專利名稱：一種采集牛肝菌孢子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及菌根性食用菌菌種采集和保存的方法，具體地說，本發(fā)明涉及一種牛肝菌孢子的采集方法和保存方法。
背景技術(shù)：
牛肝菌屬于擔(dān)子菌亞門傘菌目中的牛肝菌科(Boletaceae)，除少數(shù)品種有毒或味苦而不能食用外，大部分品種均可食用。主要有白、黃、黑牛肝菌。白牛肝菌味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富。該菌菌體較大，肉肥厚，柄粗壯，食味香甜可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種世界性著名食用菌。云南省各族群眾喜愛采集鮮菌烹調(diào)食用。西歐各國(guó)也有廣泛食用白牛肝菌的習(xí)慣，除新鮮的作菜外，大部分切片干燥，加工成各種小包裝，用來配制湯料或做成醬油浸膏，也有制成鹽腌品食用。 其中，點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌(Suillus granulatus (L.:Fr.) 0.Kuntce)屬于粘蓋牛肝菌屬，于夏秋季松林及混交林地上散生、群生或叢生。河北、黑龍江、吉林、遼寧、山東、江蘇、安徽、浙江、香港、臺(tái)灣、河南、廣東、廣西、貴州、四川、云南、陜西、甘肅、西藏、福建等均有發(fā)生。點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌可食用，味較好。東北地區(qū)曾大量加工出口或以干品的形式在市場(chǎng)銷售。據(jù)報(bào)道，點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌具有抗癌作用。對(duì)小白鼠肉瘤的抑制率為80%，對(duì)艾氏癌的抑制率為70%。主要與油松形成外生菌根，是油松林地的優(yōu)勢(shì)菌根性食用菌。目前點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌還不能人工栽培。為了馴化栽培點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌，需要尋找適合人工栽培的菌種并提供適合的栽培條件。在馴化栽培過程中，孢子的采集、保存以及菌絲的培養(yǎng)是基礎(chǔ)。如何獲得大量純凈的孢子是馴化的首要關(guān)鍵步驟。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述的問題，發(fā)明人對(duì)點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌的生物學(xué)習(xí)性進(jìn)行了多年持續(xù)的調(diào)查、采集和試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在常溫條件下只能得到極少量的孢子，本發(fā)明人偶然發(fā)現(xiàn)在低溫條件下能夠很好地采集到孢子，并且在適當(dāng)?shù)臈l件下可以將孢子保存較長(zhǎng)的時(shí)間。發(fā)明人反復(fù)比較了牛肝菌子實(shí)體成熟度與孢子彈射的相關(guān)性，在低溫下觀察了孢子釋放的情況，進(jìn)行了孢子儲(chǔ)藏后萌發(fā)情況的試驗(yàn)調(diào)查，從而得到了一種牛肝菌孢子采集與保存的方法，從而完成了本發(fā)明并獲得了令人意外的滿意的收集效果。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。1、一種牛肝菌孢子的采集方法，所述方法包括如下步驟:I)子實(shí)體采集步驟:將未散發(fā)孢子的菌蓋以菌孔朝下的方式架放在底部鋪有濾紙的采集容器入口，并使用包裹材料將所述菌蓋和采集容器蓋包裹在一起；2)低溫存放步驟:將所述采集容器保存在2°C至15°C的保溫箱中；和3)獲取孢子步驟:將所述菌蓋置于2°C至5°C的溫度條件下使孢子釋放于所述墊層上。
