大豆轉(zhuǎn)基因株系混合生根方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大豆轉(zhuǎn)基因株系混合生根方法，采用含轉(zhuǎn)入外源目的基因和抗性篩選基因的大豆胚尖進行篩選培養(yǎng)獲得抗性芽及胚軸，離體培養(yǎng)獲得生根的大豆植株。本發(fā)明的方法，以大豆遺傳轉(zhuǎn)化所得的帶胚軸抗性芽進行離體不定根誘導，生根頻率為100%，顯著提高了大豆遺傳轉(zhuǎn)化頻率，此外，本發(fā)明的方法縮短了獲得轉(zhuǎn)基因植株的時間跨度，所得轉(zhuǎn)化植株比不帶胚軸的單個抗性芽生長勢更為旺盛，結莢更多，轉(zhuǎn)基因子代產(chǎn)量更大，為進一步創(chuàng)造大豆新種質(zhì)提供了很好的技術支持。
【專利說明】大豆轉(zhuǎn)基因株系混合生根方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及大豆種植，具體涉及一種大豆轉(zhuǎn)基因株系混合生根方法。

【背景技術】
[0002] 大豆（Glycine Diax(MMerrill)起源于中國，是我國重要糧食作物之一，己有 五千年栽培歷史，現(xiàn)知有1000個栽培品種。大豆含脂肪約20%，蛋白質(zhì)約40%，還含有豐富的 維生素，富含營養(yǎng)，除供直接食用外，可作醬、醬油和各種豆制食品；莖、葉、豆柏及粗豆粉作 肥料和優(yōu)良的牲畜飼料。豆粕經(jīng)加工制成的組織蛋白、濃縮蛋白、分離蛋白和纖維蛋白等是 多種產(chǎn)品，如人造肉、干酪素、味精及造紙、塑膠工業(yè)、人造纖維、火藥等的原料。豆油除主要 供食用外，并為潤滑劑、油漆、肥皂、瓷釉、人造橡膠、防腐劑等重要原料。此外藥用有滋補養(yǎng) 心、祛風明目、清熱利水、活血解毒等功效（韋直等，中國植物志，北京：科學出版社，1995， 234-236)，因此大豆具有重要的研究價值。
[0003] 1952年，中國大豆總產(chǎn)為952 X 104t，人均占有量約25kg，2003年大豆總產(chǎn)量超過 1.539X107t，但因人口增加，人均占有量下降到11.8kg。隨著國民經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活 水平的提高，加工業(yè)、食品業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展，對大豆的需求急劇增加，大豆供求矛盾日益 突出。目前擴大大豆種植的潛力是有限的，而提高單產(chǎn)還有很大的空間和潛力（趙團結等， 中國農(nóng)業(yè)科學，2006,39(1) :29-37)。
[0004] 大多數(shù)基因型的大豆都來源于同一祖先，因此常規(guī)育種方法對擴大大豆產(chǎn)量的幫 助是很有限的（Hiromoto 等，Brazil Journal of Geneticsl986, 2:295_3〇6)，但是通過先 進的離體培養(yǎng)技術和基因技術可以為優(yōu)化大豆種質(zhì)資源，為提高抗病蟲害能力提供了關鍵 性的技術幫助。
[0005] 目前，盡管大豆的胚尖和子葉節(jié)兩個受體系統(tǒng)的再生頻率很高，但大豆的轉(zhuǎn)基因 頻率偏低，一般低于 2%(Cao 等，Plant Cell Tissue and Organ Culture2009, 96:45-52)。 主要原因是轉(zhuǎn)基因大豆抗性芽經(jīng)過長時間篩選壓后長勢弱化，離體生根能力下降，不定根 的長勢相對弱化。
[0006] 因此，本領域尚需提供一種新型的生根方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種全新的高效離體生根方法一帶胚軸生根法。
[0008] 本發(fā)明的第一方面，提供一種大豆生根方法，包括以下步驟：
[0009] (a)提供一轉(zhuǎn)入外源目的基因和抗性篩選基因的大豆胚尖；
[0010] (b)對步驟a)所述胚尖，在針對所述抗性篩選基因的第一篩選壓力條件下，進行 篩選培養(yǎng)，獲得抗性芽及胚軸；
[0011] (C)將步驟b)獲得的所述抗性芽及胚軸，在針對所述抗性篩選基因的第二篩選壓 力條件下，在進行篩選培養(yǎng)6-20天；
[0012] (d)將經(jīng)步驟c)篩選培養(yǎng)后的所述抗性芽及胚軸，進行生根培養(yǎng)直至所述胚軸下 端長出根系。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的第二篩選壓力<第一篩選壓力。
[0014]在另一優(yōu)選例中，在步驟（d)中，所述的生根培養(yǎng)在第三篩選壓力下進行。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的第三篩選壓力 <第二篩選壓力;^第一篩選壓力。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述的第三篩選壓力;^第二篩選壓力 <第一篩選壓力。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述的第三篩選壓力<第一篩選壓力；且第二篩選壓力< 第一 篩選壓力。
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述的第三篩選壓力< 1/2的第一篩選壓力；且第二篩選壓力 彡1/2的第一篩選壓力。 '
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的外源目的基因和抗性篩選基因位于同一質(zhì)粒上。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的外源目的基因和抗性篩選基因位于農(nóng)桿菌質(zhì)粒上。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的農(nóng)桿菌質(zhì)粒為PCAMBIA2301。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗性芽及胚軸是一體的。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述抗性篩選基因是卡那霉素抗性基因。
