專(zhuān)利名稱(chēng)：家蠶胚胎發(fā)育進(jìn)程的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種家蠶胚胎發(fā)育進(jìn)程的測(cè)定方法，具體涉及一種基于基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量的家蠶胚胎發(fā)育進(jìn)程的精確檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
家蠶(Bombyx moriL.)在我國(guó)已經(jīng)被人工馴養(yǎng)5700多年,屬鱗翅目蠶蛾科完全變態(tài)昆蟲(chóng)，世代包括卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)(蛾)四個(gè)蟲(chóng)態(tài)。家蠶卵從活化到孵化約需要13 14天，人們?yōu)榱藢?shí)現(xiàn)桑蠶卵孵化整齊，蟻蠶強(qiáng)健以及適時(shí)孵化的目的，在13 14天內(nèi)要根據(jù)胚胎的發(fā)育進(jìn)行進(jìn)程對(duì)環(huán)境條件進(jìn)行調(diào)整，這一操作過(guò)程稱(chēng)之為催青。為了便于識(shí)別蠶卵不同的發(fā)育時(shí)期，對(duì)不同發(fā)育階段的家蠶胚胎進(jìn)行編號(hào)(甲:滯育后期、乙1:滯育期后、乙2:伸展期、丙1:最長(zhǎng)期前、丙2:最長(zhǎng)期、丁1:肥厚期、丁 2:突起發(fā)生期、戊1:突起發(fā)達(dá)前期、戊2:突起發(fā)達(dá)后期、戊3:縮短期、己I反轉(zhuǎn)期、己2:反轉(zhuǎn)終了期、己3:氣管形成期、己4:眼點(diǎn)期、己5:轉(zhuǎn)青期)，其中丙2、戊3、己4是三個(gè)重要的時(shí)期，分別為加溫的起點(diǎn)時(shí)期、升溫時(shí)期和確定發(fā)種時(shí)期。催青的條件控制方法有很多種，但目前生產(chǎn)上普遍采用的是簡(jiǎn)化催青法，即把已經(jīng)活化的桑蠶卵在溫度為1(T15°C，濕度75 80%的環(huán)境下進(jìn)行中間感溫7 10天，胚胎發(fā)育到丙2時(shí)期進(jìn)行升溫，用22°C，濕度80 85%催青到戊3，再用25°C，濕度85、0%催青至孵化。為了鑒定胚胎不同的發(fā)育時(shí)期，在生產(chǎn)上需要對(duì)催青過(guò)程中的桑蠶卵進(jìn)行每天解剖，對(duì)胚胎的形態(tài)特征進(jìn)行鑒別，確定發(fā)育進(jìn)程。由于桑蠶卵很小，早期的胚胎上還附著大量的卵黃，影響對(duì)胚胎特征的識(shí)別；另外，解剖桑蠶卵只能是逐粒進(jìn)行鑒定，由于桑蠶卵的孵化控制是一個(gè)批量控制的行為，所以傳統(tǒng)的解剖也存在一定的誤差，即個(gè)體特征不能反應(yīng)整批發(fā)育進(jìn)程。家蠶不僅是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，也是模式昆蟲(chóng)，家蠶胚胎在發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，客觀上需要提供一種對(duì)家蠶胚胎的發(fā)育進(jìn)程的精確定量方法。同時(shí)，具有相同遺傳特征的同一品種家蠶不同批次在制種和感溫處理過(guò)程中存在發(fā)育進(jìn)程差異，而使用常規(guī)檢測(cè)方法對(duì)不同批次進(jìn)行全部解剖需要花費(fèi)大量勞力，所以建立相應(yīng)的省力化檢測(cè)胚胎發(fā)育進(jìn)程的方法很有必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種家蠶胚胎發(fā)育進(jìn)程的測(cè)定方法，以簡(jiǎn)便、精確地確定家蠶胚胎的發(fā)育進(jìn)程。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種家蠶胚胎發(fā)育進(jìn)程的測(cè)定方法，包括以下步驟:
(1)構(gòu)建待檢測(cè)品種的家蠶胚胎的乙酰膽堿酯酶一型相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量和胚胎發(fā)育進(jìn)程的關(guān)聯(lián)關(guān)系的模型；
(2)在待測(cè)定家蠶胚胎中取一個(gè)以上作為樣本，測(cè)定樣本的乙酰膽堿酯酶一型相對(duì)表達(dá)量然后對(duì)照步驟(I)所得模型，根據(jù)待測(cè)樣本的乙酰膽堿酯酶一型的相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量確定出家蠶胚胎的發(fā)育進(jìn)程；
步驟(I)具體包括如下步驟:取待檢測(cè)品種的家蠶胚胎，在催青環(huán)境條件下進(jìn)行催青，根據(jù)常規(guī)方法確定家蠶胚胎的發(fā)育階段；然后提取總RNA，經(jīng)DNA酶處理后，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA ;以肌動(dòng)蛋白基因3為內(nèi)參基因，乙酰膽堿酯酶一型為目的基因分別設(shè)定引物，然后進(jìn)行定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，以乙酰膽堿酯酶一型的表達(dá)量除以肌動(dòng)蛋白基因3的表達(dá)量記為乙酰膽堿酯酶一型相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，然后建立不同發(fā)育階段乙酰膽堿酯酶一型相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量和胚胎發(fā)育進(jìn)程的指數(shù)方程；
