一種生物組織培養(yǎng)法繁育蘇瑪櫟優(yōu)株的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物快繁方法【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種生物組織培養(yǎng)法繁育蘇瑪櫟優(yōu)株的方法，包括以下步驟：a.環(huán)剝蘇瑪櫟獲得基部萌條；b.在基部萌條中選取帶腋芽的萌條作為外植體，經(jīng)表面消毒；c.初代培養(yǎng)；d.增殖培養(yǎng)；e.壯苗培養(yǎng)；f.生根培養(yǎng)獲得生根試管苗；g.生根試管苗進(jìn)行移栽。本發(fā)明提供了一種環(huán)剝蘇瑪櫟獲得基部萌條，取帶腋芽的萌條作為外植體，通過初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)獲得生根試管苗、生根試管苗進(jìn)行移栽，具有不受季節(jié)限制以及環(huán)境易控，減少變異植株的產(chǎn)生，種苗品質(zhì)高，一致性好的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)提高了蘇瑪櫟的年繁殖系數(shù)，降低了引種成本。
【專利說明】一種生物組織培養(yǎng)法繁育蘇瑪棟優(yōu)株的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物快繁方法【技術(shù)領(lǐng)域】，具體為生物組織培養(yǎng)繁育，尤其涉及了一種生物組織培養(yǎng)法繁育蘇瑪櫟優(yōu)株的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]蘇瑪櫟(Quercus shumardii)初期生長(zhǎng)速度快,年高生長(zhǎng)量可達(dá)Im,是美國(guó)重要的用材樹種之一，自2001年引種上海種植以來，亦表現(xiàn)出良好的抗逆性和園林觀賞價(jià)值。葉形奇特，具深裂，夏季葉片呈亮綠色，秋葉紅艷可愛，不僅是良好的城市園林及工業(yè)區(qū)綠化樹種，也是優(yōu)美的觀葉樹種。耐水濕，比其他櫟類易移栽，因此可做為低濕地重要造林樹種和用材樹種，具有廣泛的應(yīng)用前景。目前櫟類樹種采用播種繁殖，由于長(zhǎng)期的有性繁殖，造成種群內(nèi)個(gè)體所具有的遺傳基因復(fù)雜，實(shí)生苗間存在著十分顯著的變異，豐富的個(gè)體變異，為遺傳改良創(chuàng)造了有利條件。櫟樹體內(nèi)含單寧等阻礙生根物質(zhì)，屬很難生根樹種，有關(guān)櫟樹扦插組培成功的報(bào)道很少，解決櫟類樹種的無性繁殖難題是加快櫟樹優(yōu)良材料推廣利用的前提條件，但多家研究機(jī)構(gòu)在蘇瑪櫟扦插、嫁接試驗(yàn)中，結(jié)果相似，成活率極低。有關(guān)櫟樹組培成功報(bào)道也很少，國(guó)內(nèi)僅見在大葉櫟、栓皮櫟上有所報(bào)道，但增殖率、生根率以及移栽成活率普遍比較低。
[0003]本技術(shù)在單株選優(yōu)的基礎(chǔ)上，采用直接器官發(fā)生形式，通過對(duì)培養(yǎng)基成分、激素配比以及培養(yǎng)環(huán)境因子的確定，建立了蘇瑪櫟完整的再生體系，以芽繁芽進(jìn)行組培快繁生產(chǎn)出來的試管苗無變異發(fā)生，可以保持母本的優(yōu)良性狀，使得這一昂貴的外來物種得以保存和繁育，為后期的推廣應(yīng)用奠定了技術(shù)基礎(chǔ)和優(yōu)質(zhì)種苗。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中蘇瑪櫟樹體內(nèi)含單寧等阻礙生根物質(zhì)，很難生根，而采用扦插、嫁接，成活率極低等缺點(diǎn)，提供了一種環(huán)剝蘇瑪櫟獲得基部萌條，取帶腋芽的萌條作為外植體，通過初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)獲得生根試管苗、生根試管苗進(jìn)行移栽，具有不受季節(jié)限制以及環(huán)境易控的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)提高了蘇瑪櫟的繁殖速度，降低了引種費(fèi)用。
[0005]本發(fā)明中所用到的培養(yǎng)基及激素包括:WPM培養(yǎng)基(Murashing and Skoogmedium,以下簡(jiǎn)稱WPM)，WPM配方中的藥品成分和培養(yǎng)基的具體配制方法為現(xiàn)有公知技術(shù)，在此不再贅述。1/2WPM是指WPM培養(yǎng)基中大量元素減半，而其余藥品成分不變。附加的植物激素為6-節(jié)基氨基嘌呤(6-benzylaminopurine,簡(jiǎn)稱為6-BA)、奈乙酸(naphthyleneacetic acid,簡(jiǎn)稱為NAA)、卩引噪丁酸(3_Indolebutyric acid,簡(jiǎn)稱為IBA),基本培養(yǎng)基中所用藥劑和各類激素可由sigma公司購得。
[0006]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過下述技術(shù)方案得以解決:
一種生物組織培養(yǎng)法繁育蘇瑪櫟優(yōu)株的方法，包括以下步驟:a、環(huán)剝蘇瑪櫟獲得基部萌條；b、在基部萌條中選取帶腋芽的萌條作為外植體，經(jīng)表面消毒；c、初代培養(yǎng)、d、增殖培養(yǎng)；e、壯苗培養(yǎng)；f、生根培養(yǎng)獲得生根試管苗；g、生根試管苗進(jìn)行移栽。