[0024]在另一優(yōu)選例中，所述抗性篩選基因是卡那霉素抗性基因，所述第一篩選壓力為 50-150mg_ 171的卡那霉素濃度。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述抗性篩選基因是卡那霉素抗性基因，所述第二篩選壓力為 3〇-80mg. L-1的卡那霉素濃度。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述抗性篩選基因是卡那霉素抗性基因，所述第三篩選壓力為 3O-SOmg. L-1的卡那霉素濃度。
[0027]在另一優(yōu)選例中，采用根癌農(nóng)桿工程菌浸染大豆胚尖獲得所述轉(zhuǎn)入外源目的基因 和抗性篩選基因的大豆胚尖，其中，所述根癌農(nóng)桿工程菌經(jīng)以下步驟獲得：
[0028] 從含卡那霉素的YEP培養(yǎng)平板上挑取含有質(zhì)粒pCAMBIA2301的根癌農(nóng)桿菌單菌落 接種于含有45-55mg. L-1利福平和45-50mg. I/1卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)活化后 離心分離，收集菌體，重懸于液體MS基本培養(yǎng)基中，其中，
[0029] 所述質(zhì)粒pCAMBIA2301帶有CaMV35S啟動的￠-葡萄糖苷酸酶（gus)基因和 CaMV35S啟動的新霉素轉(zhuǎn)移酶（npt II )基因。
[00(30] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟b)將所述胚尖置于含〇? 25_35mg. L-1GAUSO-SSOmg. L-1 替卡西林及50-150mg. L-1卡那霉素的MS基本培養(yǎng)基或MSB5培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)6-25天， 15-18h/d光照，溫度為24_26°C。在另一優(yōu)選例中，在MSB5培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟c)中，將所述抗性芽及胚軸含置于50-150mg. I71替卡 西林，3〇-8〇mg. L_1卡那霉素的1/8MS基本培養(yǎng)基或1/8MSB5培養(yǎng)基中，于14-18h/d光照， 25±1°C條件下進行篩選培養(yǎng)。在另一優(yōu)選例中，在1/8MSB5培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟d)包括二個子步驟：
[0033] (dl)將經(jīng)步驟c)篩選培養(yǎng)后的所述抗性芽及胚軸進行生根培養(yǎng)至所述胚軸下端 發(fā)根；
[0034] (d2)將經(jīng)步驟dl)生根培養(yǎng)后的所述抗性芽及胚軸進行培養(yǎng)至所述胚軸長出 10-15cm 根系。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟dl)中，將所述抗性芽及胚軸置于含0.5-1.5mg. L_1IBA (吲哚丁酸），5〇-l5〇mg. I/1替卡西林，30-8〇mg. L_1卡那霉素的1/4MS基本培養(yǎng)基或 1/4MSB5培養(yǎng)基中于14_18h/d光照，25土 1°C條件下生根培養(yǎng)；和/或
[0036] 所述步驟d2)中，將所述生根培養(yǎng)后的所述抗性芽及胚軸轉(zhuǎn)接到含〇. 5-1. 5mg. L-1IBAjO-I5Omg. L-1替卡西林，3〇-8〇mg_廠1卡那霉素的IAMS基本培養(yǎng)基或1/2MSB5培養(yǎng) 基中于14-18h/d光照，25土1°C條件下培養(yǎng)。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟dl)中在1/4MSB5培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟dl)中在1/2MSB5培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
[0039] 本發(fā)明的第二方面，提供一種轉(zhuǎn)基因大豆種子的制備方法，包括以下步驟：
[0040] ⑴種植多個大豆轉(zhuǎn)基因株系至結莢，其間，進行葉片⑶S染色、PCR檢測及 Southern blot 檢測；
[0041] (ii)取GUS染色、PCR檢測及Southern blot檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因株系，收獲并保 存種子，為TO代轉(zhuǎn)基因大豆種子；以及任選地，
[0042] (iii)種植所述TO代種子，苗期進行GUS染色、PCR檢測，收獲并保存結果均為陽 性的株系的種子，為n代轉(zhuǎn)基因大豆種子；以及任選地，
[0043] (iv)種植所述Tl代種子，苗期進行GUS染色、PCR檢測，收獲并保存結果均為陽性 的株系的種子,為T2代轉(zhuǎn)基因大豆種子。
[0044]其中，所述大豆轉(zhuǎn)基因株系來源于同一個由第一方面所述的方法獲得的生根胚 軸。
[0045] 應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]圖 1 示出質(zhì)粒 pCAMBIA2301 的 T-DNA 區(qū)。
[0047] 圖2不出大顯胚尖長出的抗性芽，bar=lcm。
[0048] 圖3不出大伸長的抗性芽，bar=lcm。
[0049] 圖4示出大豆生根的轉(zhuǎn)基因植株，bar=2cm。
[0050]圖5示出大豆結莢的轉(zhuǎn)基因植株，兩個抗性芽形成兩個株系：系1和系2， bar=5cm〇

【具體實施方式】
[0051]本申請的發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入地研究，首次使用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法獲得大量 抗性芽，并改進傳統(tǒng)的大豆轉(zhuǎn)基因抗性芽的離體生根方法，創(chuàng)造出一種全新的高效離體生 根方法一帶胚軸生根法，獲得了大量的大豆轉(zhuǎn)基因植株苗并開花結莢。在此基礎上，完成了 本發(fā)明。
