專利名稱：一種高效標(biāo)記斑馬魚pgc的載體及轉(zhuǎn)基因魚的制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于魚類生物工程技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種高效標(biāo)記斑馬魚PGC的載體，還涉及一種高效標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚的制備方法，還涉及該轉(zhuǎn)基因斑馬魚在魚類生物工程技術(shù)的用途。
背景技術(shù)：
作為遺傳物質(zhì)的傳遞者，魚類原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cell，PGC)因其具有全能性已成為了魚類生物工程技術(shù)的嶄新的工具(Yoshizaki，G.,Takeuchi’Y-and Okutsu, T.(2007).^Germ cell in fish:basic biology and biotechnologicalapplications.^Tanpakushitsu Kakusan Koso52, 2067-2072.)。然而，缺乏良好的標(biāo)記系統(tǒng)仍然是原始生殖細(xì)胞操作的一大障礙。因此，有必要將目前的分子遺傳學(xué)技術(shù)運用到原始生殖細(xì)胞中，以便更好的分析生殖細(xì)胞發(fā)育過程中的分子機制和對其進(jìn)行遺傳操作。目前已經(jīng)有一些研究報道建立了觀察原始生殖細(xì)胞的方法，例如通過早期注射nosl3’ UTR調(diào)控?zé)晒獾鞍妆磉_(dá)的mRNA可以快速簡便地標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞(Koprunner, M., Thisse, C., Thisse, B.and Raz, Ε.(2001).〃A zebrafish nanos-relatedgene is essential fo r the development of primordial germ cells."GenesDevl5, 2877-2885.)，但是利用這種方法熒光蛋白在發(fā)育早期并沒有非常特異地在原始生殖細(xì)胞中表達(dá)，而且也不適用于在發(fā)育晚期觀察原始生殖細(xì)胞。同時，研究者們也利用原始生殖細(xì)胞的marker基因vasa的啟動子和3’ UTR驅(qū)使的GFP表達(dá)構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因品
vas::EGFP(^Expression of a vas::EGFP transgen e in primordial germ cellsof the zebraf ish.^Mech Devl 16, 141-150 ; Fan, L., Moon, J., Wong, T.T., Crodi an, J.and Collodi, P.(2008)^ Zebrafish primordial germ cell cultures der ived fromvasa::RFP transgenic embryos."Stem Cells Devl7, 585-597.)。在 vas::EGFP 品系胚胎中，母源的vas::EGFP mRNA和VAS::EGFP蛋白在體節(jié)后主要在原始生殖細(xì)胞中聚集，且到受精后13天仍能能在原始生殖細(xì)胞中持續(xù)觀察到GFP。利用該品系胚胎，F(xiàn)an等(Fan, L., Moon, J., Wong, T.T., Crodian, J.and Collodi, P.(2008) ^Zebrafish primordialgerm cell cultures derived from vasa::RFP transgenic embryos.〃Stem CellsDevl7, 585-597)用流式細(xì)胞儀分離出熒光標(biāo)記的斑馬魚體節(jié)期原始生殖細(xì)胞進(jìn)行了體外培養(yǎng)。然而，在體節(jié)以前，母源表達(dá)熒光蛋白VAS::EGFP蛋白分布于整個卵裂球，并不特異于原始生殖細(xì)胞中(Kr ovel, A.V.and Olsen, L.C.(2002) "Expression of a vas::EGFPtransgene in primordial ger m cells of the zebrafish.〃Mech Devll6.141-150)。為了避免母源效應(yīng)，vas::EGFP雄魚與野生型雌魚的雜交后代是從14-126天才開始表達(dá)EGFP,無法特異觀察到早期原始生殖細(xì)胞(Wang, X.G., Bartfai, R., Sleptsova-Freidrich, 1.and Orban, L.