子在培養(yǎng)9-10 d后開始從切口邊緣長出淺黃色愈傷組織；種子團(tuán)培養(yǎng)15 d后才開始從切口面長出淺黃色愈傷組織。三種外植體形成的愈傷組織的質(zhì)量不同。果皮出愈時間雖短，但極易褐化，較難進(jìn)行繼代培養(yǎng)；種子出愈時間與果皮相似，愈傷組織生長狀態(tài)很好，且不易褐化；種子團(tuán)出愈時間最遲，愈傷組織生長狀態(tài)卻很好，也不易褐化。
[0025]表I結(jié)果表明，果皮、種子兩種外植體在MS-A培養(yǎng)基上誘導(dǎo)效果較好，誘導(dǎo)率分別達(dá)到83.3%和88.5% ;種子團(tuán)外植體在MS-D培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率則為78.1%。結(jié)果表明適當(dāng)濃度的2，4-D和6-BA配比，對桅子果實(shí)各部分愈傷組織的誘導(dǎo)具有一定的促進(jìn)作用。果皮、種子較適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS-A，種子團(tuán)較適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS-D。
[0026]表I不同激素組合對三種外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響
【權(quán)利要求】
1.桅子組織培養(yǎng)的方法，包括: Ca)以桅子的種子作為外植體，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)； (b)將愈傷組織在液體分化培養(yǎng)基中分化，以得到帶芽愈傷組織； (c)將帶芽愈傷組織在芽增殖固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以獲得更多再生芽； (d)將所得芽從基部切下，轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中以誘導(dǎo)生根。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述種子是取自未成熟果實(shí)中的未成熟種子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(b)中的液體分化培養(yǎng)條件為溫度25V 土2 °C ,光照時間 10-16 h.d S 光照強(qiáng)度 20.1 + 4.0 μ mol.ηι2 *s \ 轉(zhuǎn)速 50-150 r *min \培養(yǎng)基為以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加NAA 0.025-0.1 mg.L-1和TDZ 0.05-0.15 mg.?Λ或以 MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加 NAA 0.025-0.1 mg.L-11 和 6-BA 2.0 mg.L'
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(c)中的芽增殖固體培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加瓊脂以及NAA 0.025-0.1 mg.L-1和TDZ 0.05-0.15 mg.?Λ或以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加瓊脂以及 NAA 0.025-0.1 mg.L—1 和 6-BA 2.0 mg.L'
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，步驟(c)中的芽增殖固體培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+瓊脂 +NAA 0.05 mg.L-1 +TDZ 0.1mg.L'
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(d)中的生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+NAA 0.5mg.L-1 + 6-BA 2.0 mg.L-1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(d)中生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件:溫度25V 土2V，濕度 40% -60%，光照強(qiáng)度 33.6 ± 0.7 μ mo I.M-2.s-1
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(d)中從基部切下的芽的長度為1-2cm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(a)中愈傷組織誘導(dǎo)使用的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基 +2，4-D 0.5-1 mg.L-1+ 6-BA 0.25-1 mg.L'
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，步驟(a)中愈傷組織誘導(dǎo)使用的培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基 +2，4-D 0.5-1 mg.L-1+ 6-BA 0.25-0.5 mg.L'
【文檔編號】A01H4/00GK103430844SQ201310350769
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月13日
【發(fā)明者】何國振, 張慶紅, 周小琴, 楊銳培, 李同根, 陳紅, 李錦坤 申請人:廣州白云山明興制藥有限公司, 廣州中醫(yī)藥大學(xué)