[0052] 培養(yǎng)基
[0053] MS ?養(yǎng)基或稱為MS基本培養(yǎng)基（Murashige and Skoog，簡稱MS培養(yǎng)基），是指 Murashige的經(jīng)典培養(yǎng)基（Murashige et al. 1962)。采用本領域已知的配方配制MS培養(yǎng) 基即可。
[0054] MSB5培養(yǎng)基包含MS基本培養(yǎng)基的大量和微量元素 （Murashige et al. 1962)，有 機部分為B5培養(yǎng)基的有機成分，即溶液（肌醇100mg/L，煙酸lmg/L，鹽酸吡哆醇lmg/L，鹽 酸硫銨10mg/L。具體地，MSB 5培養(yǎng)基包含0? 5%B5培養(yǎng)基的有機成分（肌醇l〇〇mg/L，煙酸 lmg/L，鹽酸批卩多醇lmg/L，鹽酸硫銨10mg/L)、3%的蔗糖、0? lmg. L-1肌醇、0? 7%瓊脂,調(diào)節(jié)pH 至5. 8,121 °C滅菌15-25分鐘后使用。
[0055] 將MS基本培養(yǎng)基或MSB5培養(yǎng)基中大量元素的含量減少至原含量的1/8,得到 1/8MS基本培養(yǎng)基或1/8MSB5培養(yǎng)基。將MS基本培養(yǎng)基或MSB5培養(yǎng)基中大量元素的含量 減少至原含量的1/4,得到1/4MS基本培養(yǎng)基或1/4MSB5培養(yǎng)基。將MS基本培養(yǎng)基或MSB5 培養(yǎng)基中大量元素的含量減少至原含量的1/2,得到1/2MS基本培養(yǎng)基或1/2MSB5培養(yǎng)基。 其中，大量元素是指硝酸鉀KN0 3、硝酸銨NH4N03、磷酸二氫鉀KH2P04、硫酸鎂MgSO 4. 7H20和氯 化鈣CaCl2. 2H20等五種化合物中的金屬元素。1/2MS基本培養(yǎng)基或1/2MSB5培養(yǎng)基即是 指將培養(yǎng)基中硝酸鉀KN0 3、硝酸銨NH4N03、磷酸二氫鉀KH2P04、硫酸鎂MgSO 4. 7H20和氯化鈣 CaCl2. 2H20等五種化合物質(zhì)量減半。
[0056] YEP培養(yǎng)基也是一種常用的培養(yǎng)基，其中，所述YEP配體培養(yǎng)基的配方：蛋白胨 (tryptone)10g/L,酵母提取物（yeast extract) 10g/L，NaC110g/L，溶劑為水。若配成 YEP 培養(yǎng)平板（YEP固體培養(yǎng)基），在高壓滅菌前加適量瓊脂（如20g/L)。
[0057] 本發(fā)明所用的感染液培養(yǎng)基沒有特別的限制，有助于農(nóng)桿菌感染外植體的感染液 均可用于本發(fā)明，如包含誘導培養(yǎng)基NB、乙酰丁香酮（80-120mol/L)、葡萄糖（30-40g/L)的 感染液培養(yǎng)基。
[0058] 根癌農(nóng)桿菌及其工程菌
[0059] 根癌農(nóng)桿菌（農(nóng)桿菌，Agrobacterium tumefaciens)是一種能誘發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤 的細菌。農(nóng)桿菌普遍存在于土壤中，為革蘭氏陰性細菌，能在自然條件下趨化性地感染大多 數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導長生冠癭瘤或法狀根。
[0060] 本發(fā)明的一優(yōu)選例中，對農(nóng)桿菌進行改造，將帶有CaMV35S啟動的0 -葡萄糖苷酸 酶（gus)基因和CaMV35S啟動的新霉素轉(zhuǎn)移酶（npt II )基因的質(zhì)粒PCAMBIA2301導入到 農(nóng)桿菌中，經(jīng)篩選得到根癌農(nóng)桿菌工程菌，用以浸染胚尖。其中，質(zhì)粒pCAMBIA-2301是常用 于植物表達的載體（如參見CN102337291A)，可在在農(nóng)桿菌里復制，該載體特性有大腸桿菌 卡那霉素抗性；植物卡那霉素選擇標記；含有報告基因 GUS。
[0061] 生根方法
[0062] 本發(fā)明的生根方法，包括以下步驟：
[0063] (a)提供一轉(zhuǎn)入外源目的基因和抗性篩選基因的大豆胚尖；
[0064] (b)對步驟a)所述胚尖，在針對所述抗性篩選基因的第一篩選壓力條件下，進行 篩選培養(yǎng)，獲得抗性芽及胚軸；
[0065] (C)將步驟b)獲得的所述抗性芽及胚軸，在針對所述抗性篩選基因的第二篩選壓 力條件下，在進行篩選培養(yǎng)6-20天；
[0066] (d)將經(jīng)步驟c)篩選培養(yǎng)后的所述抗性芽及胚軸，進行生根培養(yǎng)直至所述胚軸下 端長出根系。
[0067] 本發(fā)明的一優(yōu)選例中，所述步驟a)中采用以下步驟獲得所述胚尖：
[0068] (al)提供無菌的大豆種子，米用無菌水浸泡吸脹后，剝出胚尖進行培養(yǎng)；
[0069] (b 1)將經(jīng)步驟al)培養(yǎng)后的胚尖在含根癌農(nóng)桿工程菌的培養(yǎng)液中浸染，獲得轉(zhuǎn)入 外源目的基因和抗性篩選基因的大豆胚尖。
[0070] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟a)還包括（Cl)將經(jīng)步驟bl)浸染的胚尖進行培養(yǎng)的 步驟D
[0071] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟Cl)中將胚尖置于鋪有濾紙的MS基本培養(yǎng)基或MSB5 培養(yǎng)基(較佳地，為MSB5培養(yǎng)基）中于24-26°C避光培養(yǎng)4-5天。在另一優(yōu)選例中，所述胚 尖經(jīng)浸染后，置于無菌濾紙上吸干菌液，然后放置于濾紙上培養(yǎng)。在另一優(yōu)選例中，所述MS 基本培養(yǎng)基中含3mg. L_16-BA，200uM AS。
[0072] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（al)中將大豆種子用70-80(w/v)%酒精做表面消毒， 然后用0? 1-0. 2 (w/v) %氯化汞搖洗所述大豆種子，無菌水沖洗，再用10-15 (w/v) %次氯酸鈉 搖洗，無菌水沖洗后用無菌水浸泡。
