專利名稱：一種萬(wàn)象組織培養(yǎng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)、植物莖尖培養(yǎng)技術(shù)，主要是一種萬(wàn)象組織培養(yǎng)的方法。
背景技術(shù)：
萬(wàn)象(Haworthia maughanii),又名毛漢十二卷，為百合科(Liliaceae)、十二卷屬(Haworthia)多年生多漿植物，原產(chǎn)南非，喜溫暖、干燥和陽(yáng)光充足的環(huán)境，耐干旱，怕積水、忌烈日曝曬，不耐寒冷。萬(wàn)象整株植株無(wú)莖，條狀肉質(zhì)葉從基部斜出，呈松散的蓮座狀排列，葉頂端截面透明或半透明，有些品種葉頂端截面上還有花紋。萬(wàn)象品種多樣，株型小巧、奇特，觀賞價(jià)值較高，目前主要用小盆栽培，適合陽(yáng)臺(tái)、窗臺(tái)和書(shū)桌點(diǎn)綴、觀賞，具有較大的市場(chǎng)前景。萬(wàn)象的繁殖常用播種、分株、插葉、插根等方式，但是傳統(tǒng)繁殖方式受季節(jié)、年限及栽培技術(shù)限制嚴(yán)重，每年繁殖數(shù)量有限，不利用萬(wàn)象的推廣。植物組織培養(yǎng)技術(shù)被認(rèn)為是目前最高效的植物種苗快繁技術(shù)手段，目前，國(guó)內(nèi)利用植物組培技術(shù)對(duì)萬(wàn)象進(jìn)行快速繁殖的文獻(xiàn)報(bào)道極少，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)體系尚未建立。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種萬(wàn)象組織培養(yǎng)的方法，建立良好的萬(wàn)象組培再生體系，為萬(wàn)象種苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)、新品種創(chuàng)制及品質(zhì)遺傳改良等做好技術(shù)支持。本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)完成的。這種萬(wàn)象組織培養(yǎng)的方法，該方法包括以下幾個(gè)步驟:1)外植體的選取及處理:選取萬(wàn)象穗狀花序作為起始材料，收集到的萬(wàn)象穗狀花序剝?nèi)バ∷牖枯嗥?再將整個(gè)花序切成0.5cm長(zhǎng)短，作為組培用外植體；2)愈傷誘導(dǎo):在超凈工作臺(tái)上，將經(jīng)過(guò)表面消毒的外植體在轉(zhuǎn)移至無(wú)菌接種盤中，用無(wú)菌濾紙吸去外植體表面水分，接種于初代培養(yǎng)基MS+6-BA3.0 5.0mg/L+NAA0.05
0.2mg/L中進(jìn)行初代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2°C，光照時(shí)間為12 14h/d，光照強(qiáng)度為45 60 μ.mo 1.m 2.s 1 ；3)不定芽誘導(dǎo):將獲得的增殖良好的萬(wàn)象愈傷材料轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA1.0 3.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L中，進(jìn)行不定芽，培養(yǎng)溫度25±2°C，光照時(shí)間為12 14h/d,光照強(qiáng)度為45 60 μ.mo 1.m 2.s 1 ;4)不定芽增殖:在無(wú)菌工作臺(tái)上，將愈傷誘導(dǎo)獲得的1 1.5cm高的不定芽2 3個(gè)一叢，利用無(wú)菌的解剖刀將基部輕輕造成一些傷口，接種于不定芽增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，不定芽增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5 1.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L,培養(yǎng)溫度25±2°C,光照時(shí)間為12 14h/d,光照強(qiáng)度為45 60 μ.mo 1.πΓ2.s_1 ；5)壯苗培養(yǎng):高生長(zhǎng)到1.5 2cm的叢生不定芽2 3個(gè)一叢，接種到壯苗培養(yǎng)基MS+6-BA0.1 0.2mg/L+NAA0.0l 0.lmg/L中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2°C，光照時(shí)間為12 14h/d,光照強(qiáng)度為 45 60 μ.mo I.m 2.s 1 ;6)不定芽生根誘導(dǎo):從基部將高生長(zhǎng)到3 5cm的叢生不定芽分開(kāi)成單個(gè)不定芽，接入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)，生根培養(yǎng)基為MS+IBA0 0.5mg/L或1/2MS+IBA0
