一種蠟狀芽孢桿菌及其益生菌粉及該菌粉的制備和用途
【專利摘要】一種蠟狀芽孢桿菌及其益生菌粉及該菌粉的制備和用途，從健康仔豬糞便中分離、純化、篩選得到的保藏編號為CGMCC?No.7433的蠟狀芽孢桿菌BC158，該菌具有良好的耐酸、耐膽鹽性能、粘附力高、安全性高，對常見腸道致病菌具有一定的抑制性，且該菌能產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶；蠟狀芽孢桿菌益生菌粉的制備，采用逐級放大的四級培養(yǎng)工藝，通風(fēng)攪拌深層液體發(fā)酵技術(shù)實現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌BC158的高密度培養(yǎng)，結(jié)合玉米淀粉等輔料的高溫保護作用，實現(xiàn)了發(fā)酵液中蠟狀芽孢桿菌的高密度回收；該制備方法簡單，成本低廉，所制備的益生菌粉中芽孢率在95%以上，蠟狀芽孢桿菌的活菌含量為3×109-5×1010CFU/g，可應(yīng)用于動物養(yǎng)殖的飼料添加劑。
【專利說明】一種蠟狀芽孢桿菌及其益生菌粉及該菌粉的制備和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說是一種蠟狀芽孢桿菌BC158及其益生菌粉及該菌粉的制備和用途。
[0002]【背景技術(shù)】 從養(yǎng)殖場到餐桌的食品安全工程是一項非常復(fù)雜的工程，飼料安全作為食物鏈中的一個部分，無疑也是重要的一環(huán)，因此對于加強安全飼料添加劑的研發(fā)與應(yīng)用具有廣闊的前景，大有可為?，F(xiàn)代集約化畜牧生產(chǎn)限制了動物接觸土壤以及其周圍的自然環(huán)境，這種飼養(yǎng)條件下不利于動物建立胃腸道的正常菌群。當外界環(huán)境條件發(fā)生變化時，容易導(dǎo)致動物胃腸道微生態(tài)菌群失調(diào)從而降低對病原菌的抵抗力。目前主要是通過改善飼養(yǎng)管理和在日糧中添加抗生素的方法來降低這種損失，但隨著抗生素在飼料添加劑中的廣泛使用，它的弊端正日益凸現(xiàn)，如導(dǎo)致動物胃腸道菌群失調(diào)，因為長期以來抗生素一直是預(yù)防和治療仔豬黃白痢最主要的途徑，雖然在一定程度上抑制了病原菌的生長，但同時也抑制了腸道內(nèi)正常菌群發(fā)揮作用，長期的使用容易引起消化道疾病；而且耐藥菌株不斷增加，抗生素在畜禽體內(nèi)的殘留也嚴重威脅到人類的健康。鑒于此，反對在飼料中添加抗生素的呼聲越來越高。瑞典政府于1986年就開始在動物飼料中禁用抗生素類生長促進劑，1995丹麥、德國和芬蘭等國也相繼規(guī)定禁止在動物飼料中使用艾維菌素、泰樂菌素、螺旋霉素等抗生素，到2006年歐盟已全面禁止食品動物使用抗生素促生長飼料添加劑，其他發(fā)達國家，如美國、日本、韓國等也相繼實施了禁令。大部分抗生素在我國動物生產(chǎn)中也逐步被限制用于飼料。
[0003]但同時，歐盟科學(xué)程序委員會1997年提出了由于抗生素的禁用而出現(xiàn)的抗病力受阻問題。丹麥2001年發(fā)表了自1997年抗生素禁用后的5年時間內(nèi)食源性動物、食物和人類中抗菌藥物使用量、抗病力受阻問題的年度監(jiān)測報告。報告指出，飼料中抗生素的使用量減少，使豬抗病力下降，禁用抗生素后用于控制動物亞臨床疾病的成本顯著提高，尤其是動物處于管理水平一般或比較差的農(nóng)場問題更為突出。
[0004]JongbloecK 1998)指出，抗生素促生長劑導(dǎo)致荷蘭飼料利用率下降3%_8%。有研究也證實，禁用抗生素后，盡管生長豬、育肥豬應(yīng)激減少，但仔豬的生產(chǎn)性能下降。Hedegaard(2001)指出，飼料中不用抗生素促生長劑后丹麥用于治療斷奶仔豬疾病的抗生素用量增加。丹麥全國生豬生產(chǎn)委員會曾收集了 62家丹麥育肥豬生產(chǎn)企業(yè)豬群停用抗生素后的生產(chǎn)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，11%群體持續(xù)出現(xiàn)生產(chǎn)性能顯著下降等一系列問題，26%的豬群出現(xiàn)了暫時性日增重下降，只有63%的豬群未因停用而導(dǎo)致日增重下降或下痢增加的現(xiàn)象。自1995-2000年期間，從使用抗生素到減少使用量，再到禁用抗生素，斷奶保育豬日增重下降、腹瀉率增加、慢性病感染率增加、營養(yǎng)需求增加但飼料效益下降。