[0007]作為優(yōu)選，所述的具體步驟如下:
a、在氣溫回升的春季，于優(yōu)樹樹干基部進(jìn)行環(huán)割，深至韌皮部，待萌芽條萌動(dòng)并生長(zhǎng)至5^20 cm時(shí)，選擇晴朗天氣的午后采集獲得基部萌條；
b、在基部萌條中選擇生長(zhǎng)健壯，無病蟲害的蘇瑪櫟帶腋芽的萌條做為起始外植體，用洗潔精擦洗表面后，流水沖洗20分鐘，再進(jìn)行消毒處理；
C、將消毒處理后的外植體接種到初代培養(yǎng)基上，進(jìn)行初代培養(yǎng)；
d、將初代培養(yǎng)的無菌苗轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)不定芽；
e、將誘導(dǎo)出的叢生芽分切后，轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基，進(jìn)行壯苗培養(yǎng)；
f、將經(jīng)壯苗培養(yǎng)生長(zhǎng)到1.5cm以上的試管苗分切后，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中；
g、對(duì)所得的生根試管苗進(jìn)行清洗，移至珍珠巖、草炭土的混合基質(zhì)中進(jìn)行栽種。
[0008]原先應(yīng)該有芽的位置長(zhǎng)出來的是定芽，如頂芽、腋芽等位置長(zhǎng)出的；原先不可能長(zhǎng)芽的位置長(zhǎng)出來的是不定芽，如葉片、莖段的切口處。叢生芽是由植物器官和愈傷組織發(fā)育出來的群體叢生芽苗，大多是多細(xì)胞形成，雙極性，結(jié)構(gòu)完整，可直接形成小植株，成苗率高，去分化容易，再分化中等。本專利中的不定芽主要是莖段切口處長(zhǎng)出的芽，叢生芽是屬于不定芽中結(jié)構(gòu)完整，可直接形成小植株的芽體。步驟f中的試管苗即在壯苗培養(yǎng)基上培養(yǎng)的無菌苗，壯苗培養(yǎng)獲得試管苗，生根試管苗指生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)的無菌苗，生根培養(yǎng)獲得生根試管苗。
[0009]作為優(yōu)選，所述的步驟a中，在氣溫回升的春季，于優(yōu)樹樹干離地面約1(T30 cm處進(jìn)行環(huán)割，環(huán)割樹干周長(zhǎng)的1/3?4/5，環(huán)割口寬0.1cm?lcm，深至韌皮部，待萌芽條萌動(dòng)并生長(zhǎng)至5?20 cm時(shí)，選擇晴朗天氣的午后采集獲得基部萌條，保濕保鮮。
[0010]作為優(yōu)選，所述的步驟b中，取蘇瑪櫟包含腋芽的萌條，切取成為長(zhǎng)度0.5^2.5cm,腋芽位于中間的莖段，切去葉片，保留兩片葉柄基部保護(hù)腋芽生長(zhǎng)點(diǎn)，進(jìn)行消毒處理；先用72%濃度的酒精消毒3(T60s，再用無菌水沖洗3?4次，然后用加有0.Γθ.2%的升汞液浸泡15?30分鐘，用無菌水沖洗至無殘留，得到無菌的外植體。
[0011]作為優(yōu)選，所述的步驟c中，初代培養(yǎng)基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-ΒΑ)
0.15?0.25mg*L k奈乙酸(NAA)0.15?0.25mg*L:+ 生物素 I?lOmg.L:+ 乙酸膽喊 I?lOmg.L:+核黃素I?lOmg.L—1+蔗糖25?358.171+瓊脂4?Ug.L—1。
[0012]作為優(yōu)選，所述的步驟d中，增殖培養(yǎng)基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA)
0.1?2.5mg*L k 奈乙酸(NAA) 0.1?0.5 mg*L:+ 生物素 I?10mg*L 1 + 乙酸膽喊 I?10mg*L:+核黃素flOmg.!/1+蔗糖2(T40 g.!/1+瓊脂4?12 g.!/1，最佳增殖培養(yǎng)基為WPM +6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 1.0 mg.!/1 + 奈乙酸(NAA) 0.1 mg.!/1 + 生物素Smg.!/1 + 乙酰膽堿Smg.!/1+核黃素蔗糖30 g.L-1+瓊脂6 g.L—1，叢芽增殖率為1:2?3。
[0013]作為優(yōu)選，所述的步驟d中，最佳增殖培養(yǎng)基為WPM +6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 1.0mg.!/1 + 奈乙酸(NAA) 0.1 mg.!/1 + 生物素 Smg.!/1 + 乙酰膽堿 Smg.!/1 + 核黃素 Smg.!/1+蔗糖30 g.L-1+瓊脂6 g.L—1，叢芽增殖率為1:2?3。
[0014]作為優(yōu)選，所述的步驟e中，所述的壯苗培養(yǎng)基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA)
0.15?0.25mg*L k奈乙酸(NAA)0.15?0.25mg*L W 生物素 I?lOmg.L W 乙酸膽喊 I?10mg*L:+核黃素f lOmg.!/1+蔗糖25158*!/1+瓊脂rUg.!/1，培養(yǎng)20天苗高可以達(dá)到3?4厘米，2?4對(duì)葉片。