0.5mg/L,培養(yǎng)溫度25±2°C,光照時(shí)間為12 14h/d,光照強(qiáng)度為45 60 μ.mol.πΓ2.s-1 ；7)組培苗馴化及移栽:不定芽基部長(zhǎng)出3 5條I 2cm的不定根后，將組培移至溫室，散射光培養(yǎng)5d后打開(kāi)瓶蓋，再培養(yǎng)I 2d，完成組培苗移栽前馴化，然后將組培苗從培養(yǎng)瓶取出，洗凈組培苗表面瓊脂，晾至表皮稍紅，，栽入基質(zhì)中，保濕60% -80%以上培養(yǎng)15d，然后在溫室中正常培養(yǎng)。愈傷誘導(dǎo)、不定芽誘導(dǎo)及增殖、壯苗培養(yǎng)、不定芽生根誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，蔗糖用量為20 40g/L，凝固劑為瓊脂粉，用量為8 9g/L，培養(yǎng)基pH分裝前調(diào)整為
5.7 ~ 5.8o本發(fā)明有益的效果是:1、通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行萬(wàn)象種苗快繁，生產(chǎn)不受地區(qū)、季節(jié)、氣候及母株生長(zhǎng)年限的限制，便于工廠化育苗，可根據(jù)訂單進(jìn)行生產(chǎn)，生產(chǎn)時(shí)間及規(guī)?？煽兀瑸槿f(wàn)象的推廣應(yīng)用提供充足的優(yōu)質(zhì)種苗保障。2、繁殖系數(shù)達(dá)到2 2.5，生根率100%，移栽成活率98%以上，達(dá)到種苗工廠化育苗生產(chǎn)的要求，目前尚未見(jiàn)關(guān)于萬(wàn)象組織培養(yǎng)的文獻(xiàn)報(bào)道。3、組培苗后代種苗 遺傳背景一致，最大限度保持母本的優(yōu)良性狀。4、有利于本屬其他植物品種組培快繁體系建立借鑒、推廣。5、建立良好的組培快繁體系，為今后利用植物生物技術(shù)對(duì)萬(wàn)象進(jìn)行新品種培育、遺傳改良等研究工作奠定基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，實(shí)施例將幫助更好地理解本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅僅局限于下述實(shí)施例。本發(fā)明所述的萬(wàn)象組織培養(yǎng)的方法，包括步驟如下:1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件:基本培養(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基，蔗糖用量為20 40g/L，凝固劑為瓊脂粉，用量為8 9g/L，培養(yǎng)基pH分裝前調(diào)整為5.7 5.8 ;愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA3.0 5.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L ;不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 MS+6-BA1.0 3.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L ;不定芽增殖培養(yǎng)基為 MS+6-BA0.5 1.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L ;壯苗培養(yǎng)基為MS+6-BA0.1 0.2mg/L+NAA0.01 0.lmg/L ;生根培養(yǎng)基為MS+IBA0
1.0mg/L或1/2MS+IBA0 1.0mg/L ;愈傷誘導(dǎo)、不定芽誘導(dǎo)及增殖、壯苗培養(yǎng)、不定芽生根培養(yǎng)條件為，培養(yǎng)溫度25±2°C,光照時(shí)間為12 14h/d,光照強(qiáng)度為45 60 μ *mol.ι 2 *s、2、外植體的處理與消毒:選取萬(wàn)象穗狀花序作為起始材料，收集到的萬(wàn)象穗狀花序剝?nèi)バ∷牖枯嗥?，再將整個(gè)花序切成0.5cm左右長(zhǎng)短，作外植體，處理好的外植體用洗潔精溶液清洗30min，期間不斷輕輕攪拌，然后流水沖洗經(jīng)洗潔精清洗的外植體材料30 60min，在已經(jīng)過(guò)消毒的超凈工作臺(tái)上將經(jīng)流水清洗過(guò)的萬(wàn)象外植體轉(zhuǎn)移至無(wú)菌錐形瓶中，用75%酒精浸泡30 40s，期間不斷輕輕晃動(dòng)錐形瓶，去除附在萬(wàn)象外植體表面氣泡，倒出75%酒精，再用0.l%HgCl2溶液浸泡材料8 lOmin，或用有效氯濃度為l%NaC10溶液浸泡材料10 15min，浸泡期間不斷輕輕晃動(dòng)錐形瓶，去除附在萬(wàn)象外植體表面氣泡，倒出