[0005]在這種情況下，尋求一種無毒、無殘留、應(yīng)用效果好的飼料添加劑顯得尤為必要，抗生素替代物的研究開發(fā)引起各國的重視。微生態(tài)制劑是抗生素的替代物之一，其中芽孢桿菌由于能形成休眠芽孢，具有耐高溫、耐酸等特性，具有更廣闊的應(yīng)用前景。CN102517238A曾經(jīng)報道了一種產(chǎn)酸蠟狀芽孢桿菌及菌劑制備方法，但對于飼用益生芽孢桿菌而言，同時兼具多種高水解酶活性，且具有良好安全性和高粘附能力的菌株目前還未見報道。CN102093974A曾經(jīng)報道過一株蠟狀芽孢桿菌及其多階段發(fā)酵方法，但該方法采用精細原料作為發(fā)酵培養(yǎng)基必將導(dǎo)致發(fā)酵成本的增加，而且控制過程比較復(fù)雜，缺乏發(fā)酵液結(jié)束后菌體回收工藝環(huán)節(jié)使得菌體的保藏、運輸及使用受到很大限制，因此該工藝也較難在飼用益生菌工業(yè)化生產(chǎn)過程中推廣和應(yīng)用。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明目的是為解決上述技術(shù)問題的不足，提供一種蠟狀芽孢桿菌BC158、蠟狀芽孢桿菌益菌粉及其制備方法和用途；蠟狀芽孢桿菌益菌粉的制備方法簡單，成本低廉，所制備出的蠟狀芽孢桿菌益生菌粉，蠟狀芽孢桿菌的活菌含量為3X109-5X101(lCFU/g，可應(yīng)用于動物養(yǎng)殖的飼料添加劑。
[0007]—種蠟狀芽孢桿菌益生菌粉，其具體制備步驟為:
步驟一、斜面固體培養(yǎng):將蠟狀芽孢桿菌mciUus.cereus) BC158接種在固體斜面培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h，得到斜面固體培養(yǎng)的菌種，備用；
所述的固體斜面培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，固體斜面培養(yǎng)基中含有牛肉膏0.3%-0.4%，蛋白胨1%-1.2%，氯化鈉0.5%，瓊脂粉1.5%-2%，余量為水；
步驟二、一級種子培養(yǎng): 取步驟一所制備的斜面固體培養(yǎng)的菌種1-3接種環(huán)接種于裝有80-120mL —級種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，然后34_37°C，220_250rpm搖床培養(yǎng)10-16h，得到一級種子液，備用；
所述的一級種子培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，一級種子培養(yǎng)基中含有酵母膏0.3-0.5 %，蛋白胨0.5-0.7 %，蔗糖0.5-1.0 %，磷酸氫二鈉0.3-0.6 %，硫酸鎂0.01-0.04%，硫酸錳 0.06-0.09%，余量為水；
步驟三、二級種子培養(yǎng):將上述步驟二培養(yǎng)好的一級種子液接種于裝有1.5L 二級種子培養(yǎng)基的5L三角瓶中，接種量為二級種子培養(yǎng)基體積的4-7%，然后34-37°C，220-250rpm搖床培養(yǎng)12-18h，得到二級種子液，備用；
所述的二級種子培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，二級種子培養(yǎng)基中含有蔗糖2.0-2.5 %，玉米漿1.5-2.0 %，硫酸鎂0.01-0.03 %，磷酸氫二鉀0.5-1.2 %，磷酸二氫鉀0.075-0.100%，余量為水；
步驟四、三級種子培養(yǎng):將上述步驟三培養(yǎng)好的二級種子液接種于裝有60L三級種子培養(yǎng)基的100L發(fā)酵罐中，接種量為三級種子培養(yǎng)基體積的3-5% ;然后34-37°C，150-200rpm通風(fēng)攪拌培養(yǎng)24_32h，得到三級種子培養(yǎng)液，備用；
所述的三級種子培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，三級種子培養(yǎng)基中含有玉米粉
2.5-3.5 %，豆餅粉2.5-3.0 %，玉米漿2.0-2.5 %，余量為水；
步驟五、發(fā)酵罐培養(yǎng):將上述步驟四所制備的三級種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的2-4%，然后于34-37°C，150-200rpm的通風(fēng)攪拌培養(yǎng)24_32h，鏡檢芽孢率在95 %以上，停止培養(yǎng)，放罐，得到發(fā)酵液；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，發(fā)酵培養(yǎng)基中含有玉米粉
3.0-4.0%，豆餅粉2.5-3.0%，玉米漿2.0-2.5%，氯化鈉0.5-1.0%，余量為水；