[0073] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（al)中選取粒大、飽滿的成熟大豆種子，將大豆種子 用70-80%酒精做表面消毒，然后用〇? 1-〇_ 2%氯化汞搖洗所述大豆種子6-8分鐘，無菌水沖 洗5-8次,再用10-15%次氯酸鈉搖洗5-6分鐘，無菌水沖洗5-8次后用無菌水浸泡，于4°C 冰箱保存。
[0074] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（al)中將所述胚尖放入MS基本培養(yǎng)基或MSB5培養(yǎng)基 (較佳地，為MSB5培養(yǎng)基）于16±4h/d光照，溫度為25± 1°C條件下培養(yǎng)3-5天。在另一優(yōu) 選例中，所述MS基本培養(yǎng)基或MSB5培養(yǎng)基中含3 ± lmg. Ll-BA (6-芐氨基腺嘌呤）。
[0075] 在另一優(yōu)選例中，所述根癌農(nóng)桿工程菌經(jīng)以下步驟獲得：
[0076] 從含卡那霉素的YEP培養(yǎng)平板上挑取含有質(zhì)粒pCAiffiIA2301的根癌農(nóng)桿菌單菌 落接種于含有45-55mg. I71利福平和妨-50mg. L-1卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)活化 后離心分離，收集菌體，重懸于液體MS基本培養(yǎng)基或MSB5培養(yǎng)基(較佳地，為MSB5培養(yǎng)基） 中，其中，
[0077] 所述質(zhì)粒pCAMBIA2301帶有CaMV35S啟動的葡萄糖苷酸酶（gus)基因和 CaMV35S啟動的新霉素轉(zhuǎn)移酶（即t II )基因。
[0078] 在另一優(yōu)選例中，所述YEP培養(yǎng)平板含卡那霉素（Kanamycin)，含量為40-60mg/L， 較佳地為50mg/L。
[0079] 在另一優(yōu)選例中，所述活化包括兩次活化，第一次活化是指挑取含有質(zhì)粒 PCAMBIA2301的根癌農(nóng)桿菌單菌落接種于含有45-55mg. L_1利福平和45-50mg. L-1卡那霉素 的YEP液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，28°C搖床，250rpm震蕩6-8小時；所述第二次活化是指取l-5ml經(jīng) 第一次活化得到的菌液在5〇ml YEP液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，條件為28°C搖床，250rpm震蕩 6-8小時。
[0080] 在另一優(yōu)選例中，所述離心是在4000-5000rpm，0-4°C離心5-10分鐘。
[0081] 在另一優(yōu)選例中，所述液體MS基本培養(yǎng)基或MSB5培養(yǎng)基內(nèi)含3mg. L W-BA，200uM 乙酰丁香酮（AS)。
[0082] 在另一優(yōu)選例中，所述浸染的條件為在27-30°C于200-300rpm浸染2〇_ 3〇min。
[0083] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟b)將所述胚尖置于含〇? 25_35mg. L-1GAU5OISOmg. L_1 替卡西林及50-150mg. L_1卡那霉素的MS基本培養(yǎng)基或MSB5培養(yǎng)基(較佳地，為MSB5培養(yǎng) 基)中篩選培養(yǎng)6-25天，15-18h/d光照，溫度為24-26°C。較佳地，所述步驟b)將所述胚尖 置于含0. 3mg. L-1GAdOOmg. L-1替卡西林及l(fā)〇〇mg_ L4卡那霉素的MS基本培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng) 6- 25天，16h/d光照，溫度為料-26°C。
[0084] 在另一優(yōu)選例中，將所述胚尖用400mg_ I/1替卡西林（ticarcilin)無菌溶液進行 抑菌處理，用無菌濾紙吸千水分再進行所述篩選培養(yǎng)。在另一優(yōu)選例中，進行所述篩選培養(yǎng) 7- 10天后，攜帶了外源基因的抗性胚尖長出2-3個抗性芽，又約12-18以后，抗性芽繼續(xù)伸 長長出主莖。
[0085] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟c)中，將所述抗性芽及胚軸含置于SO-I5Omg.!/1替卡 西林，30-80mg. L 1卡那霉素的1/8MS基本培養(yǎng)基或1/8MSB5培養(yǎng)基(較佳地，為1/8MSB5 培養(yǎng)基）中，于14-18h/d光照，25土 1°C條件下進行篩選培養(yǎng)。較佳地，所述步驟c)中，將 所述抗性芽及胚軸含置于IOOmg. I/1替卡西林，50mg. L_1卡那霉素的1/SMS基本培養(yǎng)基或 1/8MSB5培養(yǎng)基(較佳地,為1/8MSB5培養(yǎng)基）中，于l 6h/d光照，25±1°C條件下進行篩選培 養(yǎng)。
[0086] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟c)中所述篩選培養(yǎng)的時間為7-10天。
[0087] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟b)中篩選壓為50_150mg. L/1卡那霉素，所述步驟c)中 篩選壓減半。
[0088] 在另一優(yōu)選例中,所述步驟d)包括二個子步驟：
[0089] (dl)將經(jīng)步驟c)篩選培養(yǎng)后的所述抗性芽及胚軸進行生根培養(yǎng)至所述胚軸下端 發(fā)根；
[0090] (d2)將經(jīng)步驟dl)生根培養(yǎng)后的所述抗性芽及胚軸進行培養(yǎng)至所述胚軸長出 10-15cm 根系。
