專利名稱：：一種水稻病原菌誘導(dǎo)啟動子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，提供了一個(gè)水稻病原菌誘導(dǎo)啟動子，可用于通過植物基因工程技術(shù)改善植物抗病性和其他有益生產(chǎn)性狀。
背景技術(shù)：
：由真菌、細(xì)菌、病毒以及線蟲引起的植物疾病為作物生產(chǎn)帶來巨大影響。植物擁有兩套不同的抗性機(jī)制:一是被動防御機(jī)制，是指一些抗性相關(guān)的形態(tài)結(jié)構(gòu)，如表皮和堅(jiān)硬的細(xì)胞壁(BradyJD,FryS.Formationofd1-1sodityrosineandlossofisodityrosineinthecellwallsoftomatocell—suspensionculturestreatedwithfungalelicitorsorH2O2.PlantPhysiol1997,115:87-92.)。另一個(gè)是主動防御，主動防御是抗性基因與病原菌識別并且互作引起的。病原物無毒基因(avr)編碼的激發(fā)子與寄主植物響應(yīng)的抗病基因(R)編碼激發(fā)子的受體分子相互作用產(chǎn)生抗病反應(yīng)。植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)一般經(jīng)歷信號識別、信號傳導(dǎo)、防衛(wèi)基因表達(dá)三個(gè)環(huán)節(jié)。主動防御中所有類型的抗病機(jī)制都要依靠防衛(wèi)基因表達(dá)，抵抗的有效性取決于基因表達(dá)的時(shí)空特性。正是由于防衛(wèi)基因的時(shí)空表達(dá)特性，其啟動子往往具有某些特殊的順式作用元件，人們可以利用防衛(wèi)基因、尤其是其順式元件為基因工程改良提供有利的工具。植物中絕大部分抗病基因都編碼具有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)以及亮氨酸重復(fù)的蛋白(NBS-LRR),(McHaleL,TanX,KoehlP，MichelmoreRff.PlantNBS-LRRproteins!adaptableguards.GenomeBiol2006，7:212.)。但是對于這類基因的啟動子研究還比較少。植物基因啟動子是重要的順式作用元件，是位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游區(qū)的DNA序列，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心。從1983年第一株轉(zhuǎn)基因植物問世以來，啟動子一直是基因工程的研究熱點(diǎn)，選擇合適并有效表達(dá)的啟動子將為基因工程的研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。組織特異啟動子可以使外源基因的表達(dá)只發(fā)生在某些特定的器官或組織部位，并往往表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)特性；誘導(dǎo)型啟動子可以使外源基因?qū)δ承┬盘柈a(chǎn)生響應(yīng)，只在特殊信號刺激下表達(dá)。這些啟動子的最大優(yōu)點(diǎn)是:它克服了組成型啟動子啟動的外源基因在受體植物中非特異性的持續(xù)、高效表達(dá)所造成的浪費(fèi)，并且滿足某些需要外源基因特異表達(dá)的需求。組織特異性或誘導(dǎo)表達(dá)啟動子一直以來都是植物基因工程研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前，已經(jīng)找到一些組織特異性或誘導(dǎo)表達(dá)啟動子，并發(fā)現(xiàn)其上存在的相應(yīng)的順式因子，為后來的啟動子研究奠定了基礎(chǔ)。煙草的Sar8.2b基因受水楊酸(SA)誘導(dǎo)，在其啟動子上發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)順式作用因子，包括as-1因子、GT21和Dof結(jié)合序列。SA誘導(dǎo)Sar8.2b基因表達(dá)可能存在于-728至_927bp和-197至_351bp的區(qū)域的順式因子中(SongF，GoodmanRM.CloningandidentificationofthepromoterofthetobaccoSar8.2bgene,ageneinvolvedinsystemicacquiredresistance.Gene2002，290:115-124.X玉米鹿糖合成酶I只在韌皮部細(xì)胞中表達(dá)(YangNS,RussellD.Maizesucrosesynthase-promoterdirectsphloemcellspecificexpressionofgusgeneintransgenictobaccoplants.ProcNatlAcadSci1990,87:4144-4148.)。PsGNS2啟動子只在種子中特異表達(dá)(BuchnerP，RochatC,WuillemeS，BoutinJP.Characterizationofatissue-specificanddevelopmentalIyregulatedbeta-1,3-glucanasegeneinpea(Pisumsativum).PlantMolBiol2002，49:171-186.)