步驟六、將上述步驟五所得發(fā)酵液中添加玉米淀粉，添加量為發(fā)酵液質(zhì)量的8-15%，攪拌均勻后將所得混合物直接進行噴霧干燥，料流量恒定100-180L/h，壓力2MPa，噴霧干燥塔熱風(fēng)進口溫度180°C，出口溫度80°C噴霧干燥時間為25s，即得到水分的質(zhì)量百分比為5%，菌粉顆粒直徑約為0.06mm的蠟狀芽孢桿菌益生菌粉；或者采用三效降膜式蒸發(fā)器將所得混合物進行蒸發(fā)濃縮，一效蒸發(fā)器的蒸發(fā)溫度為85°C，二效蒸發(fā)器的蒸發(fā)溫度為75°C，三效蒸發(fā)器的蒸發(fā)溫度為65°C，當料液濃縮比達到1:3時停止?jié)饪s；將經(jīng)過濃縮后的料液用往復(fù)泵送入噴霧干燥塔進行噴霧干燥，料流量恒定100-180L/h，壓力2MPa，噴霧干燥塔熱風(fēng)進口溫度180°C，出口溫度80°C噴霧干燥時間為25s，最終獲得水分的質(zhì)量百分比為5%，菌粉顆粒直徑約為0.06mm菌粉。
[0008]有益效果 1、相關(guān)實驗證明，保藏編號為CGMCC N0.7433的蠟狀芽孢桿菌BC158具有良好的耐酸、耐膽鹽性能，并且對常見腸道致病菌具有一定的抑制性，而且該菌能產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶；該菌在PH為2的環(huán)境下，存活率均在90%以上，表現(xiàn)出良好的耐酸性能；在體外耐膽鹽試驗中也表現(xiàn)出了明顯優(yōu)勢，在0.7%的膽鹽濃度下，其存活率仍然維持在80%以上；并表現(xiàn)出高達49.68%的粘附能力；在抑菌實驗中，表現(xiàn)出了較好的抑菌活性，對腸道有害菌大腸桿菌K88，腸炎沙門氏菌和金黃色葡萄球菌具有明顯抑制效果。
[0009]2、本發(fā)明一種蠟狀芽孢桿菌益生菌粉及其制備方法，以保藏編號為CGMCC N0.7433的蠟狀芽孢桿菌BC158為菌種，該菌是從健康仔豬糞便中分離篩選得到的，并經(jīng)相關(guān)動物實驗驗證，具有良好的安全性和益生性；以玉米粉、豆餅粉和玉米漿等低廉的工業(yè)原料為發(fā)酵培養(yǎng)基，成本低廉；采用逐級放大的四級培養(yǎng)工藝，通風(fēng)攪拌深層液體發(fā)酵技術(shù)實現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌BC158的高密度培養(yǎng)，結(jié)合玉米淀粉等輔料的高溫保護作用，實現(xiàn)了發(fā)酵液中蠟狀芽孢桿菌的高密度回收，所制備的蠟狀芽孢桿菌益生菌粉中芽孢率在95%以上，蠟狀芽孢桿菌的活菌含量為3X 109-5X 101(lCFU/g。
[0010]3、本發(fā)明所制備的蠟狀芽孢桿菌益生菌粉，有利于禽類和畜類提高對飼料的利用率，可在養(yǎng)殖行業(yè)的推廣和應(yīng)用；相關(guān)實驗證明本發(fā)明所制備的蠟狀芽孢桿菌益生菌粉可促進家禽、家畜的生長、減少發(fā)病率、提高成活率，這為利用現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)“無抗”肉雞的綠色食品提供了參考依據(jù)，對于尋找抗生素替代品有著重要意義，為控制畜產(chǎn)品的安全提供了重要線索。同時，為促進我國畜產(chǎn)品發(fā)展，提升產(chǎn)品質(zhì)量的檔次，突破畜禽產(chǎn)品綠色壁壘，促進畜禽產(chǎn)品的出口創(chuàng)匯都具有非常重要的意義。
[0011]生物材料的保藏
蠟狀芽孢桿菌(Bacillus.cereus)BC158，保藏日期為2013年4月9日，保藏單位及其簡稱為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCC N0.7433。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為測定蠟狀芽孢桿菌BC158最適生長溫度的0D600值圖譜；
圖2為測定蠟狀芽孢桿菌BC158最適生長pH值的0D600值圖譜；
圖3為蠟狀芽孢桿菌BC158耐酸性檢測的0D600值圖譜；
圖4為蠟狀芽孢桿菌BC158耐膽鹽能力檢測的0D600值圖譜；
圖5為蠟狀芽孢桿菌BC158產(chǎn)淀粉酶結(jié)果圖；
圖6為蠟狀芽孢桿菌BC158產(chǎn)蛋白酶結(jié)果照圖；圖1為蠟狀芽孢桿菌BC158產(chǎn)纖維素酶結(jié)果照圖。
【具體實施方式】
[0013]一種蠟狀芽孢桿菌BC158，具有良好的耐酸、耐膽鹽性能，并且對常見腸道致病菌具有一定的抑制性，而且該菌能產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶；該菌在PH為2的環(huán)境下，存活率均在90%以上，表現(xiàn)出良好的耐酸性能；在體外耐膽鹽試驗中也表現(xiàn)出了明顯優(yōu)勢，在0.7%的膽鹽濃度下，其存活率仍然維持在80%以上；并表現(xiàn)出高達49.68%的粘附能力；在抑菌實驗中，表現(xiàn)出了較好的抑菌活性，對腸道有害菌大腸桿菌K88，腸炎沙門氏菌和金黃色葡萄球菌具有明顯抑制效果。
[0014]一種蠟狀芽孢桿菌益生菌粉，其具體制備步驟為:
步驟一、斜面固體培養(yǎng):將蠟狀芽孢桿菌mciUus.cereus) BC158接種在固體斜面培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h，得到斜面固體培養(yǎng)的菌種，備用；
所述的固體斜面培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，固體斜面培養(yǎng)基中含有牛肉膏0.3%-0.4%，蛋白胨1%-1.2%，氯化鈉0.5%，瓊脂粉1.5%-2%，余量為水；
步驟二、一級種子培養(yǎng):取步驟一所制備的斜面固體培養(yǎng)的菌種1-3接種環(huán)接種于裝有80-120mL —級種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，然后34_37°C，220_250rpm搖床培養(yǎng)10-16h，得到一級種子液，備用；
所述的一級種子培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，一級種子培養(yǎng)基中含有酵母膏0.3-0.5%,蛋白胨0.5-0.7%,蔗糖0.5-1.0%,磷酸氫二鈉0.3-0.6 %，硫酸鎂
0.01-0.04%，硫酸錳 0.06-0.09%，余量為水；
步驟三、二級種子培養(yǎng):將上述步驟二培養(yǎng)好的一級種子液接種于裝有1.5L 二級種子培養(yǎng)基的5L三角瓶中，接種量為二級種子培養(yǎng)基體積的4-7%，然后34-37°C，220-250rpm搖床培養(yǎng)12-18h，得到二級種子液，備用；
所述的二級種子培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，二級種子培養(yǎng)基中含有蔗糖
2.0-2.5 %，玉米漿1.5-2.0 %，硫酸鎂0.01-0.03 %，磷酸氫二鉀0.5-1.2 %，磷酸二氫鉀
0.075-0.100%，余量為水；
步驟四、三級種子培養(yǎng):將上述步驟三培養(yǎng)好的二級種子液接種于裝有60L三級種子培養(yǎng)基的100L發(fā)酵罐中，接種量為三級種子培養(yǎng)基體積的3-5% ;然后34-37°C，150-200rpm通風(fēng)攪拌培養(yǎng)24_32h，得到三級種子培養(yǎng)液，備用；
所述的三級種子培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，三級種子培養(yǎng)基中含有玉米粉
2.5-3.5 %，豆餅粉2.5-3.0 %，玉米漿2.0-2.5 %，余量為水；
步驟五、發(fā)酵罐培養(yǎng):將上述步驟四所制備的三級種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的2-4%，然后于34-37°C，150-200rpm的通風(fēng)攪拌培養(yǎng)24_32h，鏡檢芽孢率在95%以上，停止培養(yǎng)，放罐，得到發(fā)酵液；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，發(fā)酵培養(yǎng)基中含有玉米粉
3.0-4.0%，豆餅粉2.5-3.0%，玉米漿2.0-2.5%，氯化鈉0.5-1.0%，余量為水；
步驟六、將上述步驟五所得發(fā)酵液中添加玉米淀粉，添加量為發(fā)酵液質(zhì)量的8-15%，攪拌均勻后將所得混合物直接進行噴霧干燥，料流量恒定100-180L/h，壓力2MPa，噴霧干燥塔熱風(fēng)進口溫度180°C，出口溫度80°C噴霧干燥時間為25s，即得到水分的質(zhì)量百分比為5%，菌粉顆粒直徑約為0.06mm的蠟狀芽孢桿菌益生菌粉；或者采用三效降膜式蒸發(fā)器將所得混合物進行蒸發(fā)濃縮，一效蒸發(fā)器的蒸發(fā)溫度為85°C，二效蒸發(fā)器的蒸發(fā)溫度為75°C，三效蒸發(fā)器的蒸發(fā)溫度為65°C，當料液濃縮比達到1:3時停止?jié)饪s；將經(jīng)過濃縮后的料液用往復(fù)泵送入噴霧干燥塔進行噴霧干燥，料流量恒定100-180L/h，壓力2MPa，噴霧干燥塔熱風(fēng)進口溫度180°C，出口溫度80°C噴霧干燥時間為25s，最終獲得水分的質(zhì)量百分比為5%，菌粉顆粒直徑約為0.06mm菌粉。
[0015] 實施例1
一種蠟狀芽孢桿菌益生菌粉，其具體制備步驟為:
步驟一、斜面固體培養(yǎng):將蠟狀芽孢桿菌mciUus.cereus) BC158接種在固體斜面培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h，得到斜面固體培養(yǎng)的菌種，備用；