[0015]作為優(yōu)選，所述的步驟f中，生根培養(yǎng)基為:1/2WPM+奈乙酸(NAA)0.5^2.Smg*^1+吲哚丁酸(IBA) 0.5?2.5 mg.L—1 +生物素I?lOmg.L—1 +乙酰膽堿I?lOmg.!/1+核黃素r1mg-Γ1+蔗糖15?358.!^+瓊脂4?所述的最佳生根培養(yǎng)基為1/2WPM+奈乙酸(NM)lmg.I71+卩引哚丁酸(IBA)lmg.I71+生物素 Smg.!/1 + 乙酰膽堿 Smg.!/1 + 核黃素 Smg.!/1+蔗糖20 g.L-1+瓊脂6 g.L—1，生根率為65?85%。
[0016]作為優(yōu)選，所述的初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件均為無菌環(huán)境，光周期為l(Tl5h/d，光照強(qiáng)度150(Γ25001χ，培養(yǎng)溫度為室溫；初代培養(yǎng)的周期為22?28天，增殖培養(yǎng)的周期為28?32天，壯苗培養(yǎng)的周期為18?22天，生根培養(yǎng)的周期為28?32天。
[0017]作為優(yōu)選，所述的步驟g中，將生根試管苗置于自然環(huán)境中6?10天，取出洗凈根部，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡數(shù)秒，移栽到草炭土:珍珠巖=2:1的混合基質(zhì)中，起始6?10天內(nèi)保持苗的葉面濕潤(rùn)并適當(dāng)遮陽，其后按干透濕透的原則澆水，逐漸加強(qiáng)光照至全光照，進(jìn)行栽種。
[0018]本發(fā)明由于采用了以上技術(shù)方案，具有顯著的技術(shù)效果:本發(fā)明極大加快了蘇瑪櫟的繁殖速度，一旦得到無菌苗后，可以利用無菌苗誘導(dǎo)增殖出大量不定芽，不定芽生根和移栽成活后，即再生為完整植株，形成了一個(gè)良好的生產(chǎn)體系，年繁殖系數(shù)為1:60000，成本由原來的引種每株1000元，降低至每株5?8元。且不受季節(jié)限制，環(huán)境易控，適合全國(guó)各地，解決了蘇瑪櫟引種費(fèi)用高的問題。直接器官發(fā)生的方式由于不經(jīng)過愈傷組織階段，可以減少變異植株的產(chǎn)生，為快繁中保持種質(zhì)資源的優(yōu)良特性提供保障，生產(chǎn)得到的蘇瑪櫟種苗品質(zhì)高，一致性好。

【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述:
實(shí)施例1
一種生物組織培養(yǎng)法繁育蘇瑪櫟優(yōu)株的方法，包括以下步驟:a、環(huán)剝蘇瑪櫟獲得基部萌條；b、在基部萌條中選取帶腋芽的萌條作為外植體，經(jīng)表面消毒；c、初代培養(yǎng)、d、增殖培養(yǎng)；e、壯苗培養(yǎng)；f、生根培養(yǎng)獲得生根試管苗；g、生根試管苗進(jìn)行移栽。
[0020]具體步驟如下:
a、在氣溫回升的春季，于優(yōu)樹樹干基部進(jìn)行環(huán)割，深至韌皮部，待萌芽條萌動(dòng)并生長(zhǎng)至5^20 cm時(shí)，選擇晴朗天氣的午后采集獲得基部萌條；
b、在基部萌條中選擇生長(zhǎng)健壯，無病蟲害的蘇瑪櫟帶腋芽的萌條做為起始外植體，用洗潔精擦洗表面后，流水沖洗20分鐘，再進(jìn)行消毒處理；
C、將消毒處理后的外植體接種到初代培養(yǎng)基上，進(jìn)行初代培養(yǎng)；
d、將初代培養(yǎng)的無菌苗轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)不定芽；
e、將誘導(dǎo)出的叢生芽分切后，轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基，進(jìn)行壯苗培養(yǎng)；
f、將經(jīng)壯苗培養(yǎng)生長(zhǎng)到1.5cm以上的試管苗分切后，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中；
g、對(duì)所得的生根試管苗進(jìn)行清洗，移至珍珠巖、草炭土的混合基質(zhì)中進(jìn)行栽種。
[0021]步驟a中，在氣溫回升的春季，于優(yōu)樹樹干離地面約1(T30 cm處進(jìn)行環(huán)割，環(huán)割樹干周長(zhǎng)的1/3?4/5，環(huán)割口寬0.1cm?lcm，深至韌皮部，待萌芽條萌動(dòng)并生長(zhǎng)至5?20 cm時(shí)，選擇晴朗天氣的午后采集獲得基部萌條，保濕保鮮。
[0022]在上述方案的基礎(chǔ)上，步驟a中，環(huán)割方法具體為在氣溫回升的春季，于優(yōu)樹樹干離地面約1(T30 cm處進(jìn)行環(huán)割，環(huán)割樹干周長(zhǎng)的1/3?4/5，環(huán)割口寬0.1cnTlcm，深至韌皮部，待萌芽條萌動(dòng)并生長(zhǎng)至5?20 cm時(shí)，選擇晴朗天氣的午后采集，保濕保鮮。具體的，離地面約1(T30 cm處進(jìn)行環(huán)割，可以為10、15、20、25、30cm等范圍內(nèi)的任一長(zhǎng)度；環(huán)割樹干周長(zhǎng)的1/3?4/5，可以為1/3、2/5、2/3、3/5、4/5等范圍內(nèi)的任一長(zhǎng)度；環(huán)割口寬0.1cm?lcm，可以為0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.7,0.8,0.9、Icm等范圍內(nèi)的任一長(zhǎng)度；萌芽條生長(zhǎng)至5?20cm，可以為5、8、10、12、15、18、20 cm等范圍內(nèi)的任一長(zhǎng)度。
