專利名稱：一種遠(yuǎn)緣雜交和多倍體化選育構(gòu)樹桑樹新雜種的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種遠(yuǎn)緣雜交和多倍體化選育構(gòu)樹桑樹新雜種的方法，屬于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的樹木育種技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
構(gòu)樹是?？?Moraceae)構(gòu)樹屬落葉喬灌木,根系發(fā)達(dá),韌皮纖維極發(fā)達(dá),其適應(yīng)性極強(qiáng)，極耐干旱、瘠薄和濕熱，極少有病蟲害，而且葉含豐富蛋白質(zhì)，被譽(yù)為“生態(tài)恢復(fù)先鋒”，并廣泛用于飼料工業(yè)，但其木質(zhì)較差，主干性不明顯，局限了其在木材市場和行道園林上的應(yīng)用。而桑樹作為我國重要的經(jīng)濟(jì)林木之一，材質(zhì)優(yōu)良、主干性明顯，其最主要價值在于養(yǎng)蠶和高檔家具市場用材，但它在抗病蟲害方面表現(xiàn)較差，易被桑天牛等害蟲取食，其在生態(tài)適應(yīng)性上也存在一定的局限。有必要對栽培桑樹和構(gòu)樹進(jìn)行生殖工程性的品種改良。本方法利用生殖工程技術(shù)，突破栽培桑樹與野生構(gòu)樹雜交障礙，通過構(gòu)樹和栽培桑樹的遠(yuǎn)緣雜交和多倍體化，充分整合二者之間的優(yōu)勢，將兩者的優(yōu)異基因結(jié)合在遠(yuǎn)緣雜交多倍體雜種中，培育出豐產(chǎn)速生、材質(zhì)優(yōu)良、適應(yīng)性強(qiáng)的優(yōu)良經(jīng)濟(jì)型新樹種。既為桑樹和構(gòu)樹育種開創(chuàng)新途徑，也為新雜種廣泛應(yīng)用于木材加工、行道園林、飼料工業(yè)和生態(tài)恢復(fù)工程創(chuàng)造良好條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種遠(yuǎn)緣雜交和多倍體化選育構(gòu)樹和桑樹新雜種的方法，是通過生殖工程性品種改良技術(shù)，對遠(yuǎn)緣雜種進(jìn)行胚胎工程、組織培養(yǎng)技術(shù)，建立獲得雜交果、誘導(dǎo)雜交果愈傷組織加倍形成遠(yuǎn)緣雜交多倍體雜種系，以用于解決現(xiàn)有構(gòu)樹的主干不明，材質(zhì)較差和桑樹適應(yīng)性不強(qiáng)的問題。
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本發(fā)明的技術(shù)方案為:a.遠(yuǎn)緣雜種果實的獲得；b.雜交果的愈傷組織誘導(dǎo)；c.雜交果愈傷組織的秋水仙素處理；d.處理后愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng)；e.愈傷組織分化出芽苗；
f.芽苗分化出根；g.組培植株的移植；h.成活植株的比較觀察與選擇；1.選株的無性擴(kuò)繁成穩(wěn)定品種(系)。本發(fā)明的具體過程為:
a.遠(yuǎn)緣雜種果實的獲得
遠(yuǎn)緣雜種是以優(yōu)良桑樹品種和野生構(gòu)樹為親本，利用構(gòu)樹桑樹雌雄異株的特性，選用雌構(gòu)樹為母本進(jìn)行套袋，父本桑樹的花粉采集于初花期，取出花藥于干燥處晾干，待花藥開裂、花粉散出后將花藥用紙包好，放在底層有干燥劑的干燥器中儲存。在構(gòu)樹品種始花至終花、柱頭上出現(xiàn)粘液時，分2次 3次授粉(用毛筆挑花粉散點于帶粘液的柱頭上)，授粉后每隔一天對雜交果噴施激素(50mg/L-100mg/lGA3 + 20mg/L-30mg/L NAA) 2周后，獲得雜交果；
b.雜交果的愈傷組織誘導(dǎo)
取回雜交果經(jīng)流水沖凈后，先在0.1%新潔爾滅(5%)溶液中浸泡30 min，然后用0.1%升汞消毒8 IOmin，再用無菌水洗3次 4次。將消毒后的雜交果，放在超凈工作臺上除去果實外絨毛，切成1/2-1/4大小并保留0.5cm-0.8cm葉柄。再將切好的果子切割面朝下水平放入到雜交果愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于20001X光照10hr/d，25°C條件下培養(yǎng)。20天-25天果實發(fā)生膨大并在果實中心處或切面出現(xiàn)緊密的乳白色團(tuán)狀愈傷組織；
