專利名稱：一種轉基因香石竹Moonlite的品系特異性定性、定量PCR檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于轉基因植物檢測技術領域，具體涉及一種轉基因香石竹Moonlite的品系特異性定性、定量PCR檢測方法。
背景技術：
自從1994年第一個轉基因番茄FLAVR SAVR被美國農業(yè)部批準進行商業(yè)化生產種植以來，越來越多的轉基因植物已用于農業(yè)生產。轉基因植物的產業(yè)化，尤其是轉基因農作物的產業(yè)化可以減少農業(yè)對環(huán)境的影響，增加糧食產量，有助于解決全球糧食問題。據(jù)統(tǒng)計，1996年至2010年的15年期間，轉基因農作物種植總面積超過十億公頃。轉基因農作物的種植面積從1996年的1. 7萬公頃到2010年的148萬公頃，增長了 87倍。2010年，全世界種植轉基因農作物的國家數(shù)量達到四個，其中19個是發(fā)展中國家。隨著轉基因植物產業(yè)化水平不斷提高，其安全問題已經(jīng)引起國際社會和各國政府的廣泛關注，并成為國家之間環(huán)境保護、國際貿易等合作的敏感議題，致使轉基因產品的安全性問題由學術觀點分歧， 發(fā)展到環(huán)境問題、經(jīng)濟問題甚至政治問題。為了加強對轉基因植物的管理，世界各國紛紛制定了相應的法律法規(guī)。轉基因產品標識制度已成為國際公約。澳大利亞和新西蘭從2001 年7月開始對所有轉基因食物實施標識制度，閾值為每種成分的1%，即當某一種成分內的轉基因成分超過1%，則必須標識為轉基因食物。巴西、以色列等國也把轉基因成分閾值定為1%。韓國和日本分別為3%和5%。建立健全轉基因產品標識制度，轉基因產品的檢測技術是關鍵。目前世界上常用的轉基因檢測方法主要有兩種一種是基于核酸的檢測方法，一種是基于蛋白質的免疫學檢測方法。在轉基因植物及其加工產品的檢測過程中，以DNA檢測為基礎的核酸檢測方法已經(jīng)成為最主要、最適用的轉基因植物及其加工產品的檢測方法?；贒NA分子為基礎的轉基因產品檢測方法經(jīng)歷了四個發(fā)展階段，即(1)針對啟動子、終止子、標記基因的篩選檢測；O)目的基因特異性檢測；C3)基因構建特異性檢測；品系特異性(轉化事件)檢測。由于品系特異性檢測方法具有高度特異性，目前國際上對于轉基因產品檢測方法已逐步過渡到品系特異性基因片段的檢測方法。品系特異性檢測是通過分析外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列實現(xiàn)的。由于每一個轉基因植物品系，都具有特異的外源插入載體與植物基因組的連接區(qū)序列，并且連接區(qū)序列是單拷貝的，所以品系特異性檢測方法具有非常高的特異性和準確性?；谏鲜鰞?yōu)點，品系特異性檢測已經(jīng)成為目前轉基因檢測研究的重點，并將為國際檢測標準和國際各檢測實驗室所采用。許多國家已經(jīng)明確規(guī)定了轉基因標簽的閾值，定量PCR檢測已經(jīng)成為轉基因檢測的必須方法，該方法已經(jīng)為各國轉基因檢測實驗室廣泛使用。近年來，一些轉基因植物的品系特異性定性、定量PCR檢測方法已經(jīng)建立，例如，M0N863，Oxy-235, MIR 604，Topas 19/2，M0N15985 等。香石竹(康乃馨)是最重要的切花品種之一，其生產面積和銷售量居切花品種之首。隨著經(jīng)濟發(fā)展和社會進步，人們對花卉尤其是對改變色、香、形的新品種的需求不斷增加。澳大利亞Florigene公司和日本Suntory公司將二氫黃酮醇_4_還原酶基因(DFR)和類黃酮-3'，5'-羥基化酶基因(F3' 5' H)，通過農桿菌介導轉化花色為白色的香石竹品種FE123，經(jīng)篩選獲得花色呈藍紫色的轉基因香石竹Moonlite。目前Moonlite已經(jīng)在日本、澳大利亞、加拿大、美國、厄瓜多爾、哥倫比亞等國家通過了安全性評價，批準商品化種植。截止2008年，在美國、日本等國家銷售的Moonlite已超過一千五百萬支。