[0023]步驟b中，取蘇瑪櫟包含腋芽的萌條，切取成為長(zhǎng)度0.5?2.5cm，腋芽位于中間的莖段，切去葉片，保留兩片葉柄基部保護(hù)腋芽生長(zhǎng)點(diǎn)，進(jìn)行消毒處理；先用72%濃度的酒精消毒3(T60s，再用無菌水沖洗3?4次，然后用加有0.Γ0.2%的升汞液浸泡15?30分鐘，用無菌水沖洗至無殘留，得到無菌的外植體。
[0024]在上述方案的基礎(chǔ)上，步驟b中，所述的外植體修切為長(zhǎng)度0.5^2.5cm，腋芽位于中間的莖段，可以為0.5,0.7,0.9、1、1.5,2.0,2.5cm等該范圍內(nèi)的任一長(zhǎng)度。在上述方案的基礎(chǔ)上，步驟b中，所述的清洗消毒處理的方法包括:取蘇瑪櫟包含腋芽的枝條，修切為長(zhǎng)度0.5^2.5cm，腋芽位于中間的莖段，切去葉片，保留兩片葉柄基部保護(hù)腋芽生長(zhǎng)點(diǎn)，進(jìn)行消毒處理。先用72%濃度的酒精消毒3(T60s，再用無菌水沖洗:Γ4次，然后用加有0.Γ0.2%的升汞液浸泡15?30分鐘，用無菌水沖洗至無殘留，得到無菌的外植體。具體的，72%濃度酒精消毒可以為30s、40s、50s、60s，升汞液濃度可以為0.1%、0.15%、0.2%，浸泡時(shí)間可以為15、18、20、25、28、30 分鐘。
[0025]步驟c中，初代培養(yǎng)基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 0.15^0.2511^171+奈乙酸(NAA) 0.15?0.25mg*L-1+ 生物素 I?lOmg.L-1+ 乙酰膽堿 I?lOmg.L-1+ 核黃素 I?lOmg.L-1+ 鹿糖 25?358.171+ 瓊脂 rUg.L-1。
[0026]在上述方案的基礎(chǔ)上，步驟c中，所述初代培養(yǎng)基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA)
0.15?0.25mg*L ^NAA0.15?0.25mg*L:+ 生物素 I?lOmg.L:+ 乙酸膽喊 I?lOmg.L:+ 核黃素r1mg-Γ1+蔗糖25158*!/1+瓊脂具體的，在初代培養(yǎng)基中，6-芐基氨基嘌呤(6-BA)的激素濃度可以為0.15,0.18,0.2,0.22,0.25 mg.L'NAA的激素濃度可以為0.15、
0.18、0.2、0.22、0.25 mg.!/1，生物素的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，乙酰膽堿的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，核黃素的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，蔗糖的濃度可以為25、28、30、32、35 g.!/1，瓊脂的濃度可以為4、5、6、7、8、10、12 g.L'優(yōu)選的初代培養(yǎng)基為:WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 0.2mg*r1+NAA0.2mg*r1+生物素Smg.!/1+乙酰膽堿5mg?L-1+核黃素Smg.!/1+鹿糖SOg.!/1+瓊脂Sg.!/1 ;在初代培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)條件為無菌室內(nèi)光周期為l(Tl5h/d，優(yōu)選12h/d，光照強(qiáng)度150(Γ25001χ，優(yōu)選20001χ，培養(yǎng)溫度為室溫，優(yōu)選25 °C，培養(yǎng)周期為22?28天，優(yōu)選25天。
[0027]步驟d中，最佳增殖培養(yǎng)基為WPM +6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 1.0 mg-Γ1 +奈乙酸(NAA) 0.1 mg.!/1 + 生物素 Smg.!/1 + 乙酰膽堿 Smg.!/1 + 核黃素 Smg.!/1+鹿糖 30 g.L-1+瓊脂6 g.!/1，叢芽增殖率為1:2?3。在上述方案的基礎(chǔ)上，步驟d中，所述增殖培養(yǎng)基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 0.Γ2.5mg*L_1+NAA 0.Γθ.5 mg.171+ 生物素 I?lOmg.L-1 + 乙酰膽堿I?lOmg.!/1+核黃素I?lOmg.!/1+鹿糖20?40 g.!/1+瓊脂4?12 g.L'具體的,6-BA的激素濃度可以為0.1,0.2,0.5,1.0,1.5,2.0,2.Smg^r17NAA的激素濃度可以為0.1,0.2、
0.4、0.5mg.!^，生物素的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，乙酰膽堿的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，核黃素的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，蔗糖的濃度可以為20、25、28、30、32、35、40 g.!/1，瓊脂的濃度可以為4、5、6、7、8、10、Ug.!/1。增殖培養(yǎng)基最佳的激素組合及濃度為:WPM +6-BA 1.0 mg*L 1 + NAA 0.1 mg*L 1 + 生物素 5mg*L 1 + 乙酸膽喊 5mg*L 1+核黃素Smg.!/1+鹿糖30 g.!/1+瓊脂6 g.!/1。在增殖培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)條件為無菌室內(nèi)光周期為l(Tl5h/d，優(yōu)選12h/d，光照強(qiáng)度150(Γ25001χ，優(yōu)選20001χ，培養(yǎng)溫度為室溫，優(yōu)選25 0C，培養(yǎng)周期為28?32天，優(yōu)選30天，由此蘇瑪櫟試管苗的月增殖系數(shù)為1:2?3。
