專利名稱：硝酸銀提高青蒿叢生芽誘導(dǎo)、生長和再生的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的提高植物組織培養(yǎng)過程中叢生芽誘導(dǎo)、生長及再生的方法，具體是一種利用硝酸銀處理提高青蒿叢生芽誘導(dǎo)的方法。
背景技術(shù)：
據(jù)世界衛(wèi)生組織最新報(bào)告，瘧疾是除艾滋病以外在世界范圍內(nèi)呈明顯上升趨勢(shì)的傳染性疾病，世界上每年有3-5億瘧疾臨床病例，其中大約三百萬死亡。從傳統(tǒng)的藥用植物青蒿(Artemisia annua L.)植株中分離出的青蒿素是目前全球公認(rèn)的治療痕疾的首選藥物，此外，還有研究表明，青蒿素對(duì)白血病、乳腺癌等一系列癌細(xì)胞有很好的抑制作用。青蒿植株中青蒿素含量很低(0.01-0.8% DW)，導(dǎo)致青蒿素類抗瘧藥物成本較高，限制了青蒿素的應(yīng)用。利用基因工程技術(shù)提高青蒿植株 中青蒿素的含量，降低青蒿素的價(jià)格是滿足青蒿素市場(chǎng)需求的重要手段之一，也是目前研究的重點(diǎn)。青蒿遺傳轉(zhuǎn)化是全世界公認(rèn)的難題，雖然根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的青蒿遺傳轉(zhuǎn)化體系已有報(bào)道，但是青蒿的遺傳轉(zhuǎn)化很不穩(wěn)定，而且效率很低，大大地影響了青蒿基因工程研究的進(jìn)展。而較低的、不穩(wěn)定的青蒿叢生芽誘導(dǎo)和分化效率是影響青蒿遺傳轉(zhuǎn)化的一個(gè)關(guān)鍵因素。硝酸銀是最常用的植物組織培養(yǎng)添加劑，在培養(yǎng)基中添加硝酸銀可以促進(jìn)愈傷組織的器官發(fā)生、體細(xì)胞胚的形成以及離體植物的再生，誘導(dǎo)許多單雙子葉植物的形態(tài)建成，促進(jìn)芽原基的產(chǎn)生和伸長，甚至還可以增加外植體不定芽產(chǎn)生的數(shù)目。但是硝酸銀對(duì)青蒿叢生芽誘導(dǎo)、分化的影響目前還不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有青蒿組培體系的不足，提供一種利用硝酸銀處理提高青蒿叢生芽誘導(dǎo)、分化及再生的方法，該方法能簡單、有效地提高青蒿叢生芽誘導(dǎo)、生長和再生，本發(fā)明可以用于青蒿的快速擴(kuò)繁與種質(zhì)保存，也可用于青蒿基因工程，以提高青蒿遺傳轉(zhuǎn)化效率，最終提高青蒿中青蒿素的含量。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，將青蒿種子種植于MS培養(yǎng)基中發(fā)苗、培養(yǎng)和擴(kuò)繁。選取青蒿葉片作為外植體，將外植體置于含2mg/l硝酸銀的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天，叢生芽誘導(dǎo)率和每個(gè)外植體的叢生芽數(shù)顯著增加；然后將具有叢生芽的外植體轉(zhuǎn)移到普通叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，經(jīng)硝酸銀處理的叢生芽高度明顯增加；將叢生芽轉(zhuǎn)移到普通MS培養(yǎng)基中進(jìn)行生根和植株再生，經(jīng)硝酸銀處理的叢生芽的再生植株高度明顯增加。所述MS培養(yǎng)基，通過在MS培養(yǎng)液中另外添加30g/l的蔗糖和6.0g/Ι的瓊脂而得。其中MS培養(yǎng)液為Murashige and Skoog于1962年公布。所述的選取青蒿葉片作為外植體，是指取培養(yǎng)25天的青蒿組培苗，取中上部葉片作為外植體。所述普通叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，是通過MS培養(yǎng)基中添加1.0mg/1 6-BA和0.05mg/lNAA而得。所述的硝酸銀，是指硝酸銀水溶液，過濾滅菌，4°C避光保存。所述的添加硝酸銀的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，通過在滅菌后的培養(yǎng)基溫度降至60°C以下時(shí)添加終濃度為2mg/l的硝酸銀溶液而得。所述的叢生芽誘導(dǎo)是指叢生芽誘導(dǎo)率、每個(gè)外植體叢生芽個(gè)數(shù)；所謂的叢生芽再生是指叢生芽高度及再生青蒿植株的高度。叢生芽誘導(dǎo)率通過計(jì)算誘導(dǎo)出叢生芽的外植體占總外植體的百分比而得；叢生芽個(gè)數(shù)通過計(jì)算叢生芽的總數(shù)與誘導(dǎo)出叢生芽的外植體總數(shù)的比率而得；叢生芽高度指誘導(dǎo)出的叢生芽的平均高度；再生植株的高度指由叢生芽發(fā)育成的植株的高度。本發(fā)明的原理在于，青蒿組織培養(yǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生大量的乙烯，過多的乙烯能阻止體細(xì)胞胚胎發(fā)生，抑制叢生芽誘導(dǎo)及分化。硝酸銀可以通過干擾乙烯受體(ETRl)與乙烯的結(jié)合，從而抑制乙烯產(chǎn)生引起的生理反應(yīng)。因此在青蒿組織培養(yǎng)過程中，在培養(yǎng)基中添加硝酸銀可以促進(jìn)叢生芽誘導(dǎo)及分化。本發(fā)明的有益效果是，在青蒿組培過程中通過在培養(yǎng)基中添加硝酸銀這一操作簡單、成本低廉的步驟，可以有效地提高叢生芽誘導(dǎo)率，增加每個(gè)外植體的叢生芽個(gè)數(shù)，而且能夠促進(jìn)叢生芽生長以及再生植株的生長，本發(fā)明可以應(yīng)用于青蒿的快繁與種質(zhì)保存，也可用于青蒿基因工程中的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以提高青蒿青蒿遺傳轉(zhuǎn)化效率。