目前日本Simtory公司正在申請將轉基因香石竹Moonlite進口到中國并進行銷售，因此研究開發(fā)準確、高效的轉基因香石竹Moonlite品系特異性檢測方法，已成為一項重要而緊迫的任務。目前國內科研單位尚未進行轉基因香石竹檢測技術的研究。為了保護知識產權，便于農業(yè)行政主管部門對轉基因香石竹的監(jiān)管，保護國家在世界貿易活動中的經(jīng)濟利益，有必要建立轉基因香石竹Moonlite品系特異性定性、定量PCR檢測方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種轉基因花色香石竹Moonlite的品系特異性定性、定量PCR檢測方法。本發(fā)明利用TAIL-PCR技術，測序分析了外源基因插入位點左邊界旁鄰序列，并設計特異性引物和探針序列，建立了適用于轉基因香石竹Moonlite的品系特異性定性、定量PCR檢測方法，并驗證該檢測方法的特異性和靈敏度。本發(fā)明的原理為根據(jù)已知表達載體左邊界序列，設計三條同向且退火溫度較高的特異性引物和退火溫度較低的隨機引物，進行TAIL-PCR反應，得到外源基因插入香石竹基因組DNA位點的旁鄰序列。據(jù)此設計特異性引物和探針，優(yōu)化PCR擴增條件，建立標準曲線，確定檢測的靈敏度，對混合樣品進行分析檢測，建立適合于轉基因香石竹Moonlite的品系特異性定性、定量PCR檢測方法。為了達到上述目的，本發(fā)明的技術方案如下利用 Primer Express software version 3. O(Applied Biosystems, Foster City，CA)設計特異性引物和熒光探針。特異性引物和探針的序列具體參見表1。引物和探針由上海英駿公司(Invitrogen Co.，Ltd，Shanghai)合成。采用ans基因作為香石竹的內標準基因。特異性引物LB 1R/2R/3R和隨機引物AD2用于TAIL-PCR擴增。LiteClF/lR用于品系特異性定性PCR擴增。LiteRlF/lR和探針Lite-Probe用于品系特異性定量PCR擴增。ANS-F 1/R1用于內標準基因ans定性PCR擴增。ANS-F2/R2和ANS-Probe用于內標準基因ans定量PCR擴增。GenomeClF/lR用于香石竹基因組DNA定性PCR擴增。表1.PCR體系所用的特異性引物和探針
權利要求
1.一種轉基因香石竹Moonlite的品系特異性定性、定量PCR檢測方法，包括以下步驟1)轉基因香石竹Moonlite基因組DNA的提?。?)轉基因香石竹Moonlite外源基因插入位點左邊界旁鄰序列的擴增和確認，其三條巢式引物LB 1R/2R/3R序列分別如SEQ ID No 1、SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示，隨機引物AD2序列如SEQ ID No 4所示，香石竹基因組定性PCR擴增引物對GenomeClF/lR序列如 SEQ ID No 9 和 SEQ ID No 10 所示；3)轉基因香石竹Moonlite的定性PCR檢測方法的建立和驗證，其Moonlite品系特異性定性引物對LiteClF/lR序列如SEQ ID No 7和SEQ IDNo 8所示，內標準基因ans特異性定性引物對ANS-F1/R1序列如SEQ ID No5和SEQ ID No 6所示；4)轉基因香石竹Moonlite定量PCR檢測方法的建立和驗證，其Moonlite品系特異性定量引物對LiteRlF/LiteRlR和探針Lite-Probe序列分別如SEQID No 13、SEQ ID No 14和SEQ ID No 16所示，內標準基因ans特異性定量引物對ANS-F2/ANS-R2序列和探針 ANS-Probe 序列如 SEQ ID No 11、SEQID No 12 和 SEQ ID No 15 所示。
2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述外源基因插入位點左邊界旁鄰序列的擴增利用TAIL-PCR方法。