[0028]步驟e中，所述的壯苗培養(yǎng)基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA)0.15^0.奈乙酸(NAA)0.15?0.25mg*L-1+ 生物素 I?lOmg.!/1+ 乙酰膽堿 I?lOmg.!/1+核黃素 I?lOmg.!/1+蔗糖25158*!/1+瓊脂rUg.!/1，培養(yǎng)20天苗高可以達(dá)到3?4厘米，2?4對(duì)葉片。
[0029]在上述方案的基礎(chǔ)上，步驟e中，所述的壯苗培養(yǎng)基為WPM+6-BA0.15^0.25mg*r1+NAA0.15?0.25mg*L-1+ 生物素 I?lOmg.!/1+ 乙酰膽堿 I?lOmg.!/1+ 核黃素 I?lOmg.!/1+鹿糖25?358*!/1+瓊脂rUg.!/1。具體的，在壯苗培養(yǎng)基中，6-BA的激素濃度可以為0.15,0.18、
0.2,0.22,0.25 rng.L-1，NAA 的激素濃度可以為 0.15,0.18,0.2,0.22,0.25 mg.L-1，生物素的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，乙酰膽堿的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，核黃素的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，蔗糖的濃度可以為25、28、30、32、35 g.L—1，瓊脂的濃度可以為 4、5、6、7、8、10、12 g.L' 優(yōu)選的壯苗培養(yǎng)基為:WPM+6-BA0.2mg*L_1+NAA0.2mg*L-1+生物素Smg.!/1+乙酰膽堿Smg.!/1+核黃素Smg.!/1+鹿糖30g.]^+瓊脂6g.]^ ;在壯苗培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)條件為無菌室內(nèi)光周期為l(Tl5h/d，優(yōu)選12h/d，光照強(qiáng)度150(Γ25001χ，優(yōu)選20001χ，培養(yǎng)溫度為室溫，優(yōu)選25°C，培養(yǎng)周期為18?22天，優(yōu)選20天，由此試管苗長(zhǎng)至3^4cm高，葉片2?3對(duì)，比較整齊。
[0030]步驟f中，所述的最佳生根培養(yǎng)基為1/2WPM+奈乙酸(NAA) lmg.!/1+吲哚丁酸(IBA) Img1L-1+ 生物素 5mg.L-1 + 乙酰膽堿 5mg.L-1 + 核黃素 5mg.L-1+ 鹿糖 20 g.L-1+ 瓊脂6 g.!/1，生根率為65?85%。
[0031]在上述方案的基礎(chǔ)上，步驟f中，所述生根培養(yǎng)基為1/2WPM+NAA0.5^2.Smg-L^+IBA0.5?2.5 mg.!/1 +生物素I?lOmg.L-1 +乙酰膽堿I?lOmg.L-1+核黃素I?lOmg.L-1+鹿糖15?358.171+ 瓊脂 rUg.L' 具體 NAA 的激素濃度可以為 0.5,1.0,1.5,2.0,2.5π^.?ΛI(xiàn)BA的激素濃度可以為0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mg.!/1，生物素的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，乙酰膽堿的濃度可以為1、2、4、6、8、10 mg.!/1，核黃素的濃度可以為1、2、4、
6、8、10 mg.!/1，蔗糖的濃度可以為15、18、20、22、25、30、35 g.!/1，瓊脂的濃度可以為4、
5、6、7、8、10、12 g*L'所述的生根培養(yǎng)基最佳的激素和礦質(zhì)元素及碳源組合濃度值為:I/2ffPM+NAAlmg*L-1+IBAlmg*L-1+ 生物素 Smg.!/1+ 乙酰膽堿 Smg.!/1 + 核黃素 Smg.!/1+ 鹿糖20 g.L—1+瓊脂6 g.L-1。培養(yǎng)條件為無菌室內(nèi)光周期為l(Tl5h/d，優(yōu)選12h/d，光照強(qiáng)度150(Γ25001χ，優(yōu)選20001X，培養(yǎng)溫度為室溫，優(yōu)選25 °C，生根培養(yǎng)的周期為28?32天，優(yōu)選30天。由此生根率為65?85%。
[0032]初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件均為無菌環(huán)境，光周期為l(Tl5h/d，光照強(qiáng)度150(Γ25001χ，培養(yǎng)溫度為室溫；初代培養(yǎng)的周期為22?28天，增殖培養(yǎng)的周期為28?32天，壯苗培養(yǎng)的周期為18?22天，生根培養(yǎng)的周期為28?32天。
[0033]步驟g中，將生根試管苗置于自然環(huán)境中6?10天，取出洗凈根部，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡數(shù)秒，移栽到草炭土:珍珠巖=2:1的混合基質(zhì)中，起始6?10天內(nèi)保持苗的葉面濕潤(rùn)并適當(dāng)遮陽，其后按干透濕透的原則澆水，逐漸加強(qiáng)光照至全光照，進(jìn)行栽種。