(2007)〃The timing and extent of' juvenile ovary' phase arehighly variable during zebrafish testis differentiation.".Tournal of FishBiolog1TO, 33-44.)，所以利用vas::EGFP轉(zhuǎn)基因品系并不利于胚胎發(fā)育早期操作原始生殖細(xì)胞。為了能在發(fā)育早期觀察原始生殖細(xì)胞的遷移和分化，Blaser等人利用kop啟動子和nosl3’ UTR構(gòu)建了 Tg(kop:EGFP)品系能夠在發(fā)育早期特異地在原始生殖細(xì)胞中表達(dá)EGFP (Blaser, H., Eisenbeiss, S., Neumann, M., Reichman-Fried, Μ., Thisse, B., Thi sse, C.and Raz, E.(2005)"Transition from non-motiIe behaviour to directed migrationduri ng early PGC development in zebraf ish.Cell Sci 118, 4027-4038)。由于kop啟動子的母源表達(dá)效應(yīng)和nosl3’ UTR的定位作用，Tg(kop:EGFP)自交胚胎中EGFPmRNA從受精卵開始就定位于生殖質(zhì)和原始生殖細(xì)胞中，從而可以利用Tg(kop:EGFP)從發(fā)育早期追蹤觀察原始生殖細(xì)胞的遷移和分化過程。然而由于母源性啟動子kop表達(dá)的EGFP-UTRnoslmRN A的含量不高，導(dǎo)致EGFP的熒光強度非常弱，對觀察原始生殖細(xì)胞的發(fā)育帶來不便。Gal4/UAS系統(tǒng)在很多生物的特異組織中都具有轉(zhuǎn)錄放大作用(Halpern，Μ.Ε., Rhee, J., Gol I, Μ.G., Akitake, C.Μ., Parsons, Μ.and Leach, S.D.(2008) "Gal4/UAStransgenic tool s and their application to zebrafish.〃Zebrafish5, 97-110.)。利用Gal4/UAS系統(tǒng)控制基因表達(dá)的策略是首先利用組織特異性的啟動子或增強子，將Gal4基因與啟動子或增強子相連接，建立Gal4轉(zhuǎn)基因系，通過這種啟動子以細(xì)胞和組織特異性的方式來控制Gal4的表達(dá)。同時建立Gal4識別序列UAS (Upstream ActivationSequence)與靶基因相融合的轉(zhuǎn)基因系。U AS-靶基因系中靶基因處于轉(zhuǎn)錄沉默狀態(tài)，只有將Gal4轉(zhuǎn)基因系與UAS-靶基因系進(jìn)行雜交，才可能產(chǎn)生在特異組織中表達(dá)靶基因的后代(Traven, A., Jelicic, B.and Sopta, Μ.(2006)^Yeast Gal4:a transcriptionalparadigm revisited."ΕΜΒ0 Rep7,496-499;Scheer, N.and Campos-Ortega, J.A.(1999)〃Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression i n thezebrafish."Mech Dev80.153-158)。近期，研究者們利用Gal4/UAS系統(tǒng)用于斑馬魚的啟動子捕獲研究，建立了能一些在斑馬魚組織中特異誘導(dǎo)表達(dá)熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因品系(Da vison, J.M., Akitake, C.Μ., Goll, M.G., Rhee, J.Μ., Gosse, N., Baier, H., Halpern, Μ.Ε., Leach, S.D.and Parsons, Μ.J.(2007)^Transactivation from Gal4_VP16transgenicinsertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish."DevBiol304, 811-824;Asaka wa, K., Suster, M.L., Mizusawa, K., Nagayoshi, S., Kotani, T.,Urasaki,A.,Kishimoto, Y., Hibi, M.and Kawakami, K.