圖1.硝酸銀(AgNO3)對(duì)青蒿叢生芽誘導(dǎo)率、叢生芽個(gè)數(shù)、叢生芽高度及再生植株生長的影響
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明:本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，下面給出詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程。實(shí)施例硝酸銀溶液的配制:稱取1.0g硝酸銀，加水溶解，定容至100ml，過濾滅菌，4°C避
光保存。青蒿無菌組培苗的獲得:將001青蒿種子(來源于重慶酉陽)先用自來水沖洗，進(jìn)行常規(guī)消毒具體操作包括在超凈工作臺(tái)上先用70%酒精浸泡30秒，再用0.1%的氯化汞消毒5分鐘，然后在無菌水中震蕩沖洗5次。將消毒后的種子置于MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，待萌發(fā)的小苗長至3cm左右時(shí)，將小苗轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基中進(jìn)行組培苗培養(yǎng)。組培苗每30天擴(kuò)繁一次。MS培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)液中添加30g/l的蔗糖和6.0g/Ι的瓊脂，MS培養(yǎng)液為Murashigeand Skoog 于 1962 年公布。青蒿叢生芽的誘導(dǎo):配制叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基(配方為MS培養(yǎng)基+L Omg/16-BA+0.05mg/lNAA)，高壓滅菌后待培養(yǎng)基溫度降至60°C以下時(shí)，培養(yǎng)基加入硝酸銀溶液混勻后倒入培養(yǎng)皿中。選取苗齡25天左右的001青蒿中上部葉片作為外植體，用剪刀剪下外植體并將外植體平鋪在含硝酸銀(2mg/l)的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板上，在植物組培室培養(yǎng)20天后觀察叢生芽誘導(dǎo)情況，統(tǒng)計(jì)叢生芽誘導(dǎo)率和每個(gè)外植體的叢生芽個(gè)數(shù)。用在普通叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的外植體作對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)硝酸銀可以明顯抑制愈傷組織的產(chǎn)生顯著促進(jìn)青蒿叢生芽誘導(dǎo)，叢生芽誘導(dǎo)率和每個(gè)外植體的叢生芽個(gè)數(shù)分別增加了 25%和110%。青蒿叢生芽的生長:為了利于叢生芽的生長，將叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基分裝到50ml三角瓶中。將經(jīng)過硝酸銀處理后的外植體轉(zhuǎn)移到普通叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)30天后統(tǒng)計(jì)叢生芽的平均高度，與在普通叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)和培養(yǎng)的叢生芽高度作比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)硝酸銀可以顯著提高叢生芽的平均高度，與對(duì)照相比提高了 78%。青蒿叢生芽的再生:將高度一致的叢生芽轉(zhuǎn)移到普通MS培養(yǎng)基的廣口瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)5天后兩組叢生芽都有不定根形成，培養(yǎng)20天后，統(tǒng)計(jì)兩組再生青蒿植株的高度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)硝酸銀可以顯著促進(jìn)再生植株的生長，和對(duì)照相比提高了 33%。從結(jié)果看出，在青蒿組織培養(yǎng)過程中，在叢生芽誘導(dǎo)階段用2mg/l硝酸銀處理20天即可促進(jìn)青蒿叢生芽誘導(dǎo)，叢生芽誘導(dǎo)率和每個(gè)外植體誘導(dǎo)出的叢生芽個(gè)數(shù)顯著增加；硝酸銀處理對(duì)叢生芽的生長也有顯著的促進(jìn)作用，叢生芽高度顯著高于沒有經(jīng)過硝酸銀處理的叢生芽；硝酸銀處理 對(duì)叢生芽再生植株的生長也有促進(jìn)，再生植株的株高顯著增加。
權(quán)利要求
