專(zhuān)利名稱(chēng)：一種花生離體誘變定向篩選耐鹽體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及花生離體誘變定向篩選方法，具體地說(shuō)，是涉及一種花生離體誘變定向篩選耐鹽體的方法。
背景技術(shù)：
隨著灌溉地和設(shè)施栽培面積的不斷擴(kuò)大，海水倒灌形成海濱灘涂，鹽堿地有不斷擴(kuò)大的趨勢(shì)，可利用的耕地資源逐年減少。鹽潰土?xí)绊懼脖簧L(zhǎng)，造成農(nóng)作物減產(chǎn)或絕收，同時(shí)間接造成生態(tài)環(huán)境的惡化?；ㄉ俏覈?guó)重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物之一，花生是一種抗旱耐瘠、適應(yīng)性強(qiáng)的作物，在世界各地種植極其廣泛，但花生不是耐鹽作物。我國(guó)人均耕地面積少，保證糧食安全是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重中之重，近年糧食種植面積不斷擴(kuò)大，而花生種植面積增加的很少，與此同時(shí)我國(guó)尚有大面積的鹽堿地和沿海灘涂地有待開(kāi)發(fā)，因此篩選耐鹽花生種質(zhì)、培育耐鹽花生品種具有重要的意義。然而花生栽培種中缺乏高耐鹽的品種資源，靠雜交育種難以獲得耐鹽后代，因此高產(chǎn)耐鹽品種的選育一直是一個(gè)難以解決的問(wèn)題。誘變技術(shù)的利用能夠產(chǎn)生自然界不存在的新性狀、新類(lèi)型，利用誘變與組織培養(yǎng)相結(jié)合進(jìn)行定向篩選耐鹽體，能節(jié)省人力、物力、財(cái)力，并且不受時(shí)間和空間限制。因此，離體誘變定向篩選耐鹽體是獲得耐鹽新種質(zhì)的有效手段。近年來(lái)，極少數(shù)報(bào)道有關(guān)花生離體誘變研究，但離體誘變定向篩選耐鹽體目前未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種花生離體誘變定向篩選耐鹽體的方法，可以解決花生遺傳基礎(chǔ)狹窄、缺乏耐鹽性品種資源、 常規(guī)育種難以培育高產(chǎn)耐鹽花生品種的問(wèn)題。為達(dá)到解決上述問(wèn)題的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):一種花生離體誘變定向篩選耐鹽體的方法，包括如下步驟:(I)將顆粒飽滿(mǎn)的花生種子去子葉后的種胚進(jìn)行表面消毒；(2)在無(wú)菌條件下分離所述種胚的胚小葉作為外植體，接種到體胚誘導(dǎo)及誘變培養(yǎng)基中，進(jìn)行誘變培養(yǎng)27 30天，部分外植體形成體胚；所述體胚誘導(dǎo)及誘變培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加r5mg/L平陽(yáng)霉素和5 10mg/L2，4-D ；(3)將形成體胚的外植體轉(zhuǎn)移至體胚萌發(fā)及篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進(jìn)行耐鹽定向篩選，得到耐鹽苗；所述體胚萌發(fā)及篩選培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加15 20g/LNaCl 和 4 6mg/L BAP ；(4)在體胚萌發(fā)及篩選培養(yǎng)基上獲得的耐鹽苗生長(zhǎng)至1.5 2.5cm時(shí)，便可進(jìn)行無(wú)菌嫁接，以耐鹽苗為接穗，無(wú)菌萌發(fā)的花生實(shí)生苗為砧木，嫁接苗無(wú)菌培養(yǎng):T4天后，移栽于育苗基質(zhì)中，經(jīng)馴化后移栽到田間。對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(3)中采用加篩選壓和不加篩選壓各培養(yǎng)4w進(jìn)行交替培養(yǎng)。對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(3)中體胚萌發(fā)階段的NaCl篩選濃度為15g/L，繼代培養(yǎng)時(shí)NaCl抗逆篩選濃度為20g/L。對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述步驟(2)和(3)中培養(yǎng)基pH調(diào)整至5.8，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)室溫度為25 27°C、光照強(qiáng)度為2000 3000Lx、光照時(shí)間為12 14h/d。