[0091] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟dl)中，將所述抗性芽及胚軸置于含〇. 5-1. 5mg. IZ1IBA (吲哚丁酸），50-150mg. L1替卡西林，30-80mg. L_1卡那霉素的1/4MS基本培養(yǎng)基或 1/4MSB5培養(yǎng)基(較佳地，為1/4MSB5培養(yǎng)基)中于14-18h/d光照，25 土 1°C條件下生根培養(yǎng)。 較佳地，所述步驟dl)中，將所述抗性芽及胚軸置于含lmg. L1IBA (吲哚丁酸），IOOmg. L1替 卡西林，50mg. L/1卡那霉素的1/4MS基本培養(yǎng)基或1/4MSB5培養(yǎng)基(較佳地，為1/4MSB5培 養(yǎng)基）中于16h/d光照，25 土 1°C條件下生根培養(yǎng)5-6天。
[0092] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟d2)中，將所述生根培養(yǎng)后的所述抗性芽及胚軸轉(zhuǎn)接 到含〇? 5-1_ 5mg_ L_1IBA，50-150mg_ L-1替卡西林，30-80mg. L-1卡那霉素的1/2MS基本培養(yǎng)基 或1々MSB5培養(yǎng)基(較佳地，為1/2MSB5培養(yǎng)基）中于14-18h/d光照，25±1°C條件下培養(yǎng)。 較佳地，將所述生根培養(yǎng)后的所述抗性芽及胚軸轉(zhuǎn)接到含lmg. L_1IBA, IOOmg. L_1替卡西林， 50mg. 171卡那霉素的1/2MS基本培養(yǎng)基或1/2MSB5培養(yǎng)基(較佳地，為1/2MSB5培養(yǎng)基）中 于16h/d光照，25土 rc條件下培養(yǎng)。
[0093]在另一優(yōu)選例中，所述步驟d2)中，培養(yǎng)8-15天，抗性芽隨同胚軸生根，平均每個 胚軸10-15cm長的根系。
[0094] 在本發(fā)明的一優(yōu)選實施方式中，大豆生根方法包括以下步驟：
[0095] (a'）提供無菌的大豆種子，采用無菌水浸泡吸脹后，剝出胚尖進行培養(yǎng)；
[0096] (b'）將經(jīng)步驟a'）培養(yǎng)后的胚尖在含根癌農(nóng)桿工程菌的培養(yǎng)液中浸染；
[0097] (c'）將經(jīng)步驟b'）浸染的胚尖進行培養(yǎng)；
[0098] (d'）將經(jīng)步驟C'）培養(yǎng)后的胚尖進行篩選培養(yǎng)，獲得抗性芽及胚軸；
[0099] (e'）將步驟d'）獲得的所述抗性芽及胚軸進行篩選培養(yǎng)；
[0100] (f'）將經(jīng)步驟e'）篩選培養(yǎng)后的所述抗性芽及胚軸進行生根培養(yǎng)至所述胚軸下 端發(fā)根；
[0101] (g'）將經(jīng)步驟f'）生根培養(yǎng)后的所述抗性芽及胚軸進行培養(yǎng)，所述胚軸長出 10-15cm 根系。
[0102] 轉(zhuǎn)基因大豆種子的制備方法
[0103] 本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)基因大豆種子的制備方法，包括以下步驟：
[0104] (i)種植多個大豆轉(zhuǎn)基因株系至結莢，其間，進行葉片GUS染色、PCR檢測及 Southern blot 檢測；
[0105] (ii)取GUS染色、PCR檢測及Southern blot檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因株系，收獲并保 存種子，為TO代轉(zhuǎn)基因大豆種子；以及任選地，
[0106] (iii)種植所述TO代種子，苗期進行GUS染色、PCR檢測，收獲并保存結果均為陽 性的株系的種子，為Tl代轉(zhuǎn)基因大豆種子；以及任選地，
[0107] (iv)種植所述Tl代種子，苗期進行GUS染色、PCR檢測，收獲并保存結果均為陽性 的株系的種子，為T2代轉(zhuǎn)基因大豆種子。
[0108] 其中，所述大豆轉(zhuǎn)基因株系來源于同一個由本方法獲得的生根胚軸。
[0109] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟i)將已生根的在一個胚軸上的多個大豆轉(zhuǎn)基因株系 移栽到土壤，所述土壤的基質(zhì)為擬南芥種植基質(zhì)，其中泥炭6重量份、珍珠巖3重量份、蛭石 1重量份,事先12 rc滅菌60-120分鐘。
[0110] 本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說明書所揭示 的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以被任何提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特 征的一般性例子。
[0111] 本發(fā)明的有益之處在于：
[0112] ⑴所有的抗性芽得以離體生根，生根頻率為100% ;
[0113] (2)將一個胚軸上的所有抗性芽進行移栽，存活后檢測，顯著提高了大豆遺傳轉(zhuǎn)化 頻率；
[0114] ⑶縮短了獲得轉(zhuǎn)基因植株的時間跨度，縮短了 1-2個月；
[0115] (4)所得轉(zhuǎn)化植株比不帶胚軸的單個抗性芽生長勢更為旺盛，結莢更多，轉(zhuǎn)基因子 代產(chǎn)量更大，轉(zhuǎn)基因植株結實率提高150%。
[0116] (5)使得大豆遺傳轉(zhuǎn)化的受體品種依賴性減小。Ko6-82,北豆21、北豆8731等受 體品種的平均轉(zhuǎn)化效率提高15%。
[0117] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，I989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計算。 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明方法中。文 中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0119] 通用方法
[0120] (1)轉(zhuǎn)化植株的⑶S基因的組織化學檢測（⑶S檢測）