2、如技術(shù)方案I所述的方法，其中，所述采集容器為帶有蓋子的廣口玻璃瓶。3、如技術(shù)方案I或2所述的方法，其中，所述包裹材料為經(jīng)過滅菌的報(bào)紙或牛皮紙。4、如技術(shù)方案I至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述濾紙為白色濾紙。5、如技術(shù)方案I至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述子實(shí)體采集步驟通過如下方式進(jìn)行:使用滅菌刀片小心取下菌蓋，將所述菌蓋以菌孔朝下方式架放在經(jīng)過滅菌的采集容器入口，使用經(jīng)滅菌的作為所述包裹材料的報(bào)紙或牛皮紙將所述菌蓋和所述采集容器包裹在一起，并使用橡皮筋包扎固定后置于干凈的所述保溫箱中。6、如技術(shù)方案I至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在第I)步驟中，所述子實(shí)體的菌孔為可肉眼觀察的。7、如技術(shù)方案I至6所述的方法，其中，所述子實(shí)體的菌孔寬度為0.1Omm至1.0Omm08、如技術(shù)方案I至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述子實(shí)體的菌孔長(zhǎng)度為0.25mm至 2.00mm。9、如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述牛肝菌為點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌(Suillus granulat·us(L.:Fr.)0.Kuntce)。10、如技術(shù)·方案I至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述子實(shí)體是無蟲的。11、如技術(shù)方案I至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述方法中使用的用具為經(jīng)過無菌處理的用具。12、如技術(shù)方案I至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第3)步驟中的所述釋放持續(xù)2小時(shí)至3小時(shí)。13、一種牛肝菌孢子的保存方法，所述方法包括如下步驟:I)將牛肝菌孢子釋放于濾紙上；2)將濾紙剪切成條帶；3)將所述條帶放入試管中；和4)將所述試管在2°C至5°C的溫度條件下保存。14、如技術(shù)方案13所述的方法，其中，所述濾紙為技術(shù)方案I至11中任一項(xiàng)所述的方法得到所述濾紙。本發(fā)明的采集和保存牛肝菌孢子的方法具有簡(jiǎn)單、易操作、采集量大、孢子純凈等優(yōu)點(diǎn)。


為了更加便于理解本發(fā)明，本文在此提供如下附圖，但是這些附圖只用于說明目的，而不應(yīng)理解為用于限定本發(fā)明，其中:圖1顯示了成熟度過高已經(jīng)散發(fā)了孢子的子實(shí)體的照片。圖2顯示了成熟度達(dá)到了能夠散發(fā)孢子的適合采集的子實(shí)體的照片。圖3顯示了成熟度過低還沒有達(dá)到散發(fā)孢子程度的子實(shí)體的照片。圖4顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式適合采集的成熟度達(dá)到了能夠散發(fā)孢子的子實(shí)體的電子掃描顯微(SEM)照片，其中示出菌孔的長(zhǎng)度為320.92 μ m，寬度為151.89 μ m。其中成像條件為:放大倍率:158倍；拍攝時(shí)間:2012年10月I日；掃描電鏡型號(hào):TSCAN5136。圖5顯示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式適合采集的成熟度達(dá)到散發(fā)孢子的程度的子實(shí)體的電子掃描顯微(SEM)照片，其中示出菌寬度為162.35μπι。其中放大倍率為358倍，其他成像條件與圖4相同。