。水稻是最重要的糧食作物之一，水稻的真菌病害以及細(xì)菌病害都會造成產(chǎn)量減少及品質(zhì)下降。水稻抗病基因的克隆以及啟動子的分離可以使我們更好地了解寄主與病原菌的互作并為基因工程改良奠定基礎(chǔ)。因此如何利用水稻抗病基因的克隆以及啟動子的分離獲得抗病植株成為亟待解決的問題之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的發(fā)明人針對上述現(xiàn)有技術(shù)的情況，提供了一個(gè)水稻病原菌誘導(dǎo)啟動子，該啟動子能夠被水稻白葉枯病病菌黃單胞菌PX099、PX061，水稻細(xì)菌性條斑病病菌RS105以及玉米紋枯病菌YWK-196所激活，同時(shí)·，也能被脫落酸、赤霉酸、水楊酸、氯化鈉處理所激活。通過對該啟動子進(jìn)行截短，確定了_513bp至-411bp和-411至-310bp為病原誘導(dǎo)關(guān)鍵區(qū)域?？梢岳帽景l(fā)明啟動子構(gòu)建成各種植物表達(dá)載體，用于通過植物基因工程技術(shù)改善植物品質(zhì)和其他有益生產(chǎn)性狀。發(fā)明人首先提供了一個(gè)水稻病原菌誘導(dǎo)啟動子，該啟動子基因序列中含有如序列表SEQIDN0.1所示的DNA序列。該啟動子來源于水稻IRBB13(Oryzasativa),是下述核苷酸序列之一:序列表中SEQIDN0.1所示的DNA序列或部分DNA序列。序列表中的SEQIDN0.1由2257個(gè)堿基組成。自5'端第2198位堿基為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，記為+1。其中TATA框位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-30至-25位堿基，而CAAT框位于-72至-69位堿基，這些元件在轉(zhuǎn)錄中是基本啟動子元件。自5'端第-1239位，-183位堿基為黃化誘導(dǎo)元件ACGTATERD1;自5,端第-1793位，-1750位，-682位堿基為胚和胚乳特異表達(dá)元件CANBNNAPA;自5,端第-128位堿基為脫水響應(yīng)元件CBFHV;自5z端第-1474位，-1137位，-837位，-168位堿基為熱激蛋白基因表達(dá)元件CCAATB0X1;自5z端第-55位堿基為黑暗響應(yīng)元件CDAATCAB2;自5,端第-2079位，-1773位，-1243位，-739位堿基為銅離子誘導(dǎo)表達(dá)元件CUREC0RECR;自5,端第-1714位，-1276位，-1005位，-906位，-725位，-587位，-380位，-333位，-230位堿基為DNA結(jié)合蛋白基因表達(dá)元件D0FC0REZM;自5,端第-2069位，-1631位，-1572位，-1566位，-1527位，-220位堿基為貯藏蛋白基因表達(dá)元件EB0XBNNAPA;自5,端第-2119位，-1252位，-1186位堿基為增強(qiáng)子元件EECCRCAH1;自5,端第-336位堿基為氮響應(yīng)元件EMHVCH0RD;自5,端第-1805位，-1670位，-1441位，-1071位，-698位，-392位，-284位，-227位，-212位堿基為光誘導(dǎo)元件GATAB0X;自5,端第-2137位，-315位堿基為病原菌和鹽離子誘導(dǎo)表達(dá)元件GT-1;自5y端第-683位堿基為ABA誘導(dǎo)表達(dá)元件PR0XBBNNAPA;自5,端第-1854位，-726位堿基為GA誘導(dǎo)元件PYRMIDINEB0X0SRAMY1A；自5'端第-1517位，-950位堿基為水楊酸誘導(dǎo)元件WB0XATNPR1。2H16啟動子p2H16的序列分析結(jié)果表明2H16基因在水稻抗性和脅迫誘導(dǎo)過程中受復(fù)雜因素的調(diào)控。同時(shí)通過截短驗(yàn)證,確定了病原誘導(dǎo)相關(guān)區(qū)段位于_513bp至_411bp和_411bp至-309bp，在確定了上述的病原誘導(dǎo)關(guān)鍵區(qū)域后，可以方便的與其他抗病相關(guān)基因通過基因工程改造來改善植物抗病性。除此之夕卜，本發(fā)明的發(fā)明還提供了含有p2H16的重組載體，并命名為I38IGFP::p2H16。綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人在國際上首次提供了一個(gè)水稻病原菌誘導(dǎo)啟動子P2H16，水稻轉(zhuǎn)基因證明發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株受到ABA，SA,GA，黃單胞菌PX099、PX061，水稻細(xì)菌性條斑病菌RS105以及玉米紋枯病菌YWK-196誘導(dǎo)后GFP活性均有顯著上升，說明p2H16含有相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng)因子。p2H16在模式植物中的表達(dá)特征表明其是一個(gè)病原相關(guān)的啟動子。p2H16的功能研究可為揭示2H16的表達(dá)調(diào)控機(jī)理以及具體功能打下基礎(chǔ)，還可應(yīng)用于水稻抗病基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。