所述的固體斜面培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，固體斜面培養(yǎng)基中含有牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂粉1.5%，余量為水；
步驟二、一級種子培養(yǎng):取步驟一所制備的斜面固體培養(yǎng)的菌種I接種環(huán)接種于裝有80 一級種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，然后34°C，220rpm搖床培養(yǎng)10h，得到一級種子液，備用；
所述的一級種子培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，一級種子培養(yǎng)基中含有酵母膏0.3%，蛋白胨0.5%，蔗糖0.5%，磷酸氫二鈉0.3%，硫酸鎂0.01%，硫酸錳0.06%，余量為水；
步驟三、二級種子培養(yǎng):將上述步 驟二培養(yǎng)好的一級種子液接種于裝有1.5L 二級種子培養(yǎng)基的5L三角瓶中，接種量為二級種子培養(yǎng)基體積的4%，然后34°C，220rpm搖床培養(yǎng)12h，得到二級種子液，備用；
所述的二級種子培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，二級種子培養(yǎng)基中含有蔗糖2.0%,玉米漿1.5%，硫酸鎂0.01%，磷酸氫二鉀0.5%，磷酸二氫鉀0.075 %，余量為水；步驟四、三級種子培養(yǎng):將上述步驟三培養(yǎng)好的二級種子液接種于裝有60L三級種子培養(yǎng)基的100L發(fā)酵罐中，接種量為三級種子培養(yǎng)基體積的3% ;然后34°C，150rpm通風(fēng)攪拌培養(yǎng)24h，得到三級種子培養(yǎng)液，備用；
所述的三級種子培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，三級種子培養(yǎng)基中含有玉米粉2.5%，豆餅粉2.5%，玉米漿2.0%，余量為水；
步驟五、發(fā)酵罐培養(yǎng):將上述步驟四所制備的三級種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的2%，然后于34°C，150rpm的通風(fēng)攪拌培養(yǎng)24h，鏡檢芽孢率在95%以上，停止培養(yǎng)，放罐，得到發(fā)酵液；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，發(fā)酵培養(yǎng)基中含有玉米粉3.0%，豆餅粉2.5%，玉米漿2.0%，氯化鈉0.5%，余量為水；
步驟六、將上述步驟五所得發(fā)酵液中添加玉米淀粉，添加量為發(fā)酵液質(zhì)量的8 %，攪拌均勻后將所得混合物直接進行噴霧干燥，料流量恒定100L/h，壓力2MPa，噴霧干燥塔熱風(fēng)進口溫度180°C，出口溫度80°C噴霧干燥時間為25s，即得到水分的質(zhì)量百分比為5%，菌粉顆粒直徑約為0.06mm的蠟狀芽孢桿菌益生菌粉；或者采用三效降膜式蒸發(fā)器將所得混合物進行蒸發(fā)濃縮，一效蒸發(fā)器的蒸發(fā)溫度為85°C，二效蒸發(fā)器的蒸發(fā)溫度為75°C，三效蒸發(fā)器的蒸發(fā)溫度為65°C，當料液濃縮比達到1:3時停止?jié)饪s；將經(jīng)過濃縮后的料液用往復(fù)泵送入噴霧干燥塔進行噴霧干燥，料流量恒定100L/h，壓力2MPa，噴霧干燥塔熱風(fēng)進口溫度180°C，出口溫度80°C噴霧干燥時間為25s，最終獲得水分的質(zhì)量百分比為5%，菌粉顆粒直徑約為0.06mm菌粉。
[0016] 實施例2
一種蠟狀芽孢桿菌益生菌粉，其具體制備步驟為:
步驟一、斜面固體培養(yǎng):將蠟狀芽孢桿菌mciUus.cereus) BC158接種在固體斜面培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h，得到斜面固體培養(yǎng)的菌種，備用；
所述的固體斜面培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，固體斜面培養(yǎng)基中含有牛肉膏0.4%，蛋白胨1.2%，氯化鈉0.5%，瓊脂粉2%，余量為水；
步驟二、一級種子培養(yǎng):取步驟一所制備的斜面固體培養(yǎng)的菌種3接種環(huán)接種于裝有120mL —級種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，然后37°C，250rpm搖床培養(yǎng)16h，得到一級種子液，備用；
所述的一級種子培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，一級種子培養(yǎng)基中含有酵母膏