步驟(2)具體包括如下步驟:提取待測(cè)定家蠶胚胎樣本的總RNA，經(jīng)DNA酶處理后，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以肌動(dòng)蛋白基因3為內(nèi)參基因，乙酰膽堿酯酶一型為目的基因分別設(shè)定引物，然后進(jìn)行定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，測(cè)得待測(cè)樣本的乙酰膽堿酯酶一型的相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，然后對(duì)照步驟(I)所得模型確定出待測(cè)定家蠶胚胎的發(fā)育進(jìn)程。上述技術(shù)方案中，所述步驟(I)中的發(fā)育階段包括甲、乙1、乙、丙1、丙2、丁1、丁
2、戍1、戍2、戍3、己1、己2、己3、己4、己5共15個(gè)時(shí)期。上述技術(shù)方案中，步驟(I)中每個(gè)發(fā)育階段用于提取總RNA的家蠶胚胎的總質(zhì)量大于50mg。上述技術(shù)方案中，所述家蠶胚胎發(fā)育進(jìn)程的檢測(cè)方法適用于所有品種。上述技術(shù)方案中，步驟(I)中，催青環(huán)境條件的控制方法為常規(guī)方法，并且所述催青環(huán)境與步驟(2)中待檢測(cè)的家蠶胚胎所在的催青環(huán)境相同；在確定胚胎的各個(gè)發(fā)育階段時(shí)采用的是常規(guī)的解剖方法， 為了避免因個(gè)體的不同而導(dǎo)致誤差，每一處理需要同時(shí)重復(fù)識(shí)別10個(gè)以上的胚胎。優(yōu)選的技術(shù)方案中，建立家蠶胚胎的乙酰膽堿酯酶一型相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量和胚胎發(fā)育進(jìn)程的關(guān)聯(lián)關(guān)系的模型時(shí)，以胚胎發(fā)育階段的時(shí)間為橫坐標(biāo)，以胚胎的乙酰膽堿酯酶一型相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量為縱坐標(biāo)，得到一標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。本發(fā)明中，總RNA的提取、DNA酶處理和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA處理根據(jù)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)進(jìn)行。家蠶卵從活化到孵化是胚胎由小到大的逐漸成長(zhǎng)的連續(xù)的過(guò)程，在這個(gè)胚胎逐步發(fā)育的過(guò)程中，卵內(nèi)的大量基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平呈現(xiàn)規(guī)律性的變化。乙酰膽堿酯酶的作用是在神經(jīng)傳遞過(guò)程中水解乙酰膽堿，隨著家蠶胚胎的不斷發(fā)育，家蠶的神經(jīng)系統(tǒng)逐漸成熟，乙酰膽堿酯酶基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量也呈現(xiàn)上升的規(guī)律。家蠶的乙酰膽堿酯酶基因具有兩種類(lèi)型，由于乙酰膽堿酯酶一型(ace I)的表達(dá)量高于乙酰膽堿酯酶二型(ace2)，選定ace I作為標(biāo)志基因，通過(guò)測(cè)定其相對(duì)表達(dá)量精確測(cè)定家蠶胚胎發(fā)育進(jìn)程是可行的。本發(fā)明根據(jù)家蠶acel的開(kāi)放閱讀框堿基的序列以及定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物設(shè)計(jì)的規(guī)則，設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子acel引物一對(duì)，為acel-Pl:5/ - CNCCANTTCNGTNGNTCNNG-3'以及 acel-P2:5' - ACNGTNCTNTGCNTGNANGN -3'，其中 N 為 A、T、C、G 其中之一；同樣設(shè)計(jì)肌動(dòng)蛋白基因 3 (Actin3)引物，為 Actin3-Pl:5' -CGGCTACTCGTTCACTACC -3'以及 Actin3-P2:5' -CCGTCGGGAAGTTCGTAAG -3'。本發(fā)明中取樣存放于液N中保存，避免RNA降解，并且應(yīng)在所有樣品取樣完成后，盡快進(jìn)行總RNA提取以及后面的步驟，存放時(shí)間不宜超過(guò)30天。
本發(fā)明中定量PCR的原理及數(shù)據(jù)分析方法已經(jīng)被J.H.Schefe公開(kāi)(J.H.Schefe, K.E.Lehmann,1.R.Buschmann, T.Unger, H.Funke-Kaiser, Quantitativereal-time RT-PCR data analysis: current concepts and the novel “geneexpression’s CT difference” formula, Journal of Molecular Medicine 2006 (84):901 - 910)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn):