[0121] 按照Jefferson等（1987)的方法，取共培養(yǎng)l-5d的下胚軸切段、在篩選培養(yǎng)基上 生長的抗性愈傷組織和抗性植株的針葉，分別浸入到X-Gluc溶液（含Na2EDTA10mmol/l，磷 酸緩沖液lOOmmol/1，pH7. 0,亞鐵氰化鉀0. 5mmol/l，高鐵氰化鉀0. 5mmol/l，20%甲醇（V/ V)和0_1%X-Gluc(W/V))中，37°C保溫過夜。洗滌后組織轉(zhuǎn)入95%乙醇中脫色，觀察染色情 況。
[0122] (2) PCR 檢測
[0123] PCR 擴增 npt II 基因的引物為：P1 (5, -TGC GCT GCG AAT CGG GAG CG-3'）和 P2 (5'-GAG GCT ATT CGG CTA TGA CT-3'），可擴增出 7IObp 的 PCR 產(chǎn)物。PCR 擴增 gus 基 因的引物為：P3 (5'-CGA CGG CCT GTG GGC ATT CA-3'）和 P4 (5,-TGGTCG TGC ACC ATC AGC AC-3'），可擴增出900bp的PCR產(chǎn)物。每個反應體積為50U 1，其中上下游引物各0. 4uM， 4 種 dNTP 各 200 u M，10 X buffer5 u I，Taq DNA 聚合酶 2U，最后加水至 50 u 1。PCR 反應條 件：94°C預變性5min ;然后94°C變性lmin，54°C復性lmin，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)；最 后，72°C延伸7min。5-10 u I PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 2%瓊脂糖凝膠電泳分離，觀察拍照。
[0124] (3)轉(zhuǎn)化植株的Southern blot分析
[0125] DNA片段向雜交膜的轉(zhuǎn)移（堿法轉(zhuǎn)移）和固定
[0126] 對PCR陽性的轉(zhuǎn)化植株和未轉(zhuǎn)化植株每個樣品各取40 Hg DNA經(jīng)HindIII完全消化 后，在含EB的0? 8%瓊脂糖凝膠上，小于lV/cm電泳過夜。在紫外下觀察酶切及電泳效果， 拍照記錄。凝膠切去無用部分，切去一角作為標記。在數(shù)倍體積堿性轉(zhuǎn)移液（0.4M NaOH, 1 M NaCl)中浸泡lh，不斷溫和振，其間更換堿性轉(zhuǎn)移液一次。通過毛細管作用把DNA片段轉(zhuǎn) 移到Hybond-N+上，轉(zhuǎn)移緩沖液為上述堿性轉(zhuǎn)移液。
[0127] DNA轉(zhuǎn)移完全后，在數(shù)倍體積中和緩沖液（0? 5M Tris-HCl (pH7. 2)，IM NaCl)中輕 搖中和30min，其間更換一次中和液。將尼龍膜在80°C烤箱中烘烤2h，固定DNA。尼龍膜冷 至室溫，用保鮮膜包裹，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0128] 探針DNA的標記
[0129] 以常規(guī)的pCAMBIA2301為模經(jīng)PCR擴增的叩t II基因片段（710bp)和gus基 因片段（9IObp)。采用隨機引物法（Takara試劑盒）用[a -32P] dCTP進行探針標記。
[0130] Southern blot
[0131] 用2XSSC溶液（上海寶曼生物科技）濕潤尼龍膜。將尼龍膜裝入盛有適量 (200u 1/cm2)預雜交液（6XSSC，5XDenhardt，s，0. 5%SDS, IOOii g/ml 變性鮭魚精子 DNA， 50%甲酰胺）的雜交管中，使尼龍膜展開緊貼于管壁，蓋緊雜交管，42°C預雜交4h。
[0132] 將探針置于加熱平臺95°C加熱5min，迅速置冰浴中5min。
[0133] 取下雜交管，更換預雜交液，將變性后的探針加入預雜交液中,雜交爐內(nèi)65 °C旋轉(zhuǎn) 雜交24h。
[0134] 倒出放射性雜交液，取出尼龍膜，迅速置洗膜液I (2XSSC，0.5%SDS)中，室溫下 漂洗5min。
[0135] 將膜轉(zhuǎn)入洗膜液II (2XSSC，0. 1%SDS)中，室溫下漂洗15min。
[0136] 將膜轉(zhuǎn)入洗膜液III (〇. I XSSC，0. 5%SDS)中，雜交爐中37°C旋轉(zhuǎn)洗膜3〇min。 t〇137] 將膜轉(zhuǎn)入新鮮洗膜液HI中，雜交爐中68°C旋轉(zhuǎn)洗膜30min。
[0138]從雜交管中取出尼龍膜，用〇. IXSSC室溫短暫漂洗尼龍膜，滴盡多余液體后用保 鮮膜包好。
[0139] 壓X-光片，-70°C放射自顯影3d。
[0140] 實施例1
[0141] 根癌農(nóng)桿菌工程菌的構建
[0142] I. 1菌株和質(zhì)粒
[0143] 供試菌株：EHA105(農(nóng)桿堿型）、LB4404(章魚堿型）和GV3301 (胭脂堿型）。
[0144] 質(zhì)粒：pCAMBIA2301。該質(zhì)粒帶有CaMV35S啟動的P -葡萄糖苷酸酶（gus)基因和 CaMV35S啟動的新霉素轉(zhuǎn)移酶（npt II )基因，如圖1所示。
[0145] 1.2.質(zhì)粒載體導入根癌農(nóng)桿菌及其鑒定
[0146] 參考Hofgen和Willmitzel (1988)的凍融法直接將質(zhì)粒pCAMBIA2301導入上述三 個農(nóng)桿菌菌株中。小量制備質(zhì)粒DNA進行鑒定，具體步驟如下：
[0147] (1)根癌農(nóng)桿菌生長于含有50mg/l利福平的YEP固體平板上，任挑一單菌落接入 5ml YEP液體培養(yǎng)基中于28°C，200rpm振搖培養(yǎng)過夜。
[0148] (2)按1%接種量將上述菌液接種入50ml新鮮的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C， 2OOrpm 振搖培養(yǎng)至對數(shù)生長期。
[0149] (3)4000rpm，4°C離心IOmin收集農(nóng)桿菌菌體，菌體用5ml預冷的TE(pH7_ 5)洗滌 一次，加入5ml新鮮的YEP液體培養(yǎng)基重新懸浮。
[0150] (4)取2OOil 1分裝于I. 5ml的Eppendorf管中，液氮速凍后于-70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0151] (5)直接取步驟3中菌液200w 1 (或取一管凍存細胞，冰上化凍后）加入Iug質(zhì) 粒DNA混勻，然后依次于冰浴上、液氮和37°C水浴中各放置5min。