對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述步驟(4)中以苗齡11-13天的花生無(wú)菌苗為砧木，耐鹽苗為接穗進(jìn)行無(wú)菌嫁接。對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述體胚誘導(dǎo)及誘變培養(yǎng)基為MS+10mg/L2, 4-D+4mg/L平陽(yáng)霉素+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂；所述體胚萌發(fā)及篩選培養(yǎng)基為MS+4mg/LBAP+30g/L 蔗糖 +8g/L 瓊脂 +15g/L 或 20g/L NaCl。
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對(duì)上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn):所述馴化培養(yǎng)的條件為2(T22°C，馴化室培養(yǎng)18 21天。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:1、本發(fā)明以花生成熟種子胚的胚小葉為外植體，在基本培養(yǎng)基中添加r5mg/L平陽(yáng)霉素和5 10mg/L2，4-D (氯化苯氧乙酸類(lèi)除草劑)進(jìn)行誘變處理，形成體胚的外植體轉(zhuǎn)移到添加15 20g/L NaCl和r6mg/L BAP (6-芐氨基嘌呤)的培養(yǎng)基上促使體胚萌發(fā)成苗，同時(shí)進(jìn)行定向篩選耐鹽體。獲得的耐鹽體(NaCl耐性植株)經(jīng)嫁接馴化后移栽田間，獲得的成熟種子次年播種田間，與誘變親本相比，大部分耐鹽體M2代植株發(fā)生明顯變異和分離，部分單株結(jié)果數(shù)明顯多于誘變親本。耐鹽體的M3代種子鹽脅迫下(0.7%NaCl溶液)發(fā)芽試驗(yàn)，30%以上發(fā)芽率極顯著高于誘變親本。SSR檢測(cè)結(jié)果顯示耐鹽體的M3代植株與誘變親本的多態(tài)性很高，所有被檢測(cè)植株都有4個(gè)以上位點(diǎn)不同于誘變親本。2、本發(fā)明以花生成熟種子作為誘變材料可不受季節(jié)限制，常年可以進(jìn)行誘變處理和定向篩選，操作方便?？梢詣?chuàng)造花生耐鹽新種質(zhì)，豐富花生遺傳基礎(chǔ)，克服因花生栽培種中缺乏高耐鹽性種質(zhì)資源而使得高產(chǎn)耐鹽新品種選育難以突破的困難。3、利用離體誘變結(jié)合組織培養(yǎng)定向篩選耐鹽體，篩選過(guò)程于培養(yǎng)基中進(jìn)行，大量不具有耐鹽性的培養(yǎng)材料被淘汰，可節(jié)省大量的人力、物力、財(cái)力；耐鹽體的再生通過(guò)胚胎發(fā)生途徑，體細(xì)胞胚起源于一個(gè)細(xì)胞，可避免耐鹽體的嵌合性。


圖1表明本發(fā)明中NaCl對(duì)體胚萌發(fā)的影響，a:未添加NaCl的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基；b:添加15g/L NaCl的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基；c:添加20g/L NaCl的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基。圖2表明本發(fā)明中繼代培養(yǎng)時(shí)NaCl對(duì)體胚萌發(fā)成苗的影響，a:未添加NaCl的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基；b:添加20g/L NaCl的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基；c:添加25g/LNaCl的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基。圖3是本發(fā)明中花育22號(hào)胚小葉離體誘變、耐鹽定向篩選、耐鹽苗(體)嫁接及結(jié)實(shí)；a:在添加4mg/L PYM的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上形成的體胚及褐化愈傷組織；b:在添加15g/LNaCl的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上成活的萌發(fā)體胚及褐化愈傷組織；c:先后在添加15g/LNaCl和20g/LNaCl的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上篩選成活的耐鹽小苗；d:嫁接的耐鹽苗；E:耐鹽苗結(jié)果。