0.5 %，蛋白胨0.7 %，蔗糖1.0 %，磷酸氫二鈉0.6%，硫酸鎂0.04 %，硫酸錳0.09 %，余量為水；
步驟三、二級種子培養(yǎng):將上述步驟二培養(yǎng)好的一級種子液接種于裝有1.5L 二級種子培養(yǎng)基的5L三角瓶中，接種量為二級種子培養(yǎng)基體積的7%，然后37°C，250rpm搖床培養(yǎng)18h，得到二級種子液，備用；
所述的二級種子培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，二級種子培養(yǎng)基中含有蔗糖2.5%，玉米漿2.0%，硫酸鎂0.03%，磷酸氫二鉀1.2%，磷酸二氫鉀0.100%，余量為水；步驟四、三級種子培養(yǎng):將上述步驟三培養(yǎng)好的二級種子液接種于裝有60L三級種子培養(yǎng)基的100L發(fā)酵罐中，接種量為三級種子培養(yǎng)基體積的5%;然后37°C，200rpm通風(fēng)攪拌培養(yǎng)32h，得到三級種子培養(yǎng)液，備用；
所述的三級種子培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，三級種子培養(yǎng)基中含有玉米粉3.5%，豆餅粉3.0%，玉米漿2.5%，余量為水；
步驟五、發(fā)酵罐培養(yǎng):將上述步驟四所制備的三級種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的4%，然后于37°C，200rpm的通風(fēng)攪拌培養(yǎng)32h，鏡檢芽孢率在95%以上，停止培養(yǎng)，放罐，得到發(fā)酵液；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，發(fā)酵培養(yǎng)基中含有玉米粉4.0%，豆餅粉3.0%，玉米漿2.5%，氯化鈉1.0%，余量為水；
步驟六、將上述步驟五所得發(fā)酵液中添加玉米淀粉，添加量為發(fā)酵液質(zhì)量的15 %，攪拌均勻后將所得混合物直接進行噴霧干燥，料流量恒定180L/h，壓力2MPa，噴霧干燥塔熱風(fēng)進口溫度180°C，出口溫度80°C噴霧干燥時間為25s，即得到水分的質(zhì)量百分比為5%，菌粉顆粒直徑約為0.06mm的蠟狀芽孢桿菌益生菌粉；或者采用三效降膜式蒸發(fā)器將所得混合物進行蒸發(fā)濃縮，一效蒸發(fā)器的蒸發(fā)溫度為85°C，二效蒸發(fā)器的蒸發(fā)溫度為75°C，三效蒸發(fā)器的蒸發(fā)溫度為65°C，當料液濃縮比達到1:3時停止?jié)饪s；將經(jīng)過濃縮后的料液用往復(fù)泵送入噴霧干燥塔進行噴霧干燥，料流量恒定180L/h，壓力2MPa，噴霧干燥塔熱風(fēng)進口溫度180°C，出口溫度80°C噴霧干燥時間為25s，最終獲得水分的質(zhì)量百分比為5%，菌粉顆粒直徑約為0.06mm菌粉。[0017]實施例3
一種蠟狀芽孢桿菌益生菌粉，其具體制備步驟為:
步驟一、斜面固體培養(yǎng):將蠟狀芽孢桿菌mciUus.cereus) BC158接種在固體斜面培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h，得到斜面固體培養(yǎng)的菌種，備用；
所述的固體斜面培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，固體斜面培養(yǎng)基中含有牛肉膏
0.35%，蛋白胨1.1%，氯化鈉0.5%，瓊脂粉1.8%，余量為水；
步驟二、一級種子培養(yǎng):取步驟一所制備的斜面固體培養(yǎng)的菌種2接種環(huán)接種于裝有IOOmL 一級種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，然后36°C，240rpm搖床培養(yǎng)14h，得到一級種子液，備用；
所述的一級種子培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，一級種子培養(yǎng)基中含有酵母膏
0.4 %，蛋白胨0.6 %，蔗糖0.8 %，磷酸氫二鈉0.5%，硫酸鎂0.03%，硫酸錳0.08 %，余量為水；
步驟三、二級種子培養(yǎng):將上述步驟二培養(yǎng)好的一級種子液接種于裝有1.5L 二級種子培養(yǎng)基的5L三角瓶中，接種量為二級種子培養(yǎng)基體積的6%，然后36°C，230rpm搖床培養(yǎng)17h，得到二級種子液，備用；
所述的二級種子培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，二級種子培養(yǎng)基中含有蔗糖2.2%,玉米漿1.7%，硫酸鎂0.02%，磷酸氫二鉀0.8%，磷酸二氫鉀0.08 %，余量為水；步驟四、三級種子培養(yǎng):將上述步驟三培養(yǎng)好的二級種子液接種于裝有60L三級種子培養(yǎng)基的100L發(fā)酵罐中，接種量為三級種子培養(yǎng)基體積的4% ;然后35°C，180rpm通風(fēng)攪拌培養(yǎng)28h，得到三級種子培養(yǎng)液，備用；
