專利名稱：一個(gè)簇毛麥金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及其所編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開(kāi)了一個(gè)簇毛麥金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及其所編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由專性寄生真菌小麥白粉病菌(Blumeria graminis DC f. sp. tritici)引起的小麥白粉病是中國(guó)和世界上許多國(guó)家小麥生產(chǎn)中危害日趨嚴(yán)重的病害之一。從一葉期到衰老，植株都能被白粉菌侵染。早期的侵染可使分蘗減少，上部葉片和穗部晚期的侵染能嚴(yán)重減少籽粒產(chǎn)(20 % -33 % )。白粉病雖然能用殺菌劑防治，但必然增加人力、物力投入，而且還會(huì)引起環(huán)境污染等生態(tài)問(wèn)題，因此培育和推廣抗病品種已被公認(rèn)為是防治小麥白粉病最為經(jīng)濟(jì)、安全和有 效的途徑，而抗病遺傳背景和抗病機(jī)理的研究則是制定抗病育種策略的重要依據(jù)。明確其抗病機(jī)制，克隆抗病相關(guān)基因，對(duì)于防治小麥病害、開(kāi)展抗病育種改良具有重要理論指導(dǎo)意義。小麥抗病分子機(jī)制是目前小麥白粉病研究的熱點(diǎn)課題。白粉病病原菌與寄主小麥之間的互作關(guān)系十分復(fù)雜。分析病原菌-寄主互作過(guò)程中的基因表達(dá)情況，有助于發(fā)掘抗病基因和發(fā)現(xiàn)抗病通路，并進(jìn)一步闡明抗病的分子機(jī)制。通過(guò)構(gòu)建受白粉病菌誘導(dǎo)表達(dá)的cDNA文庫(kù)、SSH文庫(kù)，利用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)、芯片技術(shù)等，篩選出了可能與白粉病抗性相關(guān)的基因或蛋白，包括各種病程相關(guān)蛋白、絲氨酸-蘇氨酸激酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等，也發(fā)現(xiàn)了水楊酸途徑、雙氧水途徑等信號(hào)通路與白粉病抗性關(guān)。二倍體簇毛麥?zhǔn)歉呖拱追鄄〉男←溸h(yuǎn)緣物種，其抗病基因Pm21位于6V上，本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明Hv-CMPG與簇毛麥的白粉病相關(guān)，該基因是一個(gè)E3連接酶，參與泛素化過(guò)程降解結(jié)合目標(biāo)底物蛋白。研究像Hv-CMPG這類E3連接酶的底物結(jié)合蛋白及信號(hào)傳導(dǎo)途徑是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。研究利用酵母雙雜交技術(shù)，將Hv-CMPG作為誘餌，利用聚乙二醇-醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，篩選受白粉菌誘導(dǎo)的簇毛麥酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，得到Hv-CMPG的一個(gè)互作基因HV-FP3，該基因是一個(gè)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在簇毛麥葉片中受白粉菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)；利用基因槍技術(shù)將其轉(zhuǎn)化感白粉病小麥品種揚(yáng)麥158中，以期提高白粉病抗性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HV-FP3。本發(fā)明的另一目的是提供該基因的表達(dá)載體。本發(fā)明的又一目的是提供該基因和表達(dá)載體的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HV-FP3,來(lái)自二倍體簇毛麥(Haynaldia villosa, VV,2n=14),可以和白粉病抗性相關(guān)基因Hv-CMPG互作，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1。該受體蛋白激酶基因編碼的蛋白質(zhì)HV-FP3，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