1.本發(fā)明提供了一種家蠶胚胎發(fā)育進(jìn)程的測(cè)定方法，其只需采用少量蠶卵為樣本即可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蠶卵整體的發(fā)育階段進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定，較傳統(tǒng)方法更具有代表性，這對(duì)于以家蠶卵為對(duì)象的生命科學(xué)研究具有重要意義；
2.本發(fā)明的測(cè)定方法是對(duì)蠶卵發(fā)育的綜合評(píng)價(jià)，避免傳統(tǒng)方法的判斷誤差，具有結(jié)果準(zhǔn)確、操作方便、實(shí)用性強(qiáng)的特點(diǎn)，適合推廣應(yīng)用。


圖1為實(shí)施例中acel相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量和胚胎發(fā)育進(jìn)程的相對(duì)關(guān)系曲線(xiàn)圖。圖2為是實(shí)例中的胚胎解剖圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述:
實(shí)施例一:一種家蠶胚胎發(fā)育進(jìn)程的測(cè)定方法 ⑴材料及設(shè)備:
家蠶卵采用蘇州大學(xué)育成的品種(蘇秀X春豐)，催青控制箱為廣東省韶關(guān)鑫騰科普儀器有限公司生產(chǎn)的250D人工氣候箱，天平為日本島津公司生產(chǎn)的萬(wàn)分之一克精度的電子天平，定量PCR儀為ABI7300。樣本:每區(qū)取50mg卵，設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)5000粒平行區(qū)用于解剖鑒定發(fā)育階段。⑵活化、感溫及催青
活化為低溫自然解除，感溫為15°C處理10天，催青按照簡(jiǎn)化催青技術(shù)處理。⑶蠶卵解剖及形態(tài)鑒定
采用堿法(20% K0H)進(jìn)行解剖,將存有50mL堿液的小燒杯置于酒精燈燒開(kāi)后移去酒精燈，將存有50粒左右的桑蠶卵置于堿液5秒，經(jīng)溫水(35°C )漂洗后放于存有溫水9cm的二重皿內(nèi)，用膠頭吸管反復(fù)沖洗，直到胚胎逸出，取出胚胎用顯微鏡進(jìn)行形態(tài)鑒定。⑷定量PCR分析
定量PCR引物的合成:根據(jù)家蠶acel的開(kāi)放閱讀框堿基的序列和定量PCR引物設(shè)計(jì)的規(guī)則，設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子引物一對(duì)(分別為acel-Pl:5' - CNCCANTTCNGTNGNTCNNG -3'、acel-P2:5' - ACNGTNCTNTGCNTGNANGN -3' ) (N 為 A、T、C、G 其中之一)；選取 Actin3 為內(nèi)參基因，同樣設(shè)計(jì)其引物(Actin3-Pl:5' -CGGCTACTCGTTCACTACC -3'和 Actin3_P2:5' -CCGTCGGGAAGTTCGTAAG -3')?？俁NA的提取、DNA酶 處理和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA:總RNA的提取、DNA酶處理和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA處理根據(jù)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)進(jìn)行。定量PCR檢測(cè):采用熒光染料SYBR Green I在ABI 7300上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系:SYBR Premix Ex Taq (2X) 10 ML，上游引物(10 MmoI/L) 0.4 ML，下游引物(10 MmoI/L)0.4 ML，ROX Reference Dye (50 X) 0.4 ML，模板 2.0 ML，dH20 6.8 ML，總體系 2O ML15PCR程序:兩步法 PCR 擴(kuò)增，50 V 2 min ；95 °C預(yù)變性 I min ;95 V 15 s，60 V 31 s，45 個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。(5)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
分別把目標(biāo)基因和內(nèi)參基因進(jìn)行稀釋10倍、100倍和1000倍，按照J(rèn).H.Schefe公開(kāi)的方法，根據(jù)測(cè)定得的Ct值制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，acel的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y = -0.6869x+26.923，R2 = 0.9988 ；Actin-3 的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為 Y = -0.7988x+22.985，R2 = 0.9987。根據(jù)各樣本測(cè)定的Ct值，經(jīng)三組平均后，分別求出對(duì)應(yīng)的log值，再根據(jù)2 一AACT法求出對(duì)應(yīng)的表達(dá)量如下表。表I蘇秀X春豐胚胎各發(fā)育特征與acel相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量關(guān)系