(2008)"Genetic dissection ofneural circuits by Tol2transpo son-mediated Gal4gene and enhancer trapping inzebrafish."Proc Natl Acad Sci U S A105, 1255-1260)。然而目前為止，仍沒能構(gòu)建出能在斑馬魚原始生殖細(xì)胞中特異表達(dá)Gal4的轉(zhuǎn)基因品系。同時，考慮到該系統(tǒng)的激活效率和細(xì)胞毒性，Distel等人將Gal4蛋白的DN A結(jié)合域與優(yōu)化的單純皰疹病毒蛋白VP16轉(zhuǎn)錄激活域TA4相融，同時連接上kozak翻譯增強序列改造成的KalTA4蛋白，與4xUAS搭配使用可以有效的減少Gal4/UAS系統(tǒng)的細(xì)胞毒性和提高誘導(dǎo)激活效率(Distel，Μ.，ffullimann, Μ.F.and Koster, R.ff.(2009)"Optimized G al4genetics for permanent gen e expressionmapping in zebrafish.〃Proc Natl Acad Sci U S A.106.13365—13370)。因此，我們基于Gal4/UAS系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄放大作用，以mRFP作為報告基因，嘗試在斑馬魚原始生殖細(xì)胞中特異高效誘導(dǎo)mRFP表達(dá)。首先，在斑馬魚中建立激活轉(zhuǎn)基因品系Tg(kop:KalTA4)。在這個轉(zhuǎn)基因品系中，KalTA4轉(zhuǎn)錄激活因子特異的在原始生殖細(xì)胞中表達(dá)；其次建立效應(yīng)轉(zhuǎn)基因品系Tg (UAS: mRFP)。在這個品系中，mRFP是沉默的。當(dāng)將Tg(kop:KalTA4)品系的雌魚與Tg(UASimRFP)的雄魚雜交后，KalTA4轉(zhuǎn)錄激活因子就能在雜交胚胎原始生殖細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)mRFP，從而特異,高效標(biāo)記原始生殖細(xì)胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種高效標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞的載體:pTol2(kop:KalTA4-UTRnosl, CMV:EGFP-SV40)，其序列為 SEQ ID N0.1 所示和 pTol2 (UAS:mRFP-UTRnosl，CMV:EGFP-SV40)，其序列為SEQ ID N0.2所示。將這兩個載體分別導(dǎo)入到斑馬魚中，Tg(kop:KalTA4)品系的雌魚與Tg(UAS:mRFP)的雄魚雜交后，KalTA4轉(zhuǎn)錄激活因子就能在雜交胚胎原始生殖細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)mRFP,從而特異、高效標(biāo)記原始生殖細(xì)胞。本發(fā)明還有一個目的在于提供一種高效標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚的制備方法。該方法是基于誘導(dǎo)系統(tǒng)Gal4/UAS系統(tǒng)構(gòu)建的，包含2套轉(zhuǎn)基因品系:在原始生殖細(xì)胞中特異地表達(dá)KalTA4轉(zhuǎn)錄激活因子的激活轉(zhuǎn)基因品系Tg(kop:KalTA4) ；mRFP表達(dá)沉默的效應(yīng)轉(zhuǎn)基因品系Tg (UAS:mRFP)。將Tg (kop: KalTA4)品系的雌魚與Tg (UAS:mRFP)的雄魚雜交后，KalTA4轉(zhuǎn)錄激活因子就能在雜交胚胎原始生殖細(xì)胞中特異，高效表達(dá)mRFP以標(biāo)記原始生殖細(xì)胞。本發(fā)明的最后一個目的是在于提供了這種高效標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚的用途。首先，本發(fā)明利用Gal4/UAS轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)，以mRFP作為報告基因，實現(xiàn)了在斑馬魚原始生殖細(xì)胞中特異高效誘導(dǎo)基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)。其次，利用Tg(kop:KalTA4)品系的轉(zhuǎn)錄放大功能在原始生殖細(xì)胞中高表達(dá)熒光蛋白，從而為研究體內(nèi)觀察，追蹤原始生殖細(xì)胞發(fā)育提供了一個有力的平臺，更重要的是，可以通過特異高效表達(dá)熒光蛋白分離出更早期的原始生殖細(xì)胞進(jìn)行遺傳操作。