[0034]在上述方案的基礎(chǔ)上，步驟g中，將生根試管苗置于自然環(huán)境中6?10天，一般為一周，取出洗凈，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡數(shù)秒，移栽到草炭土、珍珠巖的混合基質(zhì)中，一般草炭土:珍珠巖=2:1，起始6?10天(一般為一周)內(nèi)采用噴霧保持苗的葉面濕潤(rùn)，相對(duì)濕度為95%左右，并適當(dāng)遮陽，其后(約二周后)按干透濕透的原則澆水，逐漸加強(qiáng)光照至全光照。
[0035]實(shí)施例2
一種蘇瑪櫟離體培養(yǎng)和快速繁殖的方法，環(huán)剝蘇瑪櫟獲得基部萌條做為外植體，經(jīng)表面消毒、初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)獲得試管苗，進(jìn)行移栽，包括下述步驟:a:蘇瑪櫟自然條件下萌發(fā)的枝條，無論是頂芽還是帶腋芽的莖段，污染情況都非常嚴(yán)重，絕大多數(shù)為霉菌污染。并且褐變情況也十分嚴(yán)重，除了整個(gè)外植體材料完全褐變之外，基部滲出的酚類物質(zhì)在培養(yǎng)基中也逐漸擴(kuò)散，得不到無菌苗，外植體沒有萌發(fā)現(xiàn)象。
[0036]環(huán)割基部，萌蘗而成的枝條做外植體時(shí)，可以誘導(dǎo)其萌發(fā)，污染程度以及褐變情況有所減輕，得到的無菌苗可繼代培養(yǎng)，做為進(jìn)一步擴(kuò)繁培養(yǎng)的母本。環(huán)割方法具體為在氣溫回升的春季，于優(yōu)樹樹干離地面約1(T30 cm處進(jìn)行環(huán)割，環(huán)割樹干周長(zhǎng)的1/31/5，環(huán)割口寬0.1cnTlcm，深至韌皮部。待萌芽條萌動(dòng)并生長(zhǎng)至5?20 cm時(shí)，選擇晴朗天氣的午后采集，保濕保鮮。
[0037]b:蘇瑪櫟長(zhǎng)期生長(zhǎng)于野外自然條件下，自身附帶的污染物較多，枝條表面有凹凸不平的紋理，表面消毒獲得無菌材料具有難度。本技術(shù)采用較溫和的洗潔精浸泡擦洗，去掉枝條表面的毛，初步降低污染后，再流水沖洗20分鐘。切取成為長(zhǎng)度0.5^2.5cm，腋芽位于中間的莖段，切去葉片，保留兩片葉柄基部保護(hù)腋芽生長(zhǎng)點(diǎn)，在超凈工作臺(tái)上，先用72%濃度的酒精消毒3(T60s，再用無菌水沖洗3?4次，然后用0.Γ0.2%的升汞液浸泡15?30分鐘，用無菌水沖洗至消毒液無殘留，得到無菌的外植體，平均無菌率50%。其中升汞溶液過濾后可反復(fù)加以使用，消毒效果不變，可減少對(duì)環(huán)境的破壞。
[0038]c:在步驟b中消毒所得到的無菌外植體接種到初代培養(yǎng)基WPM+6-BA0.15^0.25mg?L_1+NAA0.15?0.25mg*L-1+ 生物素 I?lOmg.!/1+ 乙酰膽堿 I?lOmg.!/1+核黃素 I?lOmg.!/1+鹿糖25158*!/1+瓊脂rUg*!/1上。培養(yǎng)基pH調(diào)為5.8左右，一個(gè)試管接種一個(gè)，避免交叉感染，于光周期為12h/d，光照強(qiáng)度為20001x，培養(yǎng)溫度為25°C的無菌室內(nèi)培養(yǎng)25天。
[0039]無菌操作室在使用前30分鐘，打開紫外燈和超凈工作臺(tái)，紫外燈在關(guān)閉10分鐘后，才可進(jìn)行接種操作；接種用具在121°C條件下高壓滅菌35分鐘，培養(yǎng)基在121°C條件下高壓滅菌18分鐘。
[0040]d:將初代培養(yǎng)獲得的健壯一致的無菌苗轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 0.1?2.5mg*L:+NAA 0.1?0.5 mg*L:+ 生物素 I?lOmg.L 1 + 乙酸膽喊 I?lOmg.L:+ 核黃素I?lOmg.!/1+蔗糖20?40 g-Γ1+瓊脂4?12 g.L—1，結(jié)果表明，隨著細(xì)胞分裂素濃度的提高，增殖系數(shù)略微升高，當(dāng)6-芐基氨基嘌呤(6-BA)濃度為1.0 mg.!/1，培養(yǎng)周期為30 d時(shí)，達(dá)到最高值2.05。有部分試管苗在培養(yǎng)過程中逐漸干枯死亡，一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)干枯率可達(dá)20%。當(dāng)6-芐基氨基嘌呤(6-BA)濃度為2.0 mg-Γ1時(shí)，腋芽也可以萌發(fā)，但葉柄基部易產(chǎn)生愈傷組織，致使葉片從產(chǎn)生愈傷組織的地方脫落，繼續(xù)培養(yǎng)，在試管苗的基部也形成愈傷組織團(tuán)塊，進(jìn)而影響試管苗從培養(yǎng)基中吸收營(yíng)養(yǎng)，致使生長(zhǎng)變緩慢，降低了增殖系數(shù)，頂端逐漸干枯死亡率增高。添加生物素、核黃素、乙酰膽堿等有機(jī)物后，對(duì)增殖率影響不大，但卻可改善試管苗的生理狀態(tài)，葉色翠綠，有光澤，頂端干枯試管苗的數(shù)量減少，
本發(fā)明中所述的增殖培養(yǎng)基最佳的激素組合及濃度為=WPM +6-芐基氨基嘌呤(6-BA)