所述雜交果的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS +1.0mg/L- 2.5mg/L 6-BA + 0.lmg/L-0.5mg/L NAA + 4% 蔗糖 + 0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ；
c.雜交果愈傷組織的秋水仙素處理
當(dāng)雜交果愈傷組織生長到40天-45天時,將愈傷組織置于添加500mg/L 750mg/L秋水仙素，不加瓊脂的雜交果愈傷組織加倍培養(yǎng)液中，放在溫室(26°C)搖床上，在100轉(zhuǎn) 120轉(zhuǎn)/分鐘的速度下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)處理48hr 60hr ；
所述加倍培養(yǎng)基配方為:MS +1.0mg/L- 2.5mg/L 6-BA + 0.lmg/L-0.5mg/L NAA+500mg/L 750mg/L 秋水仙素 + 4% 鹿糖，ρΗ5.8 ；
d.處理后愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng)
雜交果愈傷組織加倍處理完畢，取出愈傷組織經(jīng)無菌水沖洗和吸干表面水分后，接種到雜交果愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，恢復(fù)培養(yǎng)7天；
e.愈傷組織分化出芽苗
經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的愈傷組織接種到分 化培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)，15天-20天后愈傷組織出現(xiàn)綠芽，25天-35天后陸續(xù)分化出芽苗，并可見叢苗出現(xiàn)；
所述分化培養(yǎng)基配方為:MS + 2.0mg/L 3.5mg/L 6-BA + 0.lmg/L-0.3mg/L NAA +3% 蔗糖 + 0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ；
f.芽苗分化出根
當(dāng)芽苗分化生長到2.0cm-5.0cm高時，將芽苗靠近愈傷組織處剪斷移植于生根培養(yǎng)基中，25天-30天后芽苗基部分化出根而形成完整的組織培養(yǎng)植株；
所述生根培養(yǎng)基配方為:1/2 MS +0.lmg/L- 0.3mg/L NAA + 1.0mg/L-2.0mg/L IBA +2% 蔗糖 + 0.75% 瓊脂，ρΗ5.8
g.組培植株的移植
當(dāng)組培植株生長到8.0cm-12.0cm高、具有I條 3條根的時候，將進(jìn)行組培植株的移植，首先將要移植植株的培養(yǎng)瓶蓋打開，每瓶添加IOml 15ml無菌水，放到常溫的實驗室內(nèi)緩苗2天，然后充分清洗掉植株根部的培養(yǎng)基，將植株移栽到滅菌的70%蛭石+15%細(xì)砂+15%園土的基質(zhì)中，澆上1/10MS大量元素溶液，蓋上薄膜和黑網(wǎng)(50%遮光率);然后每2天噴灑1/10MS大量元素溶液，直至植株成活，再逐步揭開黑網(wǎng)和薄膜，使組培苗健壯生長；
h.成活植株的比較觀察與選擇
根據(jù)雜種植株和親本植株外部形態(tài)的差異，選取葉片上面光滑無毛，下面沿葉脈疏生毛形似桑樹的植株為初選雜合體株，再將雜合體葉片和親本葉片的DNA提取出來，采用SSR分子標(biāo)記對其進(jìn)行序列比對，即使用同一 SSR引物對雜種和親本基因組體外擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，比較雜種和親本基因組標(biāo)記序列相似度，結(jié)果被測植株顯示兩個親本植物的標(biāo)記而確定為構(gòu)桑雜種；經(jīng)根尖染色體檢查區(qū)分二倍體雜種和多倍體雜種；
1.選株經(jīng)無性擴(kuò)繁成穩(wěn)定品種(系)將已確定為構(gòu)樹桑樹雜種(2X，4X)的單株生長到80cm-100cm時截取枝條，按每莖段含3個芽作為繁殖莖段，于立春后的3天-15天內(nèi)插植于苗床上進(jìn)行無性擴(kuò)繁，而成為穩(wěn)定的雜合體構(gòu)樹桑樹品種(系)。經(jīng)上述步驟選育的多倍體構(gòu)樹桑樹雜種品種(系)具有幾種優(yōu)良效果:
1.利用雜交果誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)頻率高，而且能夠在培養(yǎng)基中生長，吸收營養(yǎng)快，生長速度快。2.用雜交果愈傷組織進(jìn)行染色體加倍，誘導(dǎo)效果比整體小苗處理效果好，而且再分化出苗后產(chǎn)生嵌合體的頻率低。3.通過生殖工程技術(shù)培育的遠(yuǎn)緣雜種具有主干明顯，材質(zhì)優(yōu)良，適應(yīng)性極強(qiáng)，極耐干旱、瘠薄和濕熱，少有病蟲害的顯著優(yōu)勢，因此在木材加工和高檔家具市場極具潛力，擁有的廣闊的市場前景；
4.遠(yuǎn)緣新雜種多倍體化后韌皮纖維發(fā)達(dá)，枝干粗壯，枝葉繁茂既具有抗折斷、蔭蔽面積大的優(yōu)勢，又是非常優(yōu)良的行道樹種，在行道園林上有很大的推廣價值；
5.遠(yuǎn)緣雜交多倍體品種蛋白質(zhì)含量高，是十分理想的飼料工業(yè)原料，雜種可能出現(xiàn)不育現(xiàn)象而無果不會被鳥類所取食，具有很好的經(jīng)濟(jì)價值和環(huán)境保護(hù)效果。


圖1為本發(fā)明雜交果圖片；
圖2為本發(fā)明雜交果培養(yǎng)產(chǎn)生的乳白色團(tuán)狀愈傷組織圖片；
圖3為本發(fā)明雜交果愈傷組織 分化出芽圖片；
圖4為本發(fā)明雜交果愈傷組織分化出叢芽圖片；
圖5為本發(fā)明芽分化出根成完整構(gòu)樹桑樹雜交苗圖片。
具體實施例方式下面以實施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明:
a.遠(yuǎn)緣雜種果實的獲得
選擇湖北省農(nóng)科院桑樹種質(zhì)資源庫中優(yōu)良桑樹品種鄂桑2號、湖桑32號和在中國農(nóng)科院油料所中的野生構(gòu)樹GSf-Ol為親本，利用構(gòu)樹桑樹雌雄異株的特性，以構(gòu)樹為母本進(jìn)行套袋處理；父本桑樹花粉采集于初花期，取出花藥于干燥處晾干，待花藥開裂、花粉散出后將花藥用紙包好，放在有生石灰的干燥器中儲存。在構(gòu)樹GSf-Ol始花至終花、柱頭上出現(xiàn)粘液時，分3次授粉(用毛筆挑花粉散點于帶粘液的柱頭上)，授粉后每隔一天對雜交果噴施激素液2周，獲得雜交果(附圖片I)；
b.雜交果的愈傷組織誘導(dǎo)
取回雜交果經(jīng)流水沖凈后，先在0.1%新潔爾滅(5%)溶液中浸泡30 min，然后用0.1%升汞消毒IOmin，再用無菌水洗4次。將消毒后的雜交果，放在超凈工作臺上除去果實外絨毛，切成1/2-1/4大小并保留0.5cm-0.8cm葉柄。再將切好的果子切割面朝下水平放入到雜交果愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于20001X光照10hr/d，25°C條件下培養(yǎng)。20天-25天果實發(fā)生膨大并在果實中心處或切面出現(xiàn)緊密的乳白色愈傷組織(附圖片2);所述雜交果的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為=MS +2.0mg/L 6-BA + 0.lmg/L NAA + 4%蔗糖+ 0.75%瓊脂，ρΗ5.8 ；
c.雜交果愈傷組織的秋水仙素處理
當(dāng)雜交果愈傷組織生長到40天 45天時，將愈傷組織置于MS+2.0mg/L6-BA+0.lmg/LNAA+750mg/L秋水仙素+4%蔗糖，pH5.8，不加瓊脂的雜交果愈傷組織加倍培養(yǎng)液中，放在溫室(26 °C)搖床上，在100轉(zhuǎn)/分鐘的速度下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)48hr ；
d.處理后愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng)
雜交果愈傷組織加倍處理完畢，取出愈傷組織經(jīng)無菌水沖洗和表面水分后，接種到雜交果愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，恢復(fù)培養(yǎng)7天；
e.愈傷組織分化出芽苗
經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的愈傷組織接種到MS+3.0mg/L6-BA+0.lmg/LNAA +3%蔗糖+0.75%瓊脂，pH5.8的分化培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)。15天-20天后愈傷組織出現(xiàn)綠芽附圖片3，25天-35天后陸續(xù)分化出芽苗，并可見叢苗出現(xiàn)(附圖片4);