最后，利用Tg(kop:KalTA4)品系，可以通過注射質(zhì)粒的方法特異、高效、持續(xù)地標(biāo)記原始生殖細(xì)胞。如果將包含表達(dá)框UAS:mRFP-UTRnosI的質(zhì)粒作為構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體的基本骨架，并將轉(zhuǎn)基因注射到Tg(kop:KalTA4)品系胚胎中，挑出能在原始生殖細(xì)胞中表達(dá)mRFP的 胚胎培養(yǎng)，即在轉(zhuǎn)基因魚發(fā)育早期高效、快速篩選原始生殖細(xì)胞整合有外源基因的轉(zhuǎn)基因胚胎。從而大大提聞轉(zhuǎn)植基因在轉(zhuǎn)基因魚中的生殖傳遞效率，減少轉(zhuǎn)基因魚的篩選工作量。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)措施:本發(fā)明的思路是:激活轉(zhuǎn)基因品系Tg(kop:KalTA4)的轉(zhuǎn)基因載體有2個串聯(lián)表達(dá)框:一個是由 kop 啟動子(Blaser, H., Eisenbeiss, S., Neumann, M., Reichman-Fried,Μ.,Thisse, B.,Thisse, C.and Raz, E.(2005)"Transition from non-motiIe behaviourto directed migration during early PGC development in zebrafish.".T CellSci118,4027-4038)和 nosl3，UTR(Koprunner, M.，Thisse, C.，Thisse, B.and Raz, E.(2001)〃A zebrafish nanos-related gene is essential for the development ofprimordial germ cells."Genes Dev.15.2877-2885.)調(diào)控的 KalTA4 表達(dá)框，它們能指導(dǎo)KalTA4在原始生殖細(xì)胞中的特異表達(dá)，使用的KalTA4蛋白是酵母Gal4蛋白的DNA結(jié)合域與優(yōu)化的單純皰疹病毒蛋白VP16轉(zhuǎn)錄激活域TA4相融合的編碼蛋白，同時在KalTA4序列5’端添加的Kozak序列增加KalTA4蛋白的翻譯效率，經(jīng)優(yōu)化后KalTA4蛋白的誘導(dǎo)水平高且細(xì)胞毒性小。另一個是CMV啟動和SV40poly (A)調(diào)控的EGFP的報告基因表達(dá)框，便于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因品系的篩選。效應(yīng)轉(zhuǎn)基因品系Tg(UAS:mRF P)的轉(zhuǎn)基因載體也包含了 2個串聯(lián)表達(dá)框:一個是由UAS和nos 13 ’ UTR調(diào)控的mRFP表達(dá)框，另一個是CMV啟動子和SV40poly (A)調(diào)控的EGFP的報告基因表達(dá)框,便于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因品系的篩選。一種高效標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚的制備方法，其步驟是:(I)設(shè)計基于Gal4/UAS系統(tǒng)利用mRFP標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因品系。策略圖見圖1所示:激活品系Tg(kop:KalTA4)可以在斑馬魚原始生殖細(xì)胞中特異表達(dá)KalTA4轉(zhuǎn)錄因子；效應(yīng)品系Tg (UAS:mRFP)中mRFP因受UAS和nosl3’UTR調(diào)控表達(dá)而處于沉默的狀態(tài)。如果將Tg(kop:KalTA4)品系的雌魚與Tg(UAS:mRFP)的雄魚雜交，雜交胚胎原始生殖細(xì)胞中特異表達(dá)的KalTA4轉(zhuǎn)錄激活因子就能在原始生殖細(xì)胞中特異高效誘導(dǎo)表達(dá) mRFP。(2) 構(gòu)建激活品系Tg(kop:KalTA4)的轉(zhuǎn)基因載體pTol2(kop:KalTA4-UTRnosl, CMV:EGF P-SV40)，其序列為 SEQ ID N0.1 所示。(3)構(gòu)建效應(yīng)品系 Tg(UAS:mRFP)的轉(zhuǎn)基因載體 pTol2 (UAS:mRFP_UTRnosl，CMV:EGFP -SV40)，其序列為 SEQ ID N0.2 所示。(4)顯微注射。