具體實(shí)施例方式在第一方面，本發(fā)明提供了牛肝菌孢子的采集方法。所述方法包括如下步驟:I)子實(shí)體采集步驟:將未散發(fā)孢子的菌蓋以菌孔朝下的方式架放在底部鋪有濾紙的采集容器入口，并使用包裹材料將所述菌蓋和采集容器蓋包裹在一起；2)低溫存放步驟:將所述采集容器保存在2°C至15°C的保溫箱中；和3)獲取孢子步驟:將所述菌蓋置于2°C至5°C的溫度條件下使孢子釋放于所述墊層上。在所述低溫存放步驟中，保溫箱的溫度例如可以為2°C至15°C，優(yōu)選為5°C至12°C，更優(yōu)選為大于5°C且小于10°C的溫度。例如可以為2°C、3°C、4°C、5°C、6°C、7°C、8°C、9°C、10°C、11°C、12°C、13°C、14°C或15°C。如果溫度過低，則在室外不容易實(shí)現(xiàn)，并且可能影響到隨后孢子的釋放；如果溫度過高，則容易失水，影響孢子釋放。在所述獲取孢子步驟中，溫度可以為2°C至5°C，更優(yōu)選為4°C至5°C。例如為2°C、3°C、4°C或者5°C，例如保存在設(shè)定為如上溫度的冰箱中。所述第3)步驟可以在所述第2)步驟之后立即進(jìn)行。但是優(yōu)選所述第3)步驟在所述第2)步驟結(jié)束后3小時(shí)至10小時(shí)(例如3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)、7小時(shí)、8小時(shí)、9小時(shí)或者10小時(shí))之后進(jìn)行，這樣可以使孢子能夠更好地釋放。另外，在根據(jù)第2)步驟中的溫度高于5°C的情況下，第二步驟和第三步驟中的間隔時(shí)間優(yōu)選不超過10小時(shí)。低溫條件一般認(rèn)為會(huì)降低細(xì)胞的活躍度，因而不會(huì)將用于采集孢子的子實(shí)體保存在低溫條件下。本發(fā)明人通過多年連續(xù)的調(diào)查和研究，發(fā)現(xiàn)牛肝菌尤其是點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌的生長(zhǎng)環(huán)境的地表溫度都比較低，在這樣的環(huán)境條件下也還出現(xiàn)孢子能夠自然彈射，而常溫反而由于失水收縮等原因而導(dǎo)致彈射失敗。于是本發(fā)明人進(jìn)行了一系列的試驗(yàn)研究，終于實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。本發(fā)明對(duì)所述采集容器沒有特別的限制。在一些實(shí)施方式中，所述采集容器為帶有蓋子的廣口玻璃瓶，例如帶有蓋子的250ml的廣口玻璃瓶，并且在將所述菌蓋架放在所述廣口玻璃瓶入口之前蓋上所述蓋子以防止污染。本發(fā)明對(duì)包裹材料沒有特別的限制。在一些實(shí)施方式中，所述包裹材料優(yōu)選為經(jīng)過滅菌的報(bào)紙或牛皮紙。本發(fā)明對(duì)所述墊層沒有特別的限制，例如所述墊層可以為濾紙。由于適合采集的牛肝菌的孢子一般呈黃褐色，因此為了便于觀察，所以濾紙優(yōu)選為白色濾紙。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述子實(shí)體采集步驟通過如下方式進(jìn)行:使用滅菌刀片小心取下菌蓋，將所述菌蓋以菌孔朝下方式架放在經(jīng)過滅菌的采集容器入口，使用經(jīng)滅菌的作為所述包裹材料的報(bào)紙或牛皮 紙將所述菌蓋和所述采集容器包裹在一起，并使用橡皮筋包扎固定后置于干凈的所述保溫箱中。為了使子實(shí)體能夠充分釋放孢子并且所釋放的孢子具有適合的成熟度從而具有較高的萌發(fā)率，在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，選擇采集的子實(shí)體為菌孔可以用肉眼(即不借助于儀器例如放大鏡)能夠觀察到的子實(shí)體。在一些更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述菌孔的寬度為0.1Omm至1.0Omm,優(yōu)選為0.12mm至0.8mm,更優(yōu)選為0.13至0.7mm。例如，所述菌孔的寬度可以為 0.10mm、0.llmm、0.12mm、0.13mm、0.14mm、0.15mm、0.16mm、0.17mm、0.18mm、
0.19mm、0.20mm、0.30mm、0.35mm、0.40mm、0.45mm、0.50mm、0.55mm、0.60mm、0.65mm、0.70mm、
0.75mm、0.80mm、0.85mm、0.90mm、0.95mm或1.00mm。本文所述的寬度具有本領(lǐng)域技術(shù)人員一般理解的意義，即，所述寬度為菌孔上邊緣平面上的最小直徑。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述子實(shí)體的菌孔長(zhǎng)度為0.25mm至2.0Omm,更優(yōu)選為