圖4是本發(fā)明中花育22號(hào)胚小葉離體誘變及NaCl定向篩選獲得的耐鹽體M2代表型及其分離情況；a:13號(hào)耐鹽體后代苗期植株大小分離(播種6w);b:27號(hào)耐鹽體后代株高明顯分離(播種9w) ；c:10號(hào)耐鹽體后代的其中I株突變?yōu)槊苤?、半匍匐型、交替開(kāi)花(播種9w) ；d:誘變親本花育22號(hào)株型直立、連續(xù)開(kāi)花(播種9周)。圖5是本發(fā)明中誘變親本花育22號(hào)和耐鹽體M2代植株結(jié)果(M3代莢果)及分離情況；a、花育22號(hào)和27號(hào)耐鹽體M2代田間植株及結(jié)果，其中27-2突變?yōu)槊苤?、結(jié)果多；b:花育22號(hào)莢果和27號(hào)耐鹽體后代表現(xiàn)的莢果大小、果型分離，27-2結(jié)果多；c:10號(hào)耐鹽體后代莢果突變?yōu)榇樾?，花?2號(hào)果型為普通型；d:10號(hào)耐鹽體后代種皮突變?yōu)樽仙ㄓ?2號(hào)種皮為粉紅色；e:21號(hào)耐鹽體后代莢果形狀、大小明顯變異和分離；f:5號(hào)耐鹽體后代莢果形狀、大小明顯變異和分離(莢果圖片右下角為誘變親本花育22號(hào)-Huayu22)。圖6是本發(fā)明中花育22號(hào)及耐鹽體M3代種子在0.7%NaCl溶液中催芽7d后發(fā)芽情況；a:誘變親本花育22號(hào)；b:10號(hào)耐鹽體M3代種子；c:24號(hào)耐鹽體M3代種子。圖7是本發(fā)明中花育22號(hào)和11個(gè)耐鹽體M3代SSR電泳圖；引物對(duì)為PM348 ；CK:誘變親本花育22號(hào)；其他為耐鹽體的M3代。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例1本發(fā)明所述花生離體誘變定向篩選耐鹽體的方法具體包括如下步驟:1、培養(yǎng)基的制備( I)制備體胚誘導(dǎo)及誘變培養(yǎng)基:選取MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在此MS培養(yǎng)基中添加平陽(yáng)霉素和2，4-D形成體胚誘導(dǎo)及誘變培養(yǎng)基。平陽(yáng)霉素的添加量為r5mg/L，2，4-D的添加量為5 10mg/L。本實(shí)施例中體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+10mg/L2，4_D+4mg/L平陽(yáng)霉素+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂；將所述體胚誘導(dǎo)及誘變培養(yǎng)基的pH調(diào)至5.8，在培養(yǎng)室溫度為25 27°C、光照強(qiáng)度為2000 3000Lx、每日光照為12 14h的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。誘變和體胚誘導(dǎo)同時(shí)進(jìn)行。平陽(yáng)霉素(PYM)是一種抗生素，屬于博萊霉素的一類(lèi)，是博萊霉素的A5組分，它作為誘變劑具有安全、高效、誘變頻率高、范圍大等特點(diǎn)。2，4-D是一種氯化苯氧乙酸類(lèi)除草齊U，也可用作植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，是用于誘導(dǎo)愈傷組織形成的常用生長(zhǎng)素，在本發(fā)明中用來(lái)誘導(dǎo)體胚形成。(2)制備體胚萌發(fā)及篩選培養(yǎng)基:選取MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在此MS培養(yǎng)基中添加NaCl和6-芐氨基嘌呤(BAP)形成體胚萌發(fā)及耐鹽定向篩選培養(yǎng)基，NaCl的添加量為15 20g/L，BAP的添加量為r6mg/L。本實(shí)施例中體胚萌發(fā)及篩選培養(yǎng)基為MSB5+15 20g/L NaCl+4mg/L BAP+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂，將所述體胚萌發(fā)及篩選培養(yǎng)基的pH調(diào)至