(5)Tg(kop:KalTA4)與 Tg(UAS:mRFP)轉(zhuǎn)基因品系的篩選。(6)Tg(kop:KalTA4)雌魚與Tg (UAS:mRFP)雄魚雜交獲得特異、高效標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚Tg(kop:KalTA4，UASimRFP)。一種高效標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚的用途，其步驟是:(I)激活品系Tg(kop:KalTA4)胚胎中KalTA4mRNA特異地在原始生殖細(xì)胞中表達(dá)。I).KalTA4 探針制備。A.模板的制備和純化。以質(zhì)粒pTol2(kop:KalTA4-UTRnosl, CMV:EGFP-SV40)為模板，Probe-KalTA4_F 和T3-nosl3 ‘UTR-R (帶T3啟動子序列)為引物，PCR擴增出模板DNA，參照Axygen公司的PCRclean up試劑盒回收PCR產(chǎn)物，以其作為合成探針的探針。B.探針合成和回收。參照Promega的T3RNA聚合酶說明書轉(zhuǎn)錄合成RNA探針，并參照sigma spinpost-reaction chean-up columns 說明書回收探針。2).原位雜交檢測檢測激活品系Tg(kop:KalTA4)胚胎中KalTA4mRNA的表達(dá)。收集的4cell (a), shield (b),體節(jié)(c)及 Iday post-fertilization (dpf) (d)時期Tg(kop:KalT A4)品系早期胚胎，然后用KalTA4探針進(jìn)行原位雜交檢測(常規(guī)方法，Thisse, B., Heyer, V., Lux, A., Alunni, V., Degrave, A., Seiliez, 1., Kirchner, J., Parkhi 11, J.P.and Thisse, C.(2004)〃Spatial and temporal expression of the zebrafish genomeby large-scale in situ hy bridization screening.^Methods Cell Biol77, 505-519.)。原位雜交結(jié)果顯示在胚胎早期發(fā)育KalTA4mRNA特異地在原始生殖細(xì)胞中表達(dá):在二、四細(xì)胞期，母源性的KalTA4mRNA定位于分裂溝的邊緣；在原腸過程中，KalTA4mR NA呈4簇在胚盤的邊緣進(jìn) 行遷移。體節(jié)期，KalTA4mRNA聚集成2簇左右對稱分布于3_5體節(jié)處。發(fā)育至Idpf時，KalTA4mRNA呈左右對稱全部遷移至背部的腸系膜處。
(2)過表達(dá)外源質(zhì)粒誘導(dǎo)mRFP在原始生殖細(xì)胞中表達(dá)。在Tg(kop:KalTA4)品系胚胎I細(xì)胞期注射25ng/ylpTo 12 (UASimRFP-UTRnos I, CMV:E GFP-SV40)質(zhì)粒，觀察胚胎中的熒光表達(dá)。結(jié)果顯示在體節(jié)早期，可以在原始生殖細(xì)胞中觀察到非常特異地高表達(dá)的mRFP。隨著發(fā)育的進(jìn)行，在Idpf到9dpf，部分胚胎原始生殖細(xì)胞中仍能持續(xù)特異地高表達(dá)mRFP。這些結(jié)果表明利用Gal4/UAS系統(tǒng)，通過注射質(zhì)粒的方法特異、高效、持續(xù)地標(biāo)記原始生殖細(xì)胞。(3) mRFP mRNA 在 Tg(kop:KalTA4)雌魚與 Tg(UAS:mRFP)雄魚雜交胚胎的原始生殖細(xì)胞中特異表達(dá)。分別收集4cell期，shield時期，體節(jié)早期和Idpf時期的Tg(kop:KalTA4)雌魚與Tg(UAS:mRFP)雄魚的雜交胚胎，用vasa和mRFP探針進(jìn)行原位雜交。原位雜交的結(jié)果顯示出Gal4/UAS系統(tǒng)胚胎中mRFP mRNA的表達(dá)模式與生殖細(xì)胞的標(biāo)志基因vasa的表達(dá)模式相似。表明Tg(kop:KalTA4)雌魚與Tg(UAS:mRFP)雄魚的雜交胚胎中的mRFP都非常特異地表達(dá)于原始生殖細(xì)胞中。(4) Tg(kop:KalTA4)雌魚與Tg(UAS:mRFP)雄魚雜交胚胎的原始生殖細(xì)胞中增強表達(dá) mRFP mRNA。參照Invitrogen公司的TRIzol試劑盒提取胚胎總RNA,然后參見Invitrogen的反轉(zhuǎn)錄酶Superscript II說明書用Oligo (dT)合成cDNA的合成。參照Τ0Υ0Β0公司的SYBR Green Mix 說明書在 Applied Biosystems7900 儀器上進(jìn)行 Real-Time PCR 后。