所述的三級種子培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，三級種子培養(yǎng)基中含有玉米粉2.9%，豆餅粉2.8%，玉米漿2.3%，余量為水；
步驟五、發(fā)酵罐培養(yǎng):將上述步驟四所制備的三級種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的3%，然后于36°C，180rpm的通風(fēng)攪拌培養(yǎng)28h，鏡檢芽孢率在95 %以上，停止培養(yǎng)，放罐，得到發(fā)酵液；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，發(fā)酵培養(yǎng)基中含有玉米粉3.5%，豆餅粉2.8%，玉米漿2.8%，氯化鈉0.9%，余量為水；
步驟六、將上述步驟五所得發(fā)酵液中添加玉米淀粉，添加量為發(fā)酵液質(zhì)量的10%，攪拌均勻后將所得混合物直接進行噴霧干燥，料流量恒定160L/h，壓力2MPa，噴霧干燥塔熱風(fēng)進口溫度180°C，出口溫度80°C噴霧干燥時間為25s，即得到水分的質(zhì)量百分比為5%，菌粉顆粒直徑約為0.06mm的蠟狀芽孢桿菌益生菌粉；或者采用三效降膜式蒸發(fā)器將所得混合物進行蒸發(fā)濃縮，一效蒸發(fā)器的蒸發(fā)溫度為85°C，二效蒸發(fā)器的蒸發(fā)溫度為75°C，三效蒸發(fā)器的蒸發(fā)溫度為65°C，當料液濃縮比達到1:3時停止?jié)饪s；將經(jīng)過濃縮后的料液用往復(fù)泵送入噴霧干燥塔進行噴霧干燥，料流量恒定170L/h，壓力2MPa，噴霧干燥塔熱風(fēng)進口溫度180°C，出口溫度80°C噴霧干燥時間為25s，最終獲得水分的質(zhì)量百分比為5%，菌粉顆粒直徑約為0.06mm菌粉。
[0018]相關(guān)實驗:
一、菌株的分離、篩選與鑒定 1、菌株的分離、篩選在河南省洛陽市裴村一養(yǎng)豬場選擇2周齡健康仔豬，稱取其糞便1.5g，置于裝有30ml無菌蒸餾水的三角瓶中，然后80°C水浴加熱20min后，從中吸取2ml放入裝有30ml牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中，接著37°C、180rpm，培養(yǎng)24h后得到種子液。然后吸取Iml種子液于裝有9ml蒸餾水的試管中，混勻，再從中吸取Iml于另支裝有9ml蒸餾水的試管中，依次稀釋，得到稀釋度為10' 10_2、10' 10_4、IO-5的菌液，然后從稀釋度為10_5W菌液中吸取0.1ml涂裝有牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的平板，37°C，培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，把單菌落劃線純化，然后斜面保藏，將其命名為BC158。
[0019]2、菌株的鑒定
(I)、菌株的生理生化鑒定
對所得純化的菌種進行生理生化鑒定，同時與蠟狀芽孢桿菌的進行對比；觀察純化的菌落外觀形態(tài)，進行革蘭氏染色和芽孢染色，確認細菌染色形態(tài)。并進行與硝酸還原實驗、過氧化氫酶、吲哚試驗、明膠液化實驗、甲基紅實驗、V.P實驗、葡萄糖產(chǎn)酸實驗、葡萄糖產(chǎn)氣實驗、硫化氫實驗、卵磷脂酶實驗、5%氯化鈉是否生長實驗；結(jié)果如表1所示,對比表1中,+表示陽性；-表示陰性；結(jié)果表明，其為革蘭氏陽性菌，會產(chǎn)生芽孢、菌落直徑為5-7mm，菌落大，表面粗糙，扁平，不規(guī)則，稍有光澤的白色；各理化指標和蠟狀芽孢桿菌相同；
表1:鑒定菌株與蠟狀芽孢桿菌 的生化性狀
【權(quán)利要求】
1.一種蠟狀芽孢桿菌，其特征在于:分類命名為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus?⑶reus)BC158，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.7433。