5.8，在培養(yǎng)室溫度為25 27°C、光照強(qiáng)度為2000 3000Lx、每日光照為12 14h的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。耐鹽定向篩選和體胚萌發(fā)同時(shí)進(jìn)行。2、NaCl篩選濃度的確定以NaCl作為耐鹽篩選壓力添加于培養(yǎng)基中進(jìn)行定向篩選耐鹽體。外植體材料為目前廣泛推廣栽培的花生品種花育22號(hào)，選取籽粒飽滿(mǎn)的種子去子葉后的種胚作為試驗(yàn)材料。
花生各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期對(duì)逆境的耐受性不同。同理，組織培養(yǎng)條件下各階段對(duì)逆境脅迫的耐受程度亦不同。以NaCl模擬逆境條件，添加于培養(yǎng)基中進(jìn)行定向篩選耐鹽體，研究了花生胚小葉組織培養(yǎng)通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑再生植株的二個(gè)不同階段中NaCl的最佳篩選濃度。處理I，在未添加平陽(yáng)霉素的體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上形成體胚的外植體轉(zhuǎn)移到體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，體胚萌發(fā)培養(yǎng)基中添加0，10, 15，20, 25g/LNaCl ;處理II，在未添加NaCl的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上獲得的已經(jīng)萌發(fā)的體胚叢，轉(zhuǎn)移到新鮮的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加0，15，20，25，30g/L NaCl。處理I，在未添加平陽(yáng)霉素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上形成體胚的外植體轉(zhuǎn)移到添加NaCl(0，10，15, 20, 25g/L)的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)4w后試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，從圖1中可以看出，在未添加NaCl的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上(圖1a所示)，體胚萌發(fā)正常；在添加15g/LNaCl的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上(圖1b所示)，體胚雖沒(méi)有完全致死，但是已嚴(yán)重抑制其生長(zhǎng)；在添加20g/LNaCl的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上(圖1c所示)體胚完全褐化死亡。因此，以15g/L NaCl作為此培養(yǎng)階段的耐鹽篩選濃度。處理II，在體胚萌發(fā)階段不進(jìn)行耐鹽篩選，而進(jìn)行正常的培養(yǎng)。胚小葉外植體在未添加平陽(yáng)霉素的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)4w后形成體胚叢，將形成體胚叢的外植體轉(zhuǎn)移到未添加NaCl的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上再培養(yǎng)4w，大部分體胚萌發(fā)。然后將已萌發(fā)的體胚叢轉(zhuǎn)移到新鮮的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加0，15，20，25，30g/L NaCl。4w后試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，從圖2中可以看出，在未添加NaCl的培養(yǎng)基上(圖2a所示)，體胚萌發(fā)長(zhǎng)成的小苗生長(zhǎng)正常；在添加20g/L NaCl的培養(yǎng)基上(圖2b所示)，由體胚萌發(fā)長(zhǎng)成的小苗生長(zhǎng)嚴(yán)重受到抑制；在添加25g/L NaCl的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上(圖2c)體胚萌發(fā)長(zhǎng)成的小苗完全褐化死亡。因此，以20g/L NaCl作為此培養(yǎng)階段的耐鹽篩選濃度。3、平陽(yáng)霉素誘變處理以花育22號(hào)種子胚小葉為誘變培養(yǎng)材料，以平陽(yáng)霉素(PYM)作為誘變劑，添加于體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘變處理。