[0152] (6)用新鮮的YEP液體培養(yǎng)基稀釋至1ml，于28°C振搖培養(yǎng)4小時。
[0153] ⑵取200 y 1涂布于含卡那霉素 lOOmg/1的YEP固體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)2-3天。
[0154] (8)生長的菌落在相應的YEP固體平板上劃分單菌落，重復3次。
[0155] (9)隨機挑選2個單菌落，用試劑盒小量制備質(zhì)粒DNA。
[0156] (1〇)用氯化鈣法將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入常規(guī)的大腸桿菌E. coli DH5 a中。
[0157] (11)再隨機挑取2個DH5 a轉(zhuǎn)化菌落，用試劑盒小量制備質(zhì)粒DNA后進行酶切鑒 定，結果為所需。
[0158] 1.3工程菌菌液制備
[0159] 經(jīng)活化的農(nóng)桿菌以每管200 分裝后于-7(TC備用。感染前1-2d取出農(nóng)桿菌，在 冰上接種于100mg/l卡那霉素的YEP固體培養(yǎng)基中，28。(：暗培養(yǎng)l-2d后挑取單菌落，重新 接種于含100mg/l卡那霉素的5ml YEP液體培養(yǎng)基，28°C搖床培養(yǎng)過夜，然后菌液轉(zhuǎn)至50ml 新鮮的上述YEP液體培養(yǎng)基中搖至對數(shù)生長期，4°C、4000rpm離心5min后收集菌體，再用洗 滌并收集菌體，最后將農(nóng)桿菌懸浮于加乙酰丁香酮（AS)的感染液培養(yǎng)基中備用。
[0160] 實施例2
[0161] 抗性芽帶胚軸離體生根
[0162]選取粒大、飽滿的成熟大豆種子,將所得的種子用70%酒精做表面消毒，然后將種 子倒入無菌三角瓶中用〇? 1%升萊搖洗6-8分鐘，無菌水沖洗5_8次，再用10%次氯酸鈉 (NaClO)搖洗5-6分鐘，無菌水沖洗5-8次后用無菌水浸泡于4°C冰箱。
[0163] 待到種子充分吸脹后，在無菌條件下將種子從三角瓶中取出，剝出胚尖，放入MSB5 培養(yǎng)基（內(nèi)含3mg.L 6-BA)中了頁培養(yǎng)3-5天。培養(yǎng)條件：l6h/d光照,25±1°C。
[0164] 將預培養(yǎng)后的大豆胚尖在實施例1制備的根癌農(nóng)桿菌工程菌中浸染30分鐘；浸染 條件：28°C 搖床，250rpm。
[0165] 無菌條件下將浸染后的胚尖取出，置于無菌濾紙上吸干菌液，然后放置于鋪有濾 紙的MSB5培養(yǎng)基（含 3mg. Ll-BA，2OOuM AS)中（胚尖置于濾紙上）共培養(yǎng)4-5天；培養(yǎng) 條件：暗中，25±1°C。
[0166] 隨后，將胚尖用400mg. I71替卡西林（ticarcilin)無菌溶液抑菌，用無菌濾紙吸干 水分后置于MSB5培養(yǎng)基（含0. 3mg_ L 1GA, 200mg. L-1替卡西林，IOOmg. L-1卡那霉素）中篩 選培養(yǎng)；培養(yǎng)條件：16h/d光照，25 土 1°C。
[0167] 7-10天后，攜帶了外源基因的抗性胚尖長出2-3個抗性芽，如圖1所示，又約丨5天 以后，抗性芽繼續(xù)伸長長出主莖，如圖2所示。
[0168] 將抗性芽和胚軸先置于1/8MSB5培養(yǎng)基（含lOOmg. L/1替卡西林，50mg. L-1卡那霉 素）中，篩選壓減半；培養(yǎng)條件：16h/d光照,25±1°C。培養(yǎng)7-10天。
[0169] 然后抗性芽和胚軸置于1/4MSB5培養(yǎng)基（含lmg. L_1IBA，IOOmg. L-1替卡西林， 50mg. I71卡那霉素）中生根培養(yǎng)5_6天，篩選壓減半，胚軸下端出現(xiàn)發(fā)根跡象；培養(yǎng)條件： 16h/d 光照，25±1°C。
[0170] 將發(fā)根的植株轉(zhuǎn)接到V2MSB5培養(yǎng)基（含lmg. L-1IBA, IOOmg. L-1替卡西林，50mg. r1卡那霉素）中培養(yǎng)10天左右，培養(yǎng)條件：16h/d光照，25±1°C。結果表明，采用實施例 1制備的各種根癌農(nóng)桿菌工程菌處理胚尖后，得到的所有的抗性芽隨同胚軸生根，生根頻率 為100%，平均每個胚軸10-15on長的根系，如圖3所示。
[0171] 實施例3
[0172] 轉(zhuǎn)基因大豆種子 t〇173] 將實施例2獲得的已生根的在一個胚軸上的多個大豆轉(zhuǎn)基因株系移栽到土壤，基 質(zhì)為擬南芥種植基質(zhì)（其中泥炭6重量份，珍珠巖3重量份，蛭石1重量份，事先121°C滅菌 60-120分鐘）。其中，將一個胚軸上的單個芽命名為一個轉(zhuǎn)基因株系（即若一個胚軸上有 三個抗性芽，則分別命名為Iinel (系l)、line2(系2)、line3(系3))。
[0174] 在人工氣候室中，約20-25天后多個轉(zhuǎn)基因植株苗開花結莢,如圖4所示。
[0175]期間，取不同株系的幼嫩葉片做⑶S染色，再?、荢染色陽性的株系進行PCR檢 狽!|。然后GUS、PCR陽性植株進行Southern blot檢測，保留上述三種檢測結果為陽性的轉(zhuǎn) 基因植株，收獲并保存轉(zhuǎn)基因大豆種子（T0代種子）。
[0176] 播種TO代種子，苗期進行GUS和PCR檢測，收獲其中陽性株系,并收獲Tl代種子。 [0177] 播種Tl代種子，苗期進行GUS和PCR檢測，保留其中陽性株系,收獲T2代轉(zhuǎn)基因 株系中的純系，并保種。
[0178] 重復三次試驗，累計從150個胚軸獲得大豆植株系72個,PCR和Southern blot檢 測陽性株系40個,轉(zhuǎn)化效率為12-27%。
[0179] 對比例1
[0180] 抗性芽離體生根
[0181]單士抗性芽從胚軸上切離后生根，重復三次試驗，生根頻率為50%。累計從150個 胚軸獲得大豆植株系30個，PCR和Southern blot檢測陽性株系15個，轉(zhuǎn)化效率為5-10%。