圖1.本發(fā)明所述啟動子轉(zhuǎn)化水稻中花植株受到黃單胞菌PX099、PX061、細(xì)菌性條斑病菌RS105誘導(dǎo)后GFP熒光觀察結(jié)果灰度圖；其中H2O為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種24h后進(jìn)行熒光觀察，可以觀察到很強(qiáng)的熒光，說明該啟動子受到上述病原細(xì)菌的誘導(dǎo)；圖2.本發(fā)明所述啟動子轉(zhuǎn)化水稻中花植株受到玉米紋枯病菌YWK-196誘導(dǎo)后GFP熒光觀察結(jié)果灰度圖；不接菌CK為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種24h后進(jìn)行熒光觀察，可以觀察到很強(qiáng)的熒光，說明該啟動子受到上述病原真菌的誘導(dǎo)；圖3.本發(fā)明所述啟動子轉(zhuǎn)化水稻中花植株受到NaCl，SA,GA，ABA誘導(dǎo)后GFP熒光觀察結(jié)果灰度圖；結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理36h后進(jìn)行熒光觀察，NaCl，SA處理后有很強(qiáng)的熒光，而GA，ABA處理后熒光強(qiáng)度較弱，說明NaCl，SA,GA，ABA均能誘導(dǎo)該啟動子表達(dá)，只是誘導(dǎo)強(qiáng)度有所不同；圖4.本發(fā)明所述不同截短啟動子轉(zhuǎn)化水稻中花植株受到白葉枯病菌PX099誘導(dǎo)后GFP熒光觀察結(jié)果灰度圖；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種24h后進(jìn)行熒光觀察，在截去_720bp至_309bp這一區(qū)段后，熒光強(qiáng)度明顯減弱，說明這一區(qū)段存在與病原誘導(dǎo)相關(guān)的元件；圖5.本發(fā)明所述不同截短啟動子在本生煙上瞬時(shí)表達(dá)后受到玉米紋枯病菌YWK-196誘導(dǎo)后GFP熒光觀察結(jié)果灰度圖；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種24h后進(jìn)行突光觀察,在截去_513bp至_41Ibp和_41Ibp至_309bp這兩個(gè)區(qū)段后，熒光強(qiáng)度有明顯減弱，說明與病原誘導(dǎo)相關(guān)的元件存在于這兩個(gè)區(qū)段。圖6為圖1的彩色示意圖；圖7為圖2的彩色示意圖；圖8為圖3的彩色示意圖；圖9為圖4的彩色示意圖；圖10為圖5的彩色示意圖。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；實(shí)施例1水稻2H16基因啟動子p2H16的克隆以及序列分析根據(jù)水稻日本晴2H16基因(GENBANK登陸號為:AK058338)上游2300bp序列設(shè)計(jì)引物(5z-CAGACGGCTACTGTCCATCA-3z，其序列如SEQIDN0.2所示；5z-GCGAGAGCAGGAGGAGAGAC-3'，其序列如SEQIDN0.3所示)用來獲得基因的啟動子。提取水稻IRBB13基因組DNA，作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序如下:預(yù)變形940C5min,變性94°C40s，退火54°C40s,延伸72°C2min,反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，后延伸72°C7min,結(jié)束后，用康為公司的DNA回收試劑盒回收并純化擴(kuò)增片段，然后將純化的DNA片段連接至載體pGEM-T中(Promega公司)，室溫孵育lh，轉(zhuǎn)化E.coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆提質(zhì)粒，測序由華大基因完成。結(jié)果以水稻IRBB13基因組DNA為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，獲得一個(gè)長度為2257bp的DNA片段，具有序列表SEQIDN0.1的DNA序列。與已克隆的2H16的啟動子序列進(jìn)行比較，結(jié)果該2257bp的DNA片段存在73bp的連續(xù)缺失，將該啟動子命名為p2H16。而將上述含有p2H16的重組載體命名為pGEM-T::p2H16。將2H16cDNA序列的第一個(gè)堿基定義為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，即序列表中SEQIDN0.1自5z端的第2198位堿基。用PLACE(HigoK，UgawaY,IwamotoM,KorenagaT.Plantcis-actingregulatoryDNA_elements(PLACE)NuclAcidsResl999,27:297-300.)軟件對水稻2H16的啟動子核苷酸序列(序列表中的SEQIDN0.1)進(jìn)行序列分析。用上述軟件對2H16基因啟動子P2H16中的順式作用元件進(jìn)行搜`索、預(yù)測，結(jié)果該啟動子中含有眾多與已知真核生物的順式元件的同源序列。