然后運用Applied biosystems的SDS2.4軟件分析數(shù)據(jù)，以β-actin基因的表達(dá)做內(nèi)參,用2 —ΔΔ CT方法分析出EGFP和mRFP的相對表達(dá)量(常規(guī)方法，Livak, K.J.and Schmittgen, T.D.(2001)"Analysis of relative gene expression data using real-time quantitativePCR and the2(-Delta Delta C(T))."Method.Methods25,402-408.)。結(jié)果顯示，Tg(ko p:KalTA4,UAS:mRFP)中的mRFP mRNA 的表達(dá)水平是Tg(kop:EGFP)自交胚胎中EGFP mRNA表達(dá)水平的300倍(P〈0.001)。表明Gal4 / UAS系統(tǒng)不僅能特異地在原始生殖細(xì)胞中誘導(dǎo)激活目的基因表達(dá)，更能高效地增強目的基因在原始生殖細(xì)胞中表達(dá)。(5) Tg(kop:KalTA4)雌魚與Tg(UAS:mRFP)雄魚雜交胚胎的原始生殖細(xì)胞中特異高效表達(dá)m RFP。之前，Blaser等人構(gòu)建的Tg(kop:EGFP)品系在發(fā)育早期能夠用EGFP可以特異地標(biāo)記原始生殖細(xì)胞。他們在共聚焦顯微鏡下通過觀察EGFP追蹤原始生殖細(xì)胞，并描繪出發(fā)育早期原始生殖細(xì)胞遷移過程中的細(xì)胞形態(tài)特征和調(diào)控原始生殖細(xì)胞遷移的分子機制(Blaser et al.，2005)。首先，我們觀察了表達(dá)載體kop:EGFP-UTRnosl構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因品系Tg(kop:EGF P)胚胎中EGFP表達(dá)模式。在我們實驗室的熒光顯微鏡下，這些品系胚胎能在體節(jié)早期觀察到原始生殖細(xì)胞特異的EGFP，但是熒光只能持續(xù)3天。而且EGFP的熒光強度非常弱，對觀察原始生殖細(xì)胞的發(fā)育帶來不便。然后，將Tg(kop:KalTA4)品系的雌魚與Tg(UAS:mRFP)品系的雄魚雜交，觀察雜交胚胎 Tg (kop: KalTA4, UAS:mRFP)中的 mRFP 的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，在相同的顯微鏡下，Tg(kop:KalTA4)品系的雌魚與Tg(UAS:mRFP)品系的雄魚雜交胚胎原始生殖細(xì)胞中高表達(dá)mRFP:shield時期可以觀察到有微弱的mRFP，隨著外包的進(jìn)行熒光強度逐漸增加；胚胎發(fā)育至I天時，可以在原始生殖細(xì)胞處觀察非常強的mR FP，并且熒光持續(xù)在原始生殖細(xì)胞中高表達(dá)；隨后，在18dpf時，我們觀察mRFP的表達(dá)在不同的魚苗中發(fā)生了變化。部分胚胎的整個性腺組織中幾乎都能觀察到明亮的熒光，而其余的胚胎的性腺中僅少量的熒光表達(dá)；在25dpf時，仍能在部分的魚苗中檢測到少量的mRFP ;到了 30dpf，幾乎所有魚苗都不能在性腺中觀察到mRFP。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點:(I)本發(fā)明所述方法，構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因品系Tg(kop:KalTA4)和轉(zhuǎn)基因品系Tg(UASimRFP) 當(dāng)將 Tg(kop:KalTA4)品系的雌魚與 Tg(UAS:mRFP)的雄魚雜交后，KalTA4轉(zhuǎn)錄激活因子就能在雜交胚胎原始生殖細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)mRFP，從而特異、高效標(biāo)記原始生殖細(xì)胞。(2)本發(fā)明利用Gal4/UAS轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)，以mRFP作為報告基因，實現(xiàn)斑馬魚原始生殖細(xì)胞中誘導(dǎo)基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)?？梢岳肨g(kop:KalTA4)品系的轉(zhuǎn)錄放大功能在原始生殖細(xì)胞中高表達(dá)熒光蛋白，從而為研究體內(nèi)觀察，追逐原始生殖細(xì)胞發(fā)育提供了一個有力的平臺。更重要的是，可以通過特異高效表達(dá)的熒光蛋白分離出更早期的原始生殖細(xì)胞進(jìn)行遺傳操作和研究。