1.0 mg.!/1 + NAA 0.1 mg.!/1 + 生物素 Smg.!/1 + 乙酰膽堿 Smg.!/1 + 核黃素 Smg.!/1+鹿糖30 g.!/1+瓊脂6 g-Γ1 ;在增殖培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)條件為無菌室內(nèi)光周期優(yōu)選12h/d，光照強(qiáng)度優(yōu)選20001x，培養(yǎng)溫度優(yōu)選25V，培養(yǎng)周期優(yōu)選30天，蘇瑪櫟試管苗的月增殖系數(shù)為叢芽增殖率為1: 2?3。誘導(dǎo)出的叢生芽發(fā)育正常，葉色濃綠，長(zhǎng)勢(shì)旺盛，可以做為蘇瑪櫟擴(kuò)繁增殖的培養(yǎng)基。
[0041]e:在增殖培養(yǎng)基上，蘇瑪櫟試管苗生長(zhǎng)高度參差不齊，將叢生芽分切后，轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基 WPM+6-BA0.15?0.25mg*r1+NAA0.15?0.25mg.!^+ 生物素 I?lOmg.!/1 + 乙酰膽堿I?lOmg.L-1+ 核黃素 I?lOmg.L-1+ 鹿糖 25?35g.L-1+ 瓊脂 4?12g.L'
[0042]本發(fā)明優(yōu)選的壯苗培養(yǎng)基為:WPM+6-BA0.2mg*r1+NAA0.2mg*r1+生物素Smg.!/1+乙酰膽堿Smg*!/1+核黃素Smgt1蔗糖SOg*!/1+瓊脂eg.!/1 ;在壯苗培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)條件為無菌室內(nèi)光周期優(yōu)選12h/d，光照強(qiáng)度優(yōu)選20001x，培養(yǎng)溫度優(yōu)選25°C，培養(yǎng)周期優(yōu)選20天，試管苗長(zhǎng)至3?4cm高，葉片2?3對(duì)，比較整齊，可以用來誘導(dǎo)生根。
[0043]f:本發(fā)明中生根培養(yǎng)基為 1/2WPM+NAA0.5?2.Smg.1^+IBA0.5?2.5 mg.!/1 + 生物素I?lOmg.!/1 +乙酰膽堿I?lOmg.!/1+核黃素I?lOmg.!/1+鹿糖15?35g.]^+瓊脂4?12g*L'當(dāng)NAA、IBA濃度低于I mg.!/1時(shí)，生根率比較低；當(dāng)上調(diào)至2.5 mg-Γ1時(shí)，生根率雖然可以達(dá)到100%，但是在試管苗的基部容易出現(xiàn)愈傷化組織，不利于后期的移栽；蔗糖含量為20g-Γ1時(shí)，也能夠提高生根率及平均生根數(shù)。蘇瑪櫟生根培養(yǎng)時(shí)最佳的激素和礦質(zhì)元素及碳源組合濃度值為Η/^ΡΜ+ΝΑΑΙπ^Ι^+ΙΒΑΙπ^.!/1+生物素+乙酰膽堿Smg.!/1 +核黃素Smg*!/1+蔗糖20 g.!/1+瓊脂6 g.!/1，生根率為65?85% ;培養(yǎng)條件為無菌室內(nèi)光周期優(yōu)選12h/d，光照強(qiáng)度優(yōu)選20001x，培養(yǎng)溫度優(yōu)選25°C，生根培養(yǎng)的周期優(yōu)選30天。
[0044]g:將蘇瑪櫟生根試管苗置于自然環(huán)境中6?10天，一般為一周，取出洗凈，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡數(shù)秒，移栽到草炭土、珍珠巖的混合基質(zhì)中，本發(fā)明中草炭土:珍珠巖=2:1，起始6?10天(一般為一周)內(nèi)采用噴霧保持苗的葉面濕潤(rùn)，相對(duì)濕度為95%左右，并適當(dāng)遮陽，其后(約二周后)按干透濕透的原則澆水，逐漸加強(qiáng)光照至全光照。蘇瑪櫟成活率可以達(dá)到90%。
[0045]總之，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所作的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明專利的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種生物組織培養(yǎng)法繁育蘇瑪櫟優(yōu)株的方法，其特征在于，包括以下步驟:a、環(huán)剝蘇瑪櫟獲得基部萌條；b、在基部萌條中選取帶腋芽的萌條作為外植體，經(jīng)表面消毒；c、初代培養(yǎng)、d、增殖培養(yǎng)；e、壯苗培養(yǎng)；f、生根培養(yǎng)獲得生根試管苗；g、生根試管苗進(jìn)行移栽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物組織培養(yǎng)法繁育蘇瑪櫟優(yōu)株的方法，其特征在于包括下列進(jìn)行: a、在氣溫回升的春季，于優(yōu)樹樹干基部進(jìn)行環(huán)割，深至韌皮部，待萌芽條萌動(dòng)并生長(zhǎng)至5^20 cm時(shí)，選擇晴朗天氣的午后采集獲得基部萌條； b、在基部萌條中選擇生長(zhǎng)健壯，無病蟲害的蘇瑪櫟帶腋芽的萌條做為起始外植體，用洗潔精擦洗表面后，流水沖洗20分鐘，再進(jìn)行消毒處理； C、將消毒處理后的外植體接種到初代培養(yǎng)基上，進(jìn)行初代培養(yǎng)； d、將初代培養(yǎng)的無菌苗轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基，誘導(dǎo)不定芽； e、將誘導(dǎo)出的叢生芽分切后，轉(zhuǎn)移至壯苗培養(yǎng)基，進(jìn)行壯苗培養(yǎng)； f、將經(jīng)壯苗培養(yǎng)生長(zhǎng)到1.5cm以上的試管苗分切后，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中； g、對(duì)所得的生根試管苗進(jìn)行清洗，移至珍珠巖、草炭土的混合基質(zhì)中進(jìn)行栽種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物組織培養(yǎng)法繁育蘇瑪櫟優(yōu)株的方法，其特征在于:步驟a中，在氣溫回升的春季，于優(yōu)樹樹干離地面約1(T30 