2.利用權(quán)利要求1所述的蠟狀芽孢桿菌BC158生產(chǎn)蠟狀芽孢桿菌益生菌粉的方法，其特征在于:其具體制備步驟為: 步驟一、斜面固體培養(yǎng):將所述的蠟狀芽孢桿菌BC158接種在固體斜面培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h，得到斜面固體培養(yǎng)的菌種，備用； 所述的固體斜面培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，固體斜面培養(yǎng)基中含有牛肉膏0.3%-0.4%，蛋白胨1%-1.2%，氯化鈉0.5%，瓊脂粉1.5%-2%，余量為水； 步驟二、一級種子培養(yǎng):取步驟一所制備的斜面固體培養(yǎng)的菌種1-3接種環(huán)接種于裝有80-120mL —級種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，然后34_37°C，220_250rpm搖床培養(yǎng)10-16h，得到一級種子液，備用； 所述的一級種子培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，一級種子培養(yǎng)基中含有酵母膏0.3-0.5 %，蛋白胨0.5-0.7 %，蔗糖0.5-1.0 %，磷酸氫二鈉0.3-0.6 %，硫酸鎂0.01-0.04%，硫酸錳 0.06-0.09%，余量為水； 步驟三、二級種子培養(yǎng):將上述步驟二培養(yǎng)好的一級種子液接種于裝有1.5L 二級種子培養(yǎng)基的5L三角瓶中，接種量為二級種子培養(yǎng)基體積的4-7%，然后34-37°C，220-250rpm搖床培養(yǎng)12-18h，得到二級種子液，備用； 所述的二級種子培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，二級種子培養(yǎng)基中含有蔗糖2.0-2.5 %，玉米漿1.5-2.0 %，硫酸鎂0.01-0.03 %，磷酸氫二鉀0.5-1.2 %，磷酸二氫鉀0.075-0.100%，余量為`水； 步驟四、三級種子培養(yǎng):將上述步驟三培養(yǎng)好的二級種子液接種于裝有60L三級種子培養(yǎng)基的100L發(fā)酵罐中，接種量為三級種子培養(yǎng)基體積的3-5% ;然后34-37°C，150-200rpm通風(fēng)攪拌培養(yǎng)24_32h，得到三級種子培養(yǎng)液，備用； 所述的三級種子培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，三級種子培養(yǎng)基中含有玉米粉2.5-3.5 %，豆餅粉2.5-3.0 %，玉米漿2.0-2.5 %，余量為水； 步驟五、發(fā)酵罐培養(yǎng):將上述步驟四所制備的三級種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的2-4%，然后于34-37°C，150-200rpm的通風(fēng)攪拌培養(yǎng)24_32h，鏡檢芽孢率在95%以上，停止培養(yǎng)，放罐，得到發(fā)酵液； 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分為:按質(zhì)量百分比，發(fā)酵培養(yǎng)基中含有玉米粉3.0-4.0 %，豆餅粉2.5-3.0 %，玉米漿2.0-2.5 %，氯化鈉0.5-1.0 %，余量為水； 步驟六、將上述步驟四所得發(fā)酵液中添加玉米淀粉，添加量為發(fā)酵液質(zhì)量的8-15%，攪拌均勻后將所得混合物進行噴霧干燥，即得到蠟狀芽孢桿菌益生菌粉。
3.如權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)蠟狀芽孢桿菌益生菌粉的方法，其特征在于:步驟六將所得混合物濃縮后進行噴霧干燥，濃縮的具體操作方法為，采用三效降膜式蒸發(fā)器將所得混合物進行蒸發(fā)濃縮，一效蒸發(fā)器的蒸發(fā)溫度為85°C，二效蒸發(fā)器的蒸發(fā)溫度為75°C，三效蒸發(fā)器的蒸發(fā)溫度為65°C，當料液濃縮比達到1:3時停止?jié)饪s。
4.如權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)蠟狀芽孢桿菌益生菌粉的方法制成的蠟狀芽孢桿菌益生菌粉，其特征在于:蠟狀芽孢桿菌益生菌粉的組成成分包括玉米淀粉和蠟狀芽孢桿菌。
5.如權(quán)利要求4所述的蠟狀芽孢桿菌益生菌粉，其特征在于:蠟狀芽孢桿菌的活菌含量為3X 109-5X 101QCFU/g，水分的質(zhì)量百分比為5%，菌粉顆粒直徑為0.06mm。
6.如權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)蠟狀芽孢桿菌益生菌粉的方法制成的蠟狀芽孢桿菌益生菌粉在動物養(yǎng)殖的飼料添加劑中`的應(yīng)用。
【文檔編號】A23K1/16GK103525718SQ201310301368
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月18日
【發(fā)明者】古紹彬, 吳影, 龔慧, 李市場, 何佳, 王大紅, 張彬 申請人:河南科技大學(xué)