選取籽粒飽滿(mǎn)的花育22號(hào)種子去子葉，將種胚置于75%的酒精浸泡20s，再用
0.1%的升汞浸泡lOmin，進(jìn)行表面消毒，用無(wú)菌水漂洗5次后，置于裝有無(wú)菌水的廣口瓶中浸泡10 14h。取出經(jīng)表面消毒浸泡好的種胚，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中分離胚小葉，然后接種到添加4mg/L PYM和10mg/L2，4-D的體胚誘導(dǎo)及誘變培養(yǎng)基上培養(yǎng)4w，進(jìn)行誘變處理及誘導(dǎo)體胚的形成?；ㄓ?2號(hào)種子胚小葉培養(yǎng)在添加4mg/L PYM的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘變處理。培養(yǎng)IOd后，外植體開(kāi)始形成乳白色愈傷組織，培養(yǎng)4w，約50%的愈傷組織逐漸褐化或者形成玻璃化愈傷組織，另有部分能夠形成體胚，如圖3a所示。4、NaCl耐性苗的定向篩選誘變培養(yǎng)4w后，將形成體胚的外植體轉(zhuǎn)移到體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上促使體胚萌發(fā)，并進(jìn)行定向篩選耐鹽體。利用上述確定的NaCl篩選濃度，進(jìn)行定向篩選耐鹽體。首先在體胚萌發(fā)培養(yǎng)基中添加15g/L NaCl，繼代培養(yǎng)時(shí)增加到20g/L。為避免篩選的培養(yǎng)材料生長(zhǎng)過(guò)慢或褐變，在體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上篩選時(shí)，采用加篩選壓和不加篩選壓各培養(yǎng)4w進(jìn)行交替培養(yǎng)。具體為:將形成有體胚的外植體轉(zhuǎn)移至體胚萌發(fā)及篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行耐鹽定向篩選及體胚萌發(fā)培養(yǎng)。首先選用添加15g/LNaCl的篩選培養(yǎng)基,培養(yǎng)4周后,大部分外植體及體胚死亡，僅有少數(shù)存活，如圖3b所示。經(jīng)篩選成活的帶有體胚的外植體轉(zhuǎn)移到無(wú)篩選壓的體胚萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周，使其恢復(fù)生長(zhǎng)，接觸培養(yǎng)基的部分形成大量綠色致密的愈傷組織。之后再轉(zhuǎn)移到添加20g/LNaCl的篩選培養(yǎng)基上。篩選培養(yǎng)4周后，再轉(zhuǎn)移到無(wú)篩選壓的培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周，再用添加20g/L NaCl的培養(yǎng)基篩選，如此交替進(jìn)行，直至成苗，如圖3c所示，最終獲得了花育22號(hào)耐鹽苗(體)。5、耐鹽體的嫁接與移栽上述篩選獲得的耐鹽體生長(zhǎng)至1.5^2.5cm時(shí)，從基部切下作為接穗，以無(wú)菌萌發(fā)If 13天的花生實(shí)生苗為砧木在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行無(wú)菌嫁接，如圖3d所示。嫁接苗無(wú)菌培養(yǎng):T4天后，移栽于育苗基質(zhì)中，在馴化室培養(yǎng)18 21天后，移栽田間。移栽初期搭遮蔭網(wǎng)，根據(jù)需要澆水保持土壤濕度。2 3周嫁接苗成活后，撤去遮蔭網(wǎng)，按常規(guī)田間管理。成熟后分單株收獲莢果，共有26株耐鹽體得到了 M2代種子。如圖3e所示。6、耐鹽體M2代表型變異和分離情況2012年將單株收獲的種子(M2代)播種于大田，以誘變親本花育22號(hào)作對(duì)照。苗期、生長(zhǎng)發(fā)育期及成熟收獲后觀(guān)察結(jié)果顯示，26個(gè)耐鹽體的后代(M2代)中，23個(gè)耐鹽體的后代在生長(zhǎng)勢(shì)、株型、開(kāi)花習(xí)性，莢果形狀、種皮顏色等方面與誘變親本不同，明顯表現(xiàn)出變異及性狀發(fā)生分離。苗期大部分耐鹽體后代的小苗生長(zhǎng)勢(shì)、棵大小明顯表現(xiàn)出分離，有的單株生長(zhǎng)發(fā)育慢，開(kāi)花較晚，如圖4a所示，之后有的植株高矮也有明顯差異，如圖4b所示。10號(hào)耐鹽體后代的其中2株突變?yōu)榻惶骈_(kāi)花、半匍匐型，如圖4c所示。27號(hào)耐鹽體后代的其中I株(27-2)突變?yōu)槊苤Γ偡种?shù)22條，同一植株后代的其他單株總分枝數(shù)5 10條不等，如圖5a所示。而誘變親本花育22號(hào)株型直立、疏枝，連續(xù)開(kāi)花，總分枝數(shù)If 12條，如圖4d和圖5a所示。