(3)利用Tg(kop:KalTA4)品系,可以通過注射質(zhì)粒的方法特異、高效、持續(xù)地標(biāo)記原始生殖細(xì)胞。如果將包含表達(dá)框UAS:mRFP-UTRn0sl的質(zhì)粒作為構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體的基本骨架，并將轉(zhuǎn)基因注射到Tg(kop:KalTA4)品系胚胎中，挑出能在原始生殖細(xì)胞中表達(dá)mRFP的胚胎培養(yǎng)，即在轉(zhuǎn)基因魚發(fā)育早期高效、快速篩選原始生殖細(xì)胞整合有外源基因的轉(zhuǎn)基因胚胎。從而大大提聞轉(zhuǎn)植基因在轉(zhuǎn)基因魚中的生殖傳遞效率，減少轉(zhuǎn)基因魚的篩選工作量。


圖1為一種基于Gal 4/UAS系統(tǒng)標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞的策略示意圖。a:Tg(kop:KalTA4)品系載體示意圖；b:Tg(UAS:mRFP)品系載體示意圖；c:Tg(kop:Kal TA4)雌魚與Tg(UAS:mRFP)雄魚雜交后，原始生殖細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子KalTA4 激活 UAS 表達(dá) mRFP。圖2為一種構(gòu)建的Tg(kop:KalTA4)品系與Tg (UAS:mRFP)品系示意圖。a,b:構(gòu)建的Tg(kop:KalTA4)品系與Tg(UAS:mRFP)品系泛表達(dá)EGFP的熒光圖。圖3為一種Tg(kop:KalTA4)品系早期胚胎中的KalTA4mRNA表達(dá)模式示意圖。收集的4cell(a), shield(b),體節(jié)(c)及 ldpf(d)時期 Tg(kop:KalTA4)品系早期胚胎用KalTA4探針檢測。圖4 為在 Tg(kop:KalTA4)胚胎中直接注射質(zhì)粒 pTol2 (UAS:mRFP_UTRnosl，CMV:EGFP-S V40)就可以特異，高效，持續(xù)的標(biāo)記原始生殖細(xì)胞。pTol2 (UAS:mRFP-UTRnosl, CMV:EGFP_SV40)質(zhì)粒簡寫為 UAS:mRFP_UTRnosl。從體節(jié)期(a), I天(b), 3天(c)到9天(d)時mRFP都特異地在原始生殖細(xì)胞中高表達(dá)。圖5為一種原位雜交檢測Tg(kop:KalTA4)雌魚與Tg(UAS:mRFP)雄魚雜交胚胎中mRFP mR NA的時空表達(dá)模式示意圖。野生型斑馬魚胚胎中原始生殖細(xì)胞的特異marker基因vasa的表達(dá)模式(a_e)和Tg(kop:K alTA4)雌魚與Tg(UAS:mRFP)雄魚雜交胚胎中mRFP mRNA的表達(dá)模式(f-j)。分別收集 4 細(xì)胞期時(a，f，k), sphere 時期(b, g, I), shield 時期(c，h，m),體節(jié)期(d, i, η)和Idpf (e, j, ο)的胚胎分別用vasa和mRFP探針檢測。圖6 為 Real-Time PCR 檢測 Tg(kop:KalTA4)雌魚與 Tg (UAS:mRFP)雄魚的雜交胚胎中mRFP mRNA表達(dá)水平相對于Tg(kop:EGFP)自交胚胎中EGFP mRNA表達(dá)水平示意圖。圖7為一種Tg(kop:KalTA4)雌魚與Tg(UAS:mRFP)雄魚雜交胚胎中熒光表達(dá)示意圖。(a-d)Tg(kop:EGFP)品系胚胎中從體節(jié)早期(a), Idpf (b), 3dpf (C)持續(xù)表達(dá)微弱的 EGF P，但是在 9dpf 不能觀察到 EGFP(d)。(e_l)Tg(kop:KalTA4)雌魚與 Tg(UAS:mRFP)雄魚雜交胚胎中mRFP的表達(dá)。從s h i e I d時期能夠觀察到原始生殖細(xì)胞中特異表達(dá)mRFP(e，e，)。從Idpf (f, f’ ),3dpf(g，g，)到9dpf(h，h’)，都能在原始生殖細(xì)胞中持續(xù)觀察到明亮的mRFP。在18dpf時，mRFP的表達(dá)在不同的魚苗中發(fā)生了變化。少數(shù)胚胎的整個性腺組織中幾乎都能觀察到明亮的熒光(i，i’)，大部分胚胎的性腺中僅少量的熒光表達(dá)(j，j’ );在25(^^時，仍能在部分的魚苗中檢測到少量的mRFP(k，k’ );到了 30dpf，幾乎所有魚苗都不能在性腺中觀察到mRFP(l，I’)。
具體實施例方式本發(fā)明實施例中的方法未經(jīng)特別說明，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)方法，具體可參考《分子克隆實驗指南》(第二版，J.薩姆布魯克等著，科學(xué)出版社，1993)。本發(fā)明中所用的生物試劑如未經(jīng)特別說明，均來源于Fermantas公司。實施例1:一種高效標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚的制備方法，其步驟是:·