0.30mm至1.50mm,進(jìn)一步優(yōu)選為0.35mm至1.00mm。例如，所述最大直徑可以為0.25_、
0.26mm、0.27mm、0.28mm、0.29mm、0.30mm、0.32mm、0.34mm、0.36mm、0.38mm、0.40mm、0.45mm、
0.50mm>0.55mm>0.60mm>0.65mm>0.70mm>0.75mm>0.80mm、0.85mm、0.90mm>0.95mm、L 00mm、
1.10mm.1.20mm、1.30mm、1.40mm.1.50mm、1.60mm、1.70mm、1.80mm、1.90mm 或 2.0Omm0 本文所述的長(zhǎng)度具有本領(lǐng)域技術(shù)人員一般理解的意義，即，所述長(zhǎng)度為菌孔上邊緣平面上菌孔的最大直徑。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，優(yōu)選所述子實(shí)體是無蟲的，以防止子實(shí)體受損或者孢子受到污染。為了獲得純凈的 沒有雜質(zhì)的孢子，本發(fā)明優(yōu)選在采集過程使用過的所有用具，包括但不限于所述采集容器及其蓋子，墊層(或者濾紙)、包裹材料(或者報(bào)紙或牛皮紙)、保溫箱以及可選的例如刀片如滅菌刀、剪刀、鑷子、橡皮筋等都經(jīng)過無菌處理。例如，所述無菌處理可以為在121°C高壓滅菌30分鐘的滅菌處理或者采用酒精進(jìn)行的表面處理。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述第3)步驟中的所述釋放持續(xù)2小時(shí)至3小時(shí)。本發(fā)明經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，在2°C至5°C (例如2°C、3°C、4°C或5°C )的條件下放置2小時(shí)至3小時(shí)，子實(shí)體的孢子能夠充分地釋放，從而能夠采集到活力得到較好保持并且數(shù)量足夠多的孢子。在第二方面，本發(fā)明還提供了一種牛肝菌孢子的保存方法，所述方法包括如下步驟:I)將牛肝菌孢子釋放于濾紙上；2)將濾紙剪切成條帶；3)將所述條帶放入試管中；和4)將所述試管在2°C至5°C的溫度條件下保存。優(yōu)選的是，所述濾紙為采用本發(fā)明的上述采集方法得到的上面釋放有牛肝菌孢子的濾紙。例如可以將所述試管保存在溫度設(shè)定為例如2°C、3°C、4°C或5°C的冰箱中，所述溫度更優(yōu)選為41:至51:。順便說明的是，本發(fā)明所使用的數(shù)值范圍意指包括該范圍的端值和該范圍內(nèi)任意數(shù)值以及任意子范圍。實(shí)施例下文將通過實(shí)施例來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不過這些實(shí)施例僅為說明目的，不應(yīng)解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。牛肝菌孢子采集工具的準(zhǔn)備塑料常溫組:采集前一天取250ml的廣口玻璃瓶和瓶蓋若干個(gè)，瓶底部鋪圓形濾紙一張，封蓋；準(zhǔn)備20cm X20cm長(zhǎng)寬的牛皮紙或報(bào)紙若干張、橡皮筋若干個(gè)、滅菌刀片5-10個(gè)、剪刀和鑷子。將上述物品于121°C高壓滅菌30分鐘后，置于用酒精表面消毒的塑料常溫箱內(nèi)備用。保溫箱組:在采集工具I的基礎(chǔ)上，還準(zhǔn)備表面酒精消毒的保溫箱1-2個(gè)。所有用具均為市售產(chǎn)品，沒有本發(fā)明的專用的特殊產(chǎn)品。牛肝菌子實(shí)體的選擇和采集在7至9月份，在油松林地選擇尚未散發(fā)孢子的無蟲的(菌孔剛剛張開、肉眼可見，請(qǐng)參照?qǐng)D1至3)點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌子實(shí)體，用滅菌刀片小心取下菌蓋，使用滅菌刀片小心取下菌蓋，將所述菌蓋以菌孔朝下方式架放在經(jīng)過滅菌的廣口玻璃瓶口，使用經(jīng)滅菌的作為所述包裹材料的報(bào)紙或牛皮紙將所述菌蓋和光口玻璃瓶包裹在一起，并使用橡皮筋包扎固定后快速置于干凈的所述保溫箱中(保溫箱組)，保溫箱中的溫度保持不超過15°C。另外一些用橡皮筋固定后快速置于塑料常溫箱內(nèi)(塑料常溫箱組)。將保溫箱和塑料常溫箱都帶回實(shí)驗(yàn)室。掃描電子顯微觀測(cè)對(duì)于未散發(fā)孢子的子實(shí)體，使用電鏡拍攝其菌孔的開度，所得電鏡照片請(qǐng)參見圖4和圖5。孢子彈射數(shù)量測(cè)試保溫箱組:將保溫箱放有子實(shí)體的采集瓶置于設(shè)定為5°C冰箱內(nèi)，2個(gè)小時(shí)后觀察孢子的彈射情況。塑料常溫箱組:將塑料常溫箱放有子實(shí)體的采集瓶放于室內(nèi)超凈工作臺(tái)面上，常溫遮光靜置，6小時(shí)后觀察孢子彈射情況。并將彈射的孢子量按10個(gè)等級(jí)(即，O、