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莢果性狀觀(guān)察結(jié)果顯示，耐鹽體后代莢果有的變大，而大部分莢果變小。27號(hào)耐鹽體的后代之間不但分枝數(shù)存在明顯差異，并且單株結(jié)果數(shù)和莢果大小也存在明顯差異，其中27-2單株結(jié)果數(shù)明顯多于同一植株后代的其他單株結(jié)果數(shù)，也明顯比誘變親本花育22號(hào)單株結(jié)果數(shù)多，如圖5a和圖5b所示。10號(hào)耐鹽體的后代除株型和開(kāi)花習(xí)性明顯變異和分離外，莢果形狀均突變?yōu)榇樾?，每個(gè)莢果3-4粒種子，種皮顏色均突變?yōu)樽霞t色，如圖5c和圖5d所示。其他耐鹽體的后代莢果有的突變?yōu)楹J形，有的(蠶)繭形，還有的蜂腰形，如圖5e和圖5f所示。而誘變親本花育22號(hào)莢果為普通形，雙仁果(每個(gè)莢果2粒種子)，種皮粉紅色，如圖5所示(圖5d的右邊及圖5b、c、e、f右下方為花育22號(hào))。7、耐鹽體后代的耐鹽性鑒定選取耐鹽體后代(M3)和誘變親本花育22號(hào)籽粒飽滿(mǎn)的種子進(jìn)行耐鹽鑒定。以
0.7%NaCl作為鹽脅迫，設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)約15粒種子。首先用0.7%NaCl溶液浸泡8h，然后倒掉浸泡液，將種子放于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿底部和上部各放I張濾紙，加適量0.7%NaCl溶液，之后每天更換同樣溶液。以蒸餾水作為空白對(duì)照，每個(gè)材料也均設(shè)3次重復(fù)。試驗(yàn)在25 27°C，每日13h光照條件下進(jìn)行。處理7天后調(diào)查統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。以胚根長(zhǎng)大(等)于種子長(zhǎng)為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)。鹽脅迫處理處理7d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，結(jié)果表明，鹽脅迫下參試的18個(gè)耐鹽體的后代中，10號(hào)、24號(hào)、19號(hào)、20號(hào)、6號(hào)、2號(hào)耐鹽體M3代種子的發(fā)芽率均極顯著高于親本，特別是10號(hào)和24號(hào)耐鹽體M3代種子的發(fā)芽率均超過(guò)50%，而誘變親本花育22號(hào)種子發(fā)芽率僅為6.7%，如圖6和表I所示。以蒸餾水為空白對(duì)照情況下，18個(gè)耐鹽體M3代種子及誘變親本花育22號(hào)種子發(fā)芽率均在88%以上，各材料之間無(wú)顯著性差異，如表2所示。結(jié)果說(shuō)明，鹽脅迫情況下種子發(fā)芽率的差異是由于其對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)不同所致，并非種子質(zhì)量(種子本身發(fā)芽率)的區(qū)別。表I耐鹽體M3代種子及花育22號(hào)種子在0.7%NaCl鹽溶液中催芽7天的發(fā)芽率(Duncan新復(fù)極差法)
權(quán)利要求
1.一種花生離體誘變定向篩選耐鹽體的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)將顆粒飽滿(mǎn)的花生種子去子葉后的種胚進(jìn)行表面消毒； (2)在無(wú)菌條件下分離所述種胚的胚小葉作為外植體，接種到體胚誘導(dǎo)及誘變培養(yǎng)基中，進(jìn)行誘變培養(yǎng)27 30天，部分外植體形成體胚；所述體胚誘導(dǎo)及誘變培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加4 5mg/L平陽(yáng)霉素和5 10mg/L 2，4-D ； (3)將形成體胚的外植體轉(zhuǎn)移至體胚萌發(fā)及篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進(jìn)行耐鹽定向篩選，得到耐鹽苗；所述體胚萌發(fā)及篩選培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加15 20g/LNaCl 和 4 6mg/L BAP ； (4)在體胚萌發(fā)及篩選培養(yǎng)基上獲得的耐鹽苗生長(zhǎng)至1.5 2.5cm時(shí)，便可進(jìn)行無(wú)菌嫁接，以耐鹽苗為接穗，無(wú)菌萌發(fā)的花生實(shí)生苗為砧木，嫁接苗無(wú)菌培養(yǎng)3 4天后，移栽于育苗基質(zhì)中，經(jīng)馴化后移栽到田間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生離體誘變定向篩選耐鹽體的方法，其特征在于:所述步驟(3)中采用加篩選壓和不加篩選壓各培養(yǎng)4w進(jìn)行交替培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生離體誘變定向篩選耐鹽體的方法，其特征在于:所述步驟(3)中體胚萌發(fā)階段的NaCl篩選濃度為15g/L，繼代培養(yǎng)時(shí)NaCl抗逆篩選濃度為20g/L0
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的花生離體誘變定向篩選耐鹽體的方法，其特征在于:所述步驟(2)和(3)中培養(yǎng)基pH調(diào)整至5.8，培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)室溫度為25 27°C、光照強(qiáng)度為2000 3000Lx、光照時(shí)間為12 14h/d。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的花生離體誘變定向篩選耐鹽體的方法，其特征在于:所述步驟(4)中以苗齡11-13天的花生無(wú)菌苗為砧木，耐鹽苗為接穗進(jìn)行無(wú)菌嫁接。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生離體誘變定向篩選耐鹽體的方法，其特征在于:所述體胚誘導(dǎo)及誘變培養(yǎng)基為MS+10 mg/L 2，4-D+4mg/L平陽(yáng)霉素+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂；所述體胚萌發(fā)及篩選培養(yǎng)基為MS+4 mg/L BAP+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂+15g/L或20g/L NaCl。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花生離體誘變定向篩選耐鹽體的方法，其特征在于:所述馴化培養(yǎng)的條件為2(T22°C，馴化室培養(yǎng)18 21天。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種花生離體誘變定向篩選耐鹽體的方法，主要步驟是將花生種胚表面消毒；分離胚小葉接種到添加2,4-D和平陽(yáng)霉素的體胚誘導(dǎo)及誘變培養(yǎng)基中誘變培養(yǎng)處理；將成活的形成體胚的外植體轉(zhuǎn)移到添加了BAP和NaCl的體胚萌發(fā)及篩選培養(yǎng)基上，進(jìn)行定向篩選耐鹽體。本發(fā)明利用離體誘變結(jié)合組織培養(yǎng)定向篩選耐鹽體，可節(jié)省大量的人力、物力、財(cái)力；耐鹽體的再生通過(guò)胚胎發(fā)生途徑，體細(xì)胞胚起源于一個(gè)細(xì)胞，可避免耐鹽體的嵌合性。本發(fā)明以花生成熟種子作為誘變材料可不受季節(jié)限制，操作方便，可以創(chuàng)造花生耐鹽新種質(zhì)，豐富花生遺傳基礎(chǔ)，克服因花生栽培種中缺乏高耐鹽性種質(zhì)資源而使得高產(chǎn)耐鹽新品種選育難以突破的困難。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103070076SQ201310045768
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月5日
發(fā)明者王晶珊, 隋炯明, 喬利仙, 趙明霞, 孫海燕, 紀(jì)瑞瑞, 陳靜, 胡曉輝, 郭寶太 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)