1.制備基于Gal4/UAS系統(tǒng)利用mRFP標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因品系，策略圖見圖1所示。然后設(shè)計擴增轉(zhuǎn)基因載體中各個片段所需要的引物。引物序列如下表所示:
權(quán)利要求
1.一種高效標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞的載體，其特征在于，轉(zhuǎn)基因載體pTo12 (kop: KaITA4-UTRnos I, CMV:EGFP_SV40)，其序列為 SEQ ID N0.1 所示。
2.一種高效標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞的載體，其特征在于:轉(zhuǎn)基因載體pTol2 (UAS:mRFP-UTRnosl, CMV:EGFP_SV40)，其序列為 SEQ ID N0.2 所示。
3.一種高效標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚的制備方法，其步驟是: (.DTg(kop:Kal7 必轉(zhuǎn)基因品系的制備 通過顯微注射儀和顯微注射法將含轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入斑馬魚受精卵中，轉(zhuǎn)基因魚性成熟后，與野生型的雌魚雜交，將雜交胚胎培養(yǎng)于28°C培養(yǎng)24hr，在熒光解剖鏡下篩選出發(fā)出綠色熒光的胚胎繼續(xù)培養(yǎng)，建立純系Tg(kop:KeilTA4)； 所述的轉(zhuǎn)基因載體 pTol2(kop:KalTA4-UTRnosl, CMV:EGFP_SV40)其序列為 SEQ IDN0.1所示； (2)Tg(UAS:mRFP)轉(zhuǎn)基因品系的制備 通過顯微注射儀和顯微注射法將轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入斑馬魚受精卵中，轉(zhuǎn)基因魚性成熟后，與野生型的雌魚雜交，將雜交胚胎培養(yǎng)于28° C培養(yǎng)24hr，在熒光解剖鏡下篩選出能發(fā)出綠色熒光的胚胎繼續(xù)培養(yǎng)，建立純系Tg(UAS:mRFP)； 所述的轉(zhuǎn)基因載體pTol2(UAS:mRFP-UTRnosl, CMV:EGFP_SV40)其序列為 SEQ ID N0.2所示； ⑶Tg(kop:KalTA4)雌魚與雄魚雜交 將構(gòu)建的純合子 漢印..心77 必雌魚與雄魚雜交，獲得一種特異高效標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚Tg(kop:KalTA4，UAS:mRFP)。
4.一種權(quán)利要求3所述的高效 標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚的制備方法所制備的轉(zhuǎn)基因魚在魚類生物工程中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效標(biāo)記斑馬魚PGC的載體及轉(zhuǎn)基因魚的制備方法和用途。利用Gal4/UAS轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)，以mRFP作為報告基因，實現(xiàn)斑馬魚原始生殖細(xì)胞中誘導(dǎo)基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)。首先分別構(gòu)建激活轉(zhuǎn)基因品系Tg(kop:KalTA4)和效應(yīng)轉(zhuǎn)基因品系Tg(UAS:mRFP)。然后將Tg(kop:KalTA4)雌魚與Tg(UAS:mRFP)雄魚雜交就能獲得高效標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚。這種高效標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚在魚類生物工程具有廣泛應(yīng)用。
文檔編號A01K67/027GK103224955SQ20131016918
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月9日
發(fā)明者孫永華, 熊鳳, 魏志強, 朱作言 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所