3.根據(jù)權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述TAIL-PCR方法的擴增反應體系為第一輪擴增反應總體積 20 μ L，2 μ L 1\ 0 緩沖液，0.8“1^21111 dNTPs,0. 3μ L 10 μ M 所述特異性引物LBlR，4yL 10 μ M所述隨機引物AD2，0. 2 μ L 5U Taq DNA聚合酶，2 μ L Moonlite DNA，10. 7 μ L 雙蒸水；第二輪反應總體積 25 μ L，2. 5 μ L IXPCR 緩沖液，IyL 2mM dNTPs,0. 5μ L 10 μ M 所述特異性引物 LB2R，5 μ L 10 μ M 所述隨機引物 AD2，0. 16 μ L 5U Taq DNA聚合酶，14. 84 μ L雙蒸水和1 μ L 40倍稀釋的第一輪PCR產物；第三輪反應 總體積50yL，5yL IXPCR緩沖液，2 μ L 2mM dNTPs, 1 μ L 10 μ M所述特異性引物LB3R， 10 μ L ΙΟμΜ所述隨機引物AD2，0. 3μ L 5U Taq DNA聚合酶，30. 7 μ L雙蒸水和1 μ L 10倍稀釋的第二輪PCR產物。
4.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述定性PCR檢測方法的定性PCR反應體系為反應體系總體積25 μ L, 5 μ L Moonlite DNA, 2. 5 μ LlXPCR緩沖液，2. 5 μ L 2mM dNTPs, 12. 7 μ L雙蒸水，10 μ M所述Moonlite品系特異性定性引物對LiteClF/lR或所述內標準基因ans特異性定性引物對ANS-F1/R1各1 μ L和0. 3 μ L 5U Taq DNA聚合酶；反應程序-MV，5min ；94°C，30s, 58°C，30s, 72°C，30s, 35 循環(huán)；72°C，7min。
5.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述定量PCR檢測方法的PCR反應條件為反應體系總體積 25 μ L，2. 5 μ L 1 XPCR緩沖液，2. 5 μ L2mM dNTPs, 5 μ L 25mM MgCl2, 10μM所述M00nlite品系特異性定量引物對LiteRlF/LiteRlR或所述內標準基因ans特異性定量引物對ANS-F2/ANS-R2各0· 5 μ L，0· 5 μ L 10 μ M所述探針Lite-Probe或所述探針 ANS-Probe，0. 3μ L 5U Taq DNA 聚合酶，5 μ L Moonlite DNA 和 8. 2 μ L 雙蒸水；反應程序: 50°C，2min ；95°C, IOmin ；95°C，15s，60°C，45s，45 循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉基因香石竹Moonlite的品系特異性定性、定量PCR檢測方法，包括以下步驟1)轉基因香石竹Moonlite基因組DNA的提??；2)轉基因香石竹Moonlite外源基因插入位點左邊界旁鄰序列的擴增和確認；3)轉基因香石竹Moonlite定性PCR檢測方法的建立和驗證；4)轉基因香石竹Moonlite定量PCR檢測方法的建立和驗證。本發(fā)明成功建立了適用于轉基因香石竹Moonlite的品系特異性定性、定量PCR檢測方法，并驗證該檢測方法的特異性和靈敏度，為轉基因香石竹的進口檢測、監(jiān)管及環(huán)境安全評價提供依據(jù)。
文檔編號C12Q1/68GK102286624SQ201110247859
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月26日 優(yōu)先權日2011年8月26日
發(fā)明者唐雪明, 朱宏, 李鵬, 潘愛虎, 王金斌, 白藍, 蔣玲曦, 賈軍偉 申請人:上海市農業(yè)科學院