[0182]本發(fā)明的方法，所有的抗性芽隨同胚軸生根，與單個抗性芽生根相比，生根頻率提 高到100%，且比單個抗性芽生根體系的轉(zhuǎn)化效率提高50%以上。所得轉(zhuǎn)化植株比不帶胚 軸的單個抗性芽生長勢更為旺盛，結莢更多，轉(zhuǎn)基因子代產(chǎn)量更大，轉(zhuǎn)基因植株結實率提高 150%。與單個抗性芽生根相比，獲得轉(zhuǎn)基因植株的時間跨度縮短了丨-2個月。并且，采用 本發(fā)明的生根方法，大豆遺傳轉(zhuǎn)化的受體品種依賴性減小，經(jīng)測試，K 〇6-82,北豆21、北豆 8731等受體品種的平均轉(zhuǎn)化效率提高15%。
[0183] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
【權利要求】
1. 一種大豆生根方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (a) 提供一轉(zhuǎn)入外源目的基因和抗性篩選基因的大豆胚尖； (b) 對步驟a)所述胚尖，在針對所述抗性篩選基因的第一篩選壓力條件下，進行篩選 培養(yǎng)，獲得抗性芽及胚軸； (c) 將步驟b)獲得的所述抗性芽及胚軸，在針對所述抗性篩選基因的第二篩選壓力條 件下，在進行篩選培養(yǎng)6-20天； ' (d) 將經(jīng)步驟c)篩選培養(yǎng)后的所述抗性芽及胚軸，進行生根培養(yǎng)直至所述胚軸下端長 出根系。 2?如權利要求1所述的方法,其特征在于，所述的第二篩選壓力 < 第一篩選壓力。 3?如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（d)中，所述的生根培養(yǎng)在第三篩選 壓力下進行。
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第三篩選壓力<第二篩選壓力<第 一篩選壓力。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，采用根癌農(nóng)桿工程菌浸染大豆胚尖獲得所 述轉(zhuǎn)入外源目的基因和抗性篩選基因的大豆胚尖，其中，所述根癌農(nóng)桿工程菌經(jīng)以下步驟 獲得： 從含卡那霉素的YEP培養(yǎng)平板上挑取含有質(zhì)粒pCAMBIA2301的根癌農(nóng)桿菌單菌落接種 于含有45-55mg_ L-1利福平和45-50mg_ L 1卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，經(jīng)活化后離心 分離，收集菌體,重懸于液體MS基本培養(yǎng)基中，其中， 所述質(zhì)粒pCAMBIAMOl帶有CaMV35S啟動的P -葡萄糖苷酸酶（gus)基因和CaMV35S 啟動的新霉素轉(zhuǎn)移酶（npt II )基因。 6?如權利要求1所述的方法，其他特征在于，所述步驟b)將所述胚尖置于含 0? 25_35mg. IZ1GAU5O-25Omg. I/1替卡西林及5O-I5Omg. L-1卡那霉素的MS基本培養(yǎng)基或 MSB5培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)6_25天，15-18h/d光照，溫度為24-26°C。 7?如權利要求1所述的方法,其特征在于，所述步驟c)中,將所述抗性芽及胚軸含置于 50_150mg. L_1替卡西林，30-8〇mg. I/1卡那霉素的1/8MS基本培養(yǎng)基或1/8MSB5培養(yǎng)基中，于 14_18h/d光照，25± 1°C條件下進行篩選培養(yǎng)。
8. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟d)包括二個子步驟： (dl)將經(jīng)步驟c)篩選培養(yǎng)后的所述抗性芽及胚軸進行生根培養(yǎng)至所述胚軸下端發(fā) 根； (d2)將經(jīng)步驟dl)生根培養(yǎng)后的所述抗性芽及胚軸進行培養(yǎng)至所述胚軸長出10-15cni 根系。
9. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟dl)中，將所述抗性芽及胚軸置于 含 0? 5-1. 5mg. L_1IBA(吲哚丁酸），50-150mg. L_1 替卡西林，30-80mg. L-1 卡那霉素的 1/4MS 基本培養(yǎng)基或1/4MSB5培養(yǎng)基中于14-18h/d光照，25 土 1°C條件下生根培養(yǎng)；和/或 所述步驟d2)中，將所述生根培養(yǎng)后的所述抗性芽及胚軸轉(zhuǎn)接到含0? 5-1. 5mg. L4IBA, 50_150mg. T1替卡西林,3〇-8〇mg. L_1卡那霉素的1/2MS基本培養(yǎng)基或1/2MSB5培養(yǎng)基中于 14_18h/d光照,25 ± I °C條件下培養(yǎng)。
10. -種轉(zhuǎn)基因大豆種子的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (i) 種植多個大豆轉(zhuǎn)基因株系至結莢，其間，進行葉片GUS染色、PCR檢測及Southern blot檢測； (ii) 取GUS染色、PCR檢測及Southern blot檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因株系，收獲并保存種 子，為TO代轉(zhuǎn)基因大豆種子；以及任選地， (iii) 種植所述TO代種子，苗期進行GUS染色、PCR檢測，收獲并保存結果均為陽性的 株系的種子，為Tl代轉(zhuǎn)基因大豆種子；以及任選地， (iv) 種植所述Tl代種子，苗期進行GUS染色、PCR檢測，收獲并保存結果均為陽性的株 系的種子，為T2代轉(zhuǎn)基因大豆種子， 其中，所述大豆轉(zhuǎn)基因株系來源于同一個由權利要求1所述的方法獲得的長出根系的 胚軸。
【文檔編號】A01H4/00GK104206269SQ201310222316
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2013年6月5日 優(yōu)先權日:2013年6月5日
【發(fā)明者】朱木蘭, 謝璐遙, 衛(wèi)志明 申請人:中國科學院上海生命科學研究院