0.l%HgC12溶液或l%NaC10溶液，用無(wú)菌水清洗經(jīng)過(guò)消毒處理的種子4 5次，處理后的外植體用無(wú)菌水浸泡、備用。3、愈傷誘導(dǎo):在超凈工作臺(tái)上，將經(jīng)過(guò)表面消毒的萬(wàn)象外植體轉(zhuǎn)移至無(wú)菌接種盤中，用無(wú)菌濾紙吸去外植體表面水分，接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA3.0 5.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L中進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，培養(yǎng)溫度25±2°C，光照時(shí)間為12 14h/d，光照強(qiáng)度為 45 60 μ.mol.m 2.s 1O4、不定芽誘導(dǎo):將獲得的 增殖良好的萬(wàn)象愈傷材料轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA1.0 3.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L中，進(jìn)行不定芽，培養(yǎng)溫度25±2°C，光照時(shí)間為12 14h/d,光照強(qiáng)度為45 60 μ.mol.m 2.s、5、不定芽增殖:在無(wú)菌工作臺(tái)上，將愈傷誘導(dǎo)獲得的I 1.5cm高的不定芽2 3個(gè)一叢，利用無(wú)菌的解剖刀將基部輕輕造成一些傷口，接種于不定芽增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，不定芽增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5 1.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L,培養(yǎng)溫度25±2°C,光照時(shí)間為12 14h/d,光照強(qiáng)度為45 60 μ.mol.πΓ2.s'6、壯苗培養(yǎng):高生長(zhǎng)到1.5 2cm左右的叢生不定芽2 3個(gè)一叢，接種到壯苗培養(yǎng)基MS+6-BA0.1 0.2mg/L+NAA0.01 0.lmg/L中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2°C，光照時(shí)間為
12 14h/d,光照強(qiáng)度為 45 60 μ.mol.m 2.s、7、不定芽生根誘導(dǎo):高生長(zhǎng)到3 5cm的叢生不定芽從基部分開(kāi)成單個(gè)，接入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)，生根培養(yǎng)基為MS+IBA0 1.0mg/L或1/2MS+IBA0 1.0mg/L或MS+NAA0 1.0mg/L 或 1/2MS+NAA0 1.0mg/，培養(yǎng)溫度 25±2°C，光照時(shí)間為 12 14h/d，光照強(qiáng)度為45 60 μ.mol.m_2.s_\生根率達(dá)100% 8、組培苗馴化及移栽:不定芽基部長(zhǎng)出3 5條2 3cm的肉質(zhì)不定根后，將生根苗移至溫室，散射光培養(yǎng)5d后打開(kāi)瓶蓋，再培養(yǎng)I 2d，將萬(wàn)象生根植株小心從培養(yǎng)瓶中取出，用自來(lái)水洗凈組培苗基部的培養(yǎng)基，然后在通風(fēng)陰涼處放置2 3天，晾干至組培苗表面稍紅，將萬(wàn)象組培苗，栽入基質(zhì)中，保濕60% -80%以上培養(yǎng)15d，然后在溫室中正常培養(yǎng)，移栽成活率98%以上。最后，應(yīng)當(dāng)指出，以上實(shí)例僅是本發(fā)明較有代表性的例子。顯然，本發(fā)明的技術(shù)方案并不限于上述實(shí)例，還可以有許多變形，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種萬(wàn)象組織培養(yǎng)的方法，其特征在于:該方法包括以下幾個(gè)步驟: 1)外植體的選取及處理:選取萬(wàn)象穗狀花序作為起始材料，收集到的萬(wàn)象穗狀花序剝?nèi)バ∷牖枯嗥賹⒄麄€(gè)花序切成0.5cm長(zhǎng)短，作為組培用外植體； 2)愈傷誘導(dǎo):在超凈工作臺(tái)上，將經(jīng)過(guò)表面消毒的外植體在轉(zhuǎn)移至無(wú)菌接種盤中，用無(wú)菌濾紙吸去外植體表面水分，接種于初代培養(yǎng)基MS+6-BA3.0 5.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L中進(jìn)行初代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2°C，光照時(shí)間為12 14h/d，光照強(qiáng)度為45 60 μ.mo I.m 2.s 1 ； 3)不定芽誘導(dǎo):將獲得的增殖良好的萬(wàn)象愈傷材料轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA1.0 3.