1、2、3、4、5、6、7、8、9)進(jìn)行打分，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)5個(gè)重復(fù)，結(jié)果見下表。
權(quán)利要求
1.一種牛肝菌孢子的采集方法，所述方法包括如下步驟: 1)子實(shí)體采集步驟:將未散發(fā)孢子的菌蓋以菌孔朝下的方式架放在底部鋪有濾紙的采集容器入ロ，并使用包裹材料將所述菌蓋和采集容器蓋包裹在一起； 2)低溫存放步驟:將所述采集容器保存在2°C至15°C的保溫箱中；和 3)獲取孢子步驟:將所述菌蓋置于2°C至5°C的溫度條件下使孢子釋放于所述墊層上。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述采集容器為帶有蓋子的廣ロ玻璃瓶。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述子實(shí)體采集步驟通過如下方式進(jìn)行:使用滅菌刀片小心取下菌蓋，將所述菌蓋以菌孔朝下方式架放在經(jīng)過滅菌的采集容器入ロ，使用經(jīng)滅菌的作為所述包裹材料的報(bào)紙或牛皮紙將所述菌蓋和所述采集容器包裹在一起，并使用橡皮筋包扎固定后置于干凈的所述保溫箱中。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在第I)步驟中，所述子實(shí)體的菌孔為可肉眼觀察的。
5.如權(quán)利要求1至4所述的方法,其中，所述子實(shí)體的菌孔寬度為0.1Omm至1.00mm。
6.如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法,其中,所述子實(shí)體的菌孔長(zhǎng)度為0.25mm至.2.00mm。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述牛肝菌為點(diǎn)柄粘蓋牛肝菌(Suillus granulatus(L.:Fr.)0.Kuntcej。
8.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第3)步驟中的所述釋放持續(xù)2小時(shí)至3小時(shí)。
9.一種牛肝菌孢子的保存方法，所述方法包括如下步驟: 1)將牛肝菌孢子釋放于濾紙上； 2)將濾紙剪切成條帶； 3)將所述條帶放入試管中；和 4)將所述試管在2°C至5°C的溫度條件下保存。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述濾紙為權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法得到所述濾紙。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種采集牛肝菌孢子的方法，所述方法包括如下步驟子實(shí)體采集步驟1)將未散發(fā)孢子的菌蓋以菌孔朝下的方式架放在底部鋪有濾紙的采集容器入口，并使用滅菌的包裹材料將所述菌蓋和采集容器蓋包裹在一起；2)低溫存放步驟將所述采集容器保存在2℃至15℃的保溫箱中；和3)獲取孢子步驟將所述菌蓋置于2℃至5℃的溫度條件下使孢子釋放于所述墊層上。本發(fā)明還提供了保存牛肝菌孢子的方法。本發(fā)明所述的采集方法和保存方法具有簡(jiǎn)單、易操作、采集量大、孢子純凈等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01D91/04GK103109647SQ20131007380
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月8日
發(fā)明者陳青君, 牛玉蓉, 張國(guó)慶, 程繼鴻, 王明花, 楊瑞 申請(qǐng)人:北京農(nóng)學(xué)院