cm處進(jìn)行環(huán)割，環(huán)割樹干周長(zhǎng)的1/3?4/5，環(huán)割口寬0.1cm?lcm，深至韌皮部，待萌芽條萌動(dòng)并生長(zhǎng)至5?20 cm時(shí)，選擇晴朗天氣的午后采集獲得基部萌條，保濕保鮮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物組織培養(yǎng)法繁育蘇瑪櫟優(yōu)株的方法，其特征在于:步驟b中，取蘇瑪櫟包含腋芽的萌條，切取成為長(zhǎng)度0.5^2.5cm，腋芽位于中間的莖段，切去葉片，保留兩片葉柄基部保護(hù)腋芽生長(zhǎng)點(diǎn)，進(jìn)行消毒處理；先用72%濃度的酒精消毒3(T60s，再用無菌水沖洗:Γ4次，然后用加有0.Γ0.2%的升汞液浸泡15?30分鐘，用無菌水沖洗至無殘留，得到無菌的外植體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物組織培養(yǎng)法繁育蘇瑪櫟優(yōu)株的方法，其特征在于:步驟c中，初代培養(yǎng)基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 0.15?0.25mg*r1+奈乙酸(NAA)0.15?0.25mg*L-1+生物素I?lOmg.L-1+乙酰膽堿I?lOmg.L-1+核黃素I?lOmg.L-1+鹿糖25?358.171+瓊脂 rUg.L-1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物組織培養(yǎng)法繁育蘇瑪櫟優(yōu)株的方法，其特征在于:步驟d中，增殖培養(yǎng)基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 0.Γ2.Smg.!/1+奈乙酸(NAA)0.1?0.5 mg.!/1+生物素I?lOmg.L-1 +乙酰膽堿I?lOmg.!/1+核黃素I?lOmg.!/1+鹿糖20?40g-L—1+瓊脂 4?12 g-L—1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物組織培養(yǎng)法繁育蘇瑪櫟優(yōu)株的方法，其特征在于:步驟e中，所述的壯苗培養(yǎng)基為WPM+6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 0.15^0.奈乙酸(NAA) 0.15?0.25mg*L-1+ 生物素 I?lOmg.L-1+ 乙酰膽堿 I?lOmg.L-1+ 核黃素 I?lOmg.L-1+ 鹿糖 25?358.171+ 瓊脂 rUg.L-1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物組織培養(yǎng)法繁育蘇瑪櫟優(yōu)株的方法，其特征在于:步驟f中，所述的生根培養(yǎng)基為:1/2WPM+奈乙酸(NAA) 0.5?2.5mg.L—1+吲哚丁酸(IBA)0.5?2.5 mg.!/1 +生物素I?lOmg.!/1 +乙酰膽堿I?lOmg.!/1+核黃素I?lOmg.!/1+鹿糖15?358.171+瓊脂 rUg.L-1。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4或5或6或7或8所述的一種生物組織培養(yǎng)法繁育蘇瑪櫟優(yōu)株的方法，其特征在于:所述的初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、壯苗培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件均為無菌環(huán)境，光周期為l(Tl5h/d，光照強(qiáng)度150(Γ25001χ，培養(yǎng)溫度為室溫；初代培養(yǎng)的周期為22?28天，增殖培養(yǎng)的周期為28?32天，壯苗培養(yǎng)的周期為If 22天，生根培養(yǎng)的周期為28?32天。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生物組織培養(yǎng)法繁育蘇瑪櫟優(yōu)株的方法，其特征在于:步驟g中，將生根試管苗置于自然環(huán)境中6?10天，取出洗凈根部，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡數(shù)秒，移栽到草炭土:珍珠巖=2:1的混合基質(zhì)中，起始6?10天內(nèi)保持苗的葉面濕潤(rùn)并適當(dāng)遮陽，其后按干透濕透的原則澆水，逐漸加強(qiáng)光照至全光照，進(jìn)行栽種。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104221850SQ201310222753
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月6日
【發(fā)明者】呂秀立, 施季森, 沈烈英, 張春英, 王軍 申請(qǐng)人:上海市園林科學(xué)研究所