f.芽苗分化出根
當(dāng)芽苗分化生長到2.0cm-5.0cm時，將芽苗 靠近愈傷組織處剪斷移植于生根培養(yǎng)基(1/2MS+0.3mg/LNAA+lmg/L IBA+2% 蔗糖 +0.75% 瓊脂，ρΗ5.8)中，25 天-30 天后芽苗基部分化出根而形成完整的組織培養(yǎng)植株(附圖片5)；
g.組培植株的移植
當(dāng)組培植株生長到8.0cml 2.0cm高，具有I條 3條的時候，將進(jìn)行組培植株的移植，首先將要移植植株的培養(yǎng)瓶蓋打開，每瓶添加15ml無菌水，放到常溫的實驗室內(nèi)緩苗2天，然后充分清洗掉植株根部的培養(yǎng)基，將植株移栽到滅菌的70%蛭石+15%細(xì)砂+15%園土的基質(zhì)中，澆上1/10MS大量元素溶液，蓋上薄膜和黑網(wǎng)(50%遮光率)。然后每2天噴灑1/10MS大量元素溶液，直至植株成活，再逐步揭開黑網(wǎng)和薄膜，使組培苗健壯生長；
h.成活植株的比較觀察與選擇
根據(jù)雜種植株和親本植株外部形態(tài)的差異，選取葉片上面光滑無毛，下面沿葉脈疏生毛形似桑樹的植株為初選雜合體株，再將雜合體葉片和親本葉片的DNA提取出來采用SSR分子標(biāo)記對其進(jìn)行序列比對，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，所得結(jié)果顯示被測植株表現(xiàn)出父母本特有譜帶的確定為構(gòu)桑雜種；經(jīng)根尖染色體檢查區(qū)分二倍體雜種和多倍體雜種；
1.選株經(jīng)無性擴(kuò)繁成穩(wěn)定品種(系)
將已確定為構(gòu)樹桑樹雜種(2X，4X)的單株生長到80cm-100cm時截取枝條，按每莖段含3個芽作為繁殖莖段，于立春后的3天-15天內(nèi)插植于苗床上進(jìn)行無性擴(kuò)繁，而成為穩(wěn)定的構(gòu)樹桑樹雜種品種(系)。
權(quán)利要求
1.一種遠(yuǎn)緣雜交和多倍體化選育構(gòu)樹桑樹新雜種的方法，其特征在于選育過程為: a.遠(yuǎn)緣雜種果實的獲得 遠(yuǎn)緣雜種是以生長旺盛，無病蟲害的優(yōu)良桑樹品種和野生構(gòu)樹為親本，利用構(gòu)樹桑樹雌雄異株的特性，選用雌構(gòu)樹為母本進(jìn)行套袋，父本桑樹的花粉采集于初花期，取出花藥于干燥處晾干，待花藥開裂、花粉散出后將花藥用紙包好，放在底層有干燥劑的干燥器中儲存；在構(gòu)樹品種始花至終花、柱頭上出現(xiàn)粘液時，分2次 3次授粉，授粉后每隔一天對雜交果噴施50mg/L-100mg/LGA3 + 20mg/L-30mg/L NAA的激素，2周后，獲得雜交果； b.雜交果的愈傷組織誘導(dǎo) 取回雜交果經(jīng)流水沖凈后，先在0.1%新潔爾滅(5%)溶液中浸泡30 min，然后用0.1%升汞消毒8 IOmin，再用無菌水洗3次 4次，將消毒后的雜交果，放在超凈工作臺上除去果實外絨毛，切成1/2-1/4大小并保留0.5cm-0.8cm葉柄，再將切好的果子切割面朝下水平放入到雜交果愈 傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，置于20001X光照10hr/d，25°C條件下培養(yǎng)，20天-25天果實發(fā)生膨大并在果實中心處或切面出現(xiàn)緊密的乳白色團(tuán)狀愈傷組織； 所述雜交果的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS +1.0mg/L- 2.5mg/L 6-BA + 0.lmg/L-0.5mg/L NAA + 4% 蔗糖 + 0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ； c.雜交果愈傷組織的秋水仙素處理 當(dāng)雜交果愈傷組織生長到40天-45天時,將愈傷組織置于添加500mg/L 750mg/L秋水仙素，不加瓊脂的雜交果愈傷組織加倍培養(yǎng)液中，放在溫室(26°C)搖床上，在100轉(zhuǎn) 120轉(zhuǎn)/分鐘的速度下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)處理48hr 60hr ； 所述加倍培養(yǎng)基配方為:MS +1.0mg/L- 2.5mg/L 6-BA + 0.lmg/L-0.5mg/L NAA +500mg/L 750mg/L 秋水仙素 + 4% 鹿糖，ρΗ5.8 ； d.