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L中，進(jìn)行不定芽，培養(yǎng)溫度25±2°C，光照時(shí)間為12 14h/d，光照強(qiáng)度為45 60 μ.mo I.τα2.s_1 ； 4)不定芽增殖:在無(wú)菌工作臺(tái)上，將愈傷誘導(dǎo)獲得的I 1.5cm高的不定芽2 3個(gè)一叢，利用無(wú)菌的解剖刀將基部輕輕造成一些傷口，接種于不定芽增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，不定芽增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5 1.0mg/L+NAA0.05 0.2mg/L，培養(yǎng)溫度25±2°C，光照時(shí)間為12 14h/d,光照強(qiáng)度為45 60 μ.mo I.m_2.s—1 ； 5)壯苗培養(yǎng):高生長(zhǎng)到1.5 2cm的叢生不定芽2 3個(gè)一叢，接種到壯苗培養(yǎng)基MS+6-BA0.1 0.2mg/L+NAA0.01 0.lmg/L中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25±2°C，光照時(shí)間為12 14h/d,光照強(qiáng)度為 45 60 μ.mo I.m 2.s 1 ; 6)不定芽生根誘導(dǎo):從基部將高生長(zhǎng)到3 5cm的叢生不定芽分開(kāi)成單個(gè)不定芽,接入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)，生根培養(yǎng)基為MS+IBA0 0.5mg/L或1/2MS+IBA0 0.5mg/L,培養(yǎng)溫度25±2°C,光照時(shí)間為12 14h/d,光照強(qiáng)度為45 60 μ.moI.πΓ2 *s_1 ； 7)組培苗馴化及移栽:不定芽基部長(zhǎng)出3 5條I 2cm的不定根后，將組培移至溫室，散射光培養(yǎng)5d后打開(kāi)瓶蓋，再培養(yǎng)I 2d，完成組培苗移栽前馴化，然后將組培苗從培養(yǎng)瓶取出，洗凈組培苗表面瓊脂，晾至表皮稍紅，，栽入基質(zhì)中，保濕60% -80%以上培養(yǎng)15d，然后在溫室中正常培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的萬(wàn)象組織培養(yǎng)的方法，其特征在于:愈傷誘導(dǎo)、不定芽誘導(dǎo)及增殖、壯苗培養(yǎng)、不定芽生根誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基，蔗糖用量為20 40g/L，凝固劑為瓊脂粉，用量為8 9g/L，培養(yǎng)基pH分裝前調(diào)整為5.7 5.8。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種萬(wàn)象組織培養(yǎng)的方法，包括如下步驟培養(yǎng)基的配制、外植體的選取與消毒、愈傷誘導(dǎo)、不定芽誘導(dǎo)、不定芽增值、壯苗培養(yǎng)、不定芽生根誘導(dǎo)、組培苗馴化及移栽?；九囵B(yǎng)基選用MS培養(yǎng)基，蔗糖用量為20～40g/L，凝固劑為瓊脂粉，用量為8～9g/L，培養(yǎng)基pH分裝前調(diào)整為5.7～5.8；愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA3.0～5.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L；不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0～3.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L；不定芽增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5～1.0mg/L+NAA0.05～0.2mg/L；壯苗培養(yǎng)基為MS+6-BA0.1～0.2mg/L+NAA0.01～0.1mg/L；生根培養(yǎng)基為MS+IBA0～1.0mg/L或1/2MS+IBA0～1.0mg/L。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)建立的萬(wàn)象組培快繁技術(shù)體系增殖系數(shù)2～2.5，生根率100％，移栽成活率98％以上。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103141387SQ20131007359
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月8日
發(fā)明者呂永平, 陳志 , 汪一婷, 牟豪杰, 周迪江, 陳劍平 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院