權(quán)利要求
1.一種家蠶胚胎發(fā)育進(jìn)程的測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)構(gòu)建待檢測(cè)品種的家蠶胚胎的乙酰膽堿酯酶一型相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量和胚胎發(fā)育進(jìn)程的關(guān)聯(lián)關(guān)系的模型； (2)在待測(cè)定家蠶胚胎中取一個(gè)以上作為樣本，測(cè)定樣本的乙酰膽堿酯酶一型相對(duì)表達(dá)量，然后對(duì)照步驟(I)所得模型，根據(jù)待測(cè)樣本的乙酰膽堿酯酶一型的相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量確定出家蠶胚胎的發(fā)育進(jìn)程； 步驟(I)具體包括如下步驟:取待檢測(cè)品種的家蠶胚胎，在催青環(huán)境條件下進(jìn)行催青，根據(jù)常規(guī)方法確定家蠶胚胎的發(fā)育階段；然后提取總RNA，經(jīng)DNA酶處理后，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA ;以肌動(dòng)蛋白基因3為內(nèi)參基因，乙酰膽堿酯酶一型為目的基因分別設(shè)定引物，然后進(jìn)行定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，以乙酰膽堿酯酶一型的表達(dá)量除以肌動(dòng)蛋白基因3的表達(dá)量記為乙酰膽堿酯酶 一型相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，然后建立不同發(fā)育階段乙酰膽堿酯酶一型相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量和胚胎發(fā)育進(jìn)程的指數(shù)方程； 步驟(2)具體包括如下步驟:提取待測(cè)定家蠶胚胎樣本的總RNA，經(jīng)DNA酶處理后，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以肌動(dòng)蛋白基因3為內(nèi)參基因，乙酰膽堿酯酶一型為目的基因分別設(shè)定引物，然后進(jìn)行定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，得到待測(cè)樣本的乙酰膽堿酯酶一型的相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，然后對(duì)照步驟(I)所得模型確定出待測(cè)定家蠶胚胎的發(fā)育進(jìn)程。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家蠶胚胎發(fā)育進(jìn)程的測(cè)定方法，其特征在于:所述步驟(I)中的發(fā)育階段包括甲、乙1、乙、丙1、丙2、丁1、丁 2、戊1、戊2、戊3、己1、己2、己3、己4、己5共15個(gè)時(shí)期。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的家蠶胚胎發(fā)育進(jìn)程的測(cè)定方法，其特征在于:所述步驟(I)中每個(gè)發(fā)育階段用于提取總RNA的家蠶胚胎的總質(zhì)量大于50mg。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種家蠶胚胎發(fā)育進(jìn)程的測(cè)定方法，具體包括以下步驟(1)構(gòu)建待檢測(cè)品種的家蠶胚胎的一型乙酰膽堿酯酶(ace1)相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量和胚胎發(fā)育進(jìn)程的關(guān)聯(lián)關(guān)系的模型；(2)在待測(cè)定家蠶胚胎中取一個(gè)以上作為樣本,測(cè)定樣本的ace1相對(duì)表達(dá)量然后對(duì)照步驟(1)所得模型,根據(jù)待測(cè)樣本的ace1的相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)量確定出家蠶胚胎的發(fā)育進(jìn)程。該方法可以通過(guò)對(duì)少量蠶卵胚胎的發(fā)育進(jìn)程進(jìn)行測(cè)定而精確定量蠶卵整體的發(fā)育階段，減少人為操作帶來(lái)的誤差，簡(jiǎn)化了測(cè)定流程，為家蠶胚胎的分子生物學(xué)研究提供發(fā)育進(jìn)程的鑒定方法。
文檔編號(hào)A01K67/04GK103070141SQ20131005995
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月26日
發(fā)明者李兵, 方藝璇, 王彬彬, 顧芝亞, 沈衛(wèi)德, 洪法水 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)