處理后愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng) 雜交果愈傷組織加倍處理完畢，取出愈傷組織經(jīng)無菌水沖洗和吸干表面水分后，接種到雜交果愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，恢復(fù)培養(yǎng)7天； e.愈傷組織分化出芽苗 經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)，15天-20天后愈傷組織出現(xiàn)綠芽，25天-35天后陸續(xù)分化出芽苗，并可見叢苗出現(xiàn)； 所述分化培養(yǎng)基配方為:MS + 2.0mg/L 3.5mg/L 6-BA + 0.lmg/L-0.3mg/L NAA +3% 蔗糖 + 0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ； f.芽苗分化出根 當(dāng)芽苗分化生長到2.0cm-5.0cm高時，將芽苗靠近愈傷組織處剪斷移植于生根培養(yǎng)基中，25天-30天后芽苗基部分化出根而形成完整的組織培養(yǎng)植株； 所述生根培養(yǎng)基配方為:1/2 MS +0.lmg/L- 0.3mg/L NAA + 1.0mg/L-2.0mg/L IBA +2% 蔗糖 + 0.75% 瓊脂，ρΗ5.8 ； g.組培植株的移植 當(dāng)組培植株生長到8.0cm-12.0cm高、具有I條 3條根的時候，將進(jìn)行組培植株的移植，首先將要移植植株的培養(yǎng)瓶蓋打開，每瓶添加IOml 15ml無菌水，放到常溫的實驗室內(nèi)緩苗2天，然后充分清洗掉植株根部的培養(yǎng)基，將植株移栽到滅菌的70%蛭石+15%細(xì)砂+15%園土的基質(zhì)中，澆上1/10MS大量元素溶液，蓋上薄膜和黑網(wǎng)(50%遮光率);然后每2天噴灑1/10MS大量元素溶液，直至植株成活，再逐步揭開黑網(wǎng)和薄膜，使組培苗健壯生長； h.成活植株的比較觀察與選擇 根據(jù)雜種植株和親本植株外部形態(tài)的差異，選取葉片上面光滑無毛，下面沿葉脈疏生毛形似桑樹的植株為初選雜合體株，再將雜合體葉片和親本葉片的DNA提取出來，采用SSR分子標(biāo)記對其進(jìn)行序列比對，即使用同一 SSR引物對雜種和親本基因組體外擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，比較雜種和親本基因組標(biāo)記序列相似度，結(jié)果被測植株顯示兩個親本植物的標(biāo)記而確定為雜合體，經(jīng)根尖染色體檢查區(qū)分二倍體雜種和多倍體雜種；. 1.選株經(jīng)無性擴(kuò)繁成穩(wěn)定品種 將已確定為構(gòu)樹桑樹雜合體的單株生長到80cm-100cm時截取枝條，按每莖段含3個芽作為繁殖莖段，于立春后的3天-15天內(nèi)插植于苗床上進(jìn)行無性擴(kuò)繁，而成為穩(wěn)定的雜合體構(gòu)樹桑樹品 種。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種遠(yuǎn)緣雜交和多倍體化選育構(gòu)樹桑樹新雜種的方法，它是通過生殖工程性品種改良技術(shù)，對遠(yuǎn)緣雜種進(jìn)行胚胎工程、組織培養(yǎng)技術(shù)，建立了誘導(dǎo)雜交果愈傷組織加倍形成遠(yuǎn)緣雜交多倍體雜種系，步驟為a.遠(yuǎn)緣雜種果實的獲得；b.雜交果的愈傷組織誘導(dǎo)；c.雜交果愈傷組織的秋水仙素處理；d.處理后愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng)；e.愈傷組織分化出芽苗；f.芽苗分化出根；g.組培植株的移植；h.成活植株的比較觀察與選擇；i.選株的無性擴(kuò)繁成穩(wěn)定品種(系)。本發(fā)明解決了現(xiàn)有桑樹生長緩慢，適應(yīng)性不強(qiáng)和構(gòu)樹主干不明，材質(zhì)較差的問題，而培育出主干明顯、適應(yīng)性強(qiáng)、材質(zhì)較好的多倍體構(gòu)樹桑樹新雜種。
文檔編號A01H4/00GK103168676SQ20131007329
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月8日
發(fā)明者王東鵬, 陳小芳, 潘超虎, 屈海波, 王維, 杜明芳, 宋兆建, 何玉池, 蔡得田 申請人:湖北大學(xué)