1.一種硝酸銀促進(jìn)青蒿叢生芽誘導(dǎo)、生長和再生的方法，其特征在于，首先將青蒿種子種植于MS培養(yǎng)基中萌發(fā)、培養(yǎng)和擴(kuò)繁，然后將取青蒿組培苗葉片作為外植體，用硝酸銀處理后轉(zhuǎn)移至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，然后將叢生芽轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基中生根、培養(yǎng)，硝酸銀即能促進(jìn)青蒿叢生芽誘導(dǎo)、生長和再生； 所述的青蒿種子是來源于重慶酉陽的OOl青蒿株系； 所述的MS培養(yǎng)基，是通過在MS培養(yǎng)液中另外添加30g/l蔗糖和6.0g/Ι瓊脂而得，MS培養(yǎng)液為Murashige and Skoog于1962年公布； 所述的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，是通過在MS培養(yǎng)基中添加1.0mg/1 6-BA和0.05mg/l NAA而得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硝酸銀促進(jìn)青蒿叢生芽誘導(dǎo)、生長和再生的方法，其特征是，所述的取青蒿組培苗葉片作為外植體，是指:無菌擴(kuò)繁的青蒿植株培養(yǎng)至25天時(shí)，選擇中上部葉片，用剪刀剪下作為叢生芽誘導(dǎo)的外植體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硝酸銀促進(jìn)青蒿叢生芽誘導(dǎo)、生長和再生的方法，其特征是，所述的硝酸銀，是指硝酸銀水溶液，過濾滅菌，4°C避光保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硝酸銀促進(jìn)青蒿叢生芽誘導(dǎo)、生長和再生的方法，其特征是，所述的硝酸銀處理，是指:叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基滅菌后降至60°C時(shí)添加2mg/l的硝酸銀，混勻倒入平皿，將外植體平鋪于添加硝酸銀的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板上，在植物組培室培養(yǎng)20天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硝酸銀促進(jìn)青蒿叢生芽誘導(dǎo)、生長和再生的方法，其特征是，所述的轉(zhuǎn)移至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，是指:將經(jīng)過硝酸銀處理的外植體轉(zhuǎn)移至普通叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的50ml三角瓶中培養(yǎng)30天。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硝酸銀促進(jìn)青蒿叢生芽誘導(dǎo)、生長和再生的方法，其特征是，所述的叢生芽轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基中生根、培養(yǎng)，是指:將高度一致的叢生芽轉(zhuǎn)移至含普通MS培養(yǎng)基的廣口瓶中培養(yǎng)20天，培養(yǎng)至第五天時(shí)可見不定根的形成，第20天時(shí)計(jì)算再生植株的平均高度。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硝酸銀促進(jìn)青蒿叢生芽誘導(dǎo)、生長和再生的方法、其特征是，所述的叢生芽誘導(dǎo)，是指:叢生芽誘導(dǎo)率和每個(gè)外植體叢生芽個(gè)數(shù)，叢生芽誘導(dǎo)率通過計(jì)算誘導(dǎo)出叢生芽的外植體和總外植體的百分比而得，叢生芽個(gè)數(shù)通過計(jì)算叢生芽總數(shù)與誘導(dǎo)出叢生芽的外植體的個(gè)數(shù)的比率而得； 所述的叢生芽生長，是指叢生芽的高度，通過計(jì)算叢生芽的平均高度而得； 所述的叢生芽的再生，是指由叢生芽再生的青蒿植株的高度，通過計(jì)算轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天后獲得的再生植株的平均高度而得。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的硝酸銀促進(jìn)青蒿叢生芽誘導(dǎo)、生長和再生的方法、其特征是，所述的硝酸銀即能促進(jìn)青蒿叢生芽誘導(dǎo)、生長和再生，是指:在叢生芽誘導(dǎo)階段用2mg/l硝酸銀處理20天后叢生芽誘導(dǎo)率顯著增加，平均每個(gè)外植體誘導(dǎo)出的叢生芽個(gè)數(shù)顯著增加，由這些叢生芽生長的平均高度顯著增加，由這些叢生芽再生的青蒿植株株高明顯增加。
全文摘要
一種硝酸銀提高青蒿叢生芽誘導(dǎo)、生長及再生的方法。該方法涉及青蒿組織培養(yǎng)過程中叢生芽誘導(dǎo)、生長及叢生芽再生為青蒿植株的技術(shù)改進(jìn)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。其特征在于在青蒿叢生芽誘導(dǎo)過程中，用硝酸銀處理外植體，然后將外植體轉(zhuǎn)移到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)和培養(yǎng)，接下來將獲得的叢生芽轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基中進(jìn)行再生。本發(fā)明顯著地提高了青蒿叢生芽誘導(dǎo)率和每個(gè)外植體產(chǎn)生的叢生芽個(gè)數(shù)，而且對(duì)叢生芽的生長和再生具有明顯的促進(jìn)作用。該方法操作簡單，成本低，可用于青蒿擴(kuò)繁與種質(zhì)培養(yǎng)和青蒿基因工程，應(yīng)用前景廣大。
文檔編號(hào)A01H4/00GK103155870SQ201210575239
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月27日
發(fā)明者雷彩燕, 葉和春, 王紅, 王紅衛(wèi), 白潤娥 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)