其中，將2H16cDNA序列的第一個(gè)堿基定義為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(記為+1)，即序列表中SEQIDN0.1自5z端的第2198位堿基，其中TATA框位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-30至-25位堿基，而CAAT框位于-72至-69位堿基，這些元件在轉(zhuǎn)錄中是基本啟動子元件。自5'端第-1239位，-183位堿基為黃化誘導(dǎo)元件ACGTATERD1(SimpsonSD,NakashimaK，NarusakaY，SekiM,ShinozakiK，Yamaguch1-ShinozakiK.Twodifferentnovelcis-actingelementsoferdl,aclpAhomologousArabidopsisgenefunctionininductionbydehydrationstressanddark-1nducedsenescence.PlantJ2003,33:259-270.);自5,端第-1793位，-1750位，-682位堿基為胚和胚乳特異表達(dá)元件CANBNNAPA(EllerstromM,StalbergK，EzcurraI,RaskL.Functionaldissectionofanapingenepromoter:1dentificationofpromoterelementsrequiredforembryoandendosperm-specifictranscription.PlantMolBiol1996,32:1019-1027.)；自5"端第-128位喊基為脫水響應(yīng)兀件CBFHV(SvenssonJT,CrosattiC，CampoliC，BassiR,StancaAM,CloseTJ,CattivelliL.Transcriptomeanalysisofcoldacclimationinbarleyalbinaandxanthamutants.PlantPhysiol2006,141:257-270.);自5'端第-1474位，-1137位，-837位，-168位堿基為熱激蛋白基因表達(dá)元件CCAATB0X1(RiepingM,SchofflF.Synergisticeffectofupstreamsequences,CCAATboxelements,andHSEsequencesforenhancedexpressionofchimaericheatshockgenesintransgenictobacc0.MolGenGenet1992，231:226-232.);自5,端第-55位堿基為黑暗響應(yīng)元件CDAATCAB2(MaxwellBBjAnderssonCR，PooleDSjKaySAjChoryJ.HY5,circadianclock—assosiated1，andacis—lelement，DETldarkresponseelement,mediateDETlregulationofchlorophylla/b-bindingprotein2expression.PlantPhysiol2003，133:1565-1577.);自5,端第-2079位，-1773位，-1243位，-739位堿基為銅離子誘導(dǎo)表達(dá)兀件CURECORECR(QuinnJMjMerchantS.Twocopper-responsiveelementsassociatedwiththechlamydomonasCyc6genefunctionastargetsfortranscriptionalactivators.PlantCell1995，7:623-628.);自5'端第-1714位，-1276位，-1005位，-906位，-725位，-587位，-380位，-333位，-230位堿基為DNA結(jié)合蛋白基因表達(dá)兀件D0FC0REZM(YanagisawaS.DofIandDof2transcriptionfactorsareassociatedwithexpressionofmultiplegenesinvolvedincarbonmetabolisminmaize.PlantJ2000，21:281-288.);自5,端第-2069位，-1631位，-1572位，-1566位，-1527位，-220位堿基為貯藏蛋白基因表達(dá)元件EB0XBNNAPA(Stalbei*gK，EllerstomM,EzcurraI,AblovS，RaskL.DisruptionofanoverlappingE-box/ABREmotifabolishedhightranscriptionofthenapAstorage—proteinpromoterintransgenicBrassicanapusseeds.Planta1996，199:515-519.)；自5'端第-2119位，-1252位，-1186位堿基為增強(qiáng)子元件EECCRCAH1(YoshiokaS，TaniguchiF，MiuraK，InoueT，YamanoT,FukuzawaH.ThenovelMybtranscriptionfactorLCRlregulatestheCO2-responsivegeneCahljencodingaperiplasmiccarbonicanhydraseinChlamydomonasreinhardti1.PlantCell2004,16:1466-1477.)；自5^端第-336位堿基為氮響應(yīng)元件EMHVCHORD(MullerM,KnudsenS.ThenitrogenresponseofabarleyC—hordeinpromoteriscontrolledbypositiveandnegativeregulationoftheGCN4andendospermbox.PlantJ1993，4:343-355.);自5'端第-1805位，-1670位，-1441位，-1071位，-698位，-392位，-284位，-227位，-212位減基為光誘導(dǎo)兀件GATAB0X(GilmartinPM，SarokinL,MemelinkJ,ChuaNH.Molecularlightswitchesforplantgenes.PlantCell1990，2:369-378.);自5'端第-2137位，-315位堿基為病原菌和鹽離子誘導(dǎo)表達(dá)元件GT-1(ParkHCjKimML,KangYHjJeonJMjYooJH，KimMCjParkCY，JeongJC，MoonBCjLeeJH，YoonHWjLeeSH，ChungWSjLimCO，LeeSY，HongJC，ChoMJ.Pathogen-andNaCl-1nducedexpressionoftheSCaM—4promoterismediatedinpartbyaGT-1boxthatinteractswithaGT-l-liketranscriptionfactor.PlantPhysiol2004，135:2150-2161.)；自5'端第-683位減基為ABA誘導(dǎo)表達(dá)兀件PROXBBNNAPA(EzcurraI，EllerstromM,WycliffeP，StalbergK，RaskL.1nteractionbetweencompositeelementsinthenapApromoter:boththeB~boxABA-responsivecomplexandtheRY/Gcomplexarenecessaryforseed-specificexpression.PlantMolBiol1999，40:699-709.)；自5^端第-1854位，-726位堿基為GA誘導(dǎo)元件PYRMIDINEBOXOSRAMYlA(MenaM，CejudoFJ，Isabel—LamonedaI，CarboneroP.ArolefortheDOFtranscriptionfactorBPBFintheregulationofgibberelIin-responsivegenesinbarleyaleurone.PlantPhysiol2002，130:111-119.);自5z端第-1517位，-950位堿基為水楊酸誘導(dǎo)元件WB0XATNPR1(Chenff,ProvartNJ,GlazebrookJ,KatagiriF，ChangHS,EulgemT,MauchF，LuanS，ZouG,WhithamSA,BudworthPR,TaoY.ExpressionprofilematrixofArabidopsistranscriptionfactorgenessuggeststheirputativefunctionsinresponsetoenvironmentalstresses.PlantCell2002，14:559-574.)。2H16啟動子P2H16的序列分析結(jié)果表明2H16基因在水稻抗性和脅迫誘導(dǎo)過程中受復(fù)雜因素的調(diào)控。表12H16啟動子序列中的調(diào)控元件分析權(quán)利要求1.一種水稻病原菌誘導(dǎo)啟動子，其特征在于:其基因序列如SEQIDN0.1所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動子，其特征在于:該啟動子可以被病原菌激活，或者在用脫落酸、赤霉酸、水楊酸、氯化鈉處理時(shí)能被激活。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的啟動子，其特征在于:序列中_513bp至-411bp和-411bp至-309bp為病原誘導(dǎo)關(guān)鍵區(qū)域。4.如權(quán)利要求1所述的啟動子在植物品質(zhì)改良及植物抗性改良中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，提供了一個(gè)水稻病原菌誘導(dǎo)啟動子，該啟動子能夠被水稻白葉枯病病菌黃單胞菌PXO99、PXO61，水稻細(xì)菌性條斑病病菌RS105以及玉米紋枯病菌YWK-196所激活，同時(shí)，也能被脫落酸、赤霉酸、水楊酸、氯化鈉處理所激活。通過對啟動子截短驗(yàn)證，確定了-513bp至-411bp和-411bp至-309bp這兩個(gè)區(qū)段為受病原菌誘導(dǎo)的關(guān)鍵區(qū)域?？梢岳帽景l(fā)明啟動子構(gòu)建成各種植物表達(dá)載體，用于通過植物基因工程技術(shù)改善植物品質(zhì)和其他有益生產(chǎn)性狀。文檔編號A01H5/00GK103074342SQ201310028478公開日2013年5月1日申請日期2013年1月24日優(yōu)先權(quán)日2013年1月24日發(fā)明者儲昭輝,丁新華,李寧申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)