含有所述的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Hv-FP3的表達(dá)載體。所述的含有金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Hv-FP3的表達(dá)載體優(yōu)選以PBI220為出發(fā)載體，將所述的HvFP3基因插入pBI220的BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)間所得。所述的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Hv-FP3在構(gòu)建抗白粉病小麥品種中的應(yīng)用。所述的含金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Hv-FP3的表達(dá)載體在構(gòu)建抗白粉病小麥品種中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明首次從簇毛麥中克隆得到了一個(gè)和白粉病抗性相關(guān)基因Hv-CMPG互作的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HV-FP3及其所編碼的蛋白質(zhì)HV-FP3，為簇毛麥中首次報(bào)道。將其插入表達(dá)載體pBI220，得到的該基因的過(guò)量表達(dá)載體導(dǎo)入感病小麥品種中，可以提高感白粉病小 麥品種對(duì)白粉病的抗性。HV-FP3用于基因工程育種，將其導(dǎo)入易感白粉病小麥品種中，能夠提高小麥的白粉病抗性。


圖1利用酵母雙雜交克隆Hv-CMPG的互作基因Hv_FP3，上行為SD_LT培養(yǎng)基，下行為 SD-HLT 培養(yǎng)基；從左至右分別為 pGADT7+pGBKT7、pGBKT7 :CMPG+pGADT7、pGADT7 FP3+pGBKT7、pGBKT7 CMPG+pGADT7 :FP3。圖2Hv-FP3在二倍體簇毛麥白粉菌誘導(dǎo)后的葉片中的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析X軸0h、45min、lh、2h、4h、6h、12h、24h、48h、72h分別表示簇毛麥葉片受白粉菌誘導(dǎo)的不同時(shí)間段^軸Hv-FP3基因在不同樣品中受白粉菌誘導(dǎo)前后的表達(dá)倍數(shù)。圖3HV-FP3轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建圖譜圖4HV-FP3基因轉(zhuǎn)化揚(yáng)麥158的Ttl代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR分子鑒定結(jié)果泳道I為Marker，泳道2為水空白對(duì)照，泳道3為未轉(zhuǎn)化揚(yáng)麥158對(duì)照，泳道9為包含目的基因的質(zhì)粒，泳道4-8依次為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株Tq-10-2、Tq-17-3、Tq-27-3、Tq-32-1、T0_39_3 ο圖5HV-FP3基因轉(zhuǎn)化揚(yáng)麥158的Ttl代陽(yáng)性植株Q-RT-PCR分析結(jié)果X 軸Υ158, T0-l-4, Τ0-10-2, Τ0-17-3, Τ0-27-3, T0-32-l, T0-39-3 為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株，T0-l-4為陰性轉(zhuǎn)化植株，揚(yáng)麥158為轉(zhuǎn)基因受體小麥；￥軸Hv-FP3基因在轉(zhuǎn)基因植株中相對(duì)于揚(yáng)麥158的表達(dá)倍數(shù)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1利用酵母雙雜交克隆金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HvFP3二倍體簇毛麥(參考文獻(xiàn)齊莉莉，陳佩度，等，小麥白粉病新抗源一基因Pm21，作物學(xué)報(bào)，1995，21 (3) :257-262)是高抗白粉病的材料。Hv-CMPG是南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所克隆的一個(gè)位于二倍體簇毛麥6V上的白粉病抗性相關(guān)基因(劉圓.簇毛麥Hv-CMPG基因克隆及其功能初步分析[D].南京.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007)，以Hv-CMPG為誘餌，用聚乙二醇-醋酸鋰轉(zhuǎn)化法篩選酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，得到一個(gè)Hv-CMPG的互作基因(附圖1)。對(duì)該互作基因測(cè)序，獲得了大小為702bp的序列，序列如SEQ ID NO.1所示。通過(guò)NCBI網(wǎng)站中的ORFfinder搜索該獲得序列的開(kāi)放閱讀框，發(fā)現(xiàn)其包含一個(gè)全長(zhǎng)ORF的基因，其中5’-UTR (非翻譯區(qū))72bp、3’-UTR174bp、0RF (開(kāi)放閱讀框)456bp，編碼151個(gè)氨基酸，序列如SEQ IDNO. 2所示，將該基因命名為Hv-FP3。實(shí)施例2HV-FP3基因受白粉菌誘導(dǎo)的表達(dá)特征把抗白粉病的簇毛麥種子(參考文獻(xiàn)齊莉莉，陳佩度，等，小麥白粉病新抗源-基因卩11121，物學(xué)報(bào)，1995，21 (3) :257-262)播于培養(yǎng)皿中發(fā)芽，露白后移栽到盆缽(周圍用圓柱狀透明塑料片隔離，頂端用濾紙封閉，形成無(wú)白粉菌的環(huán)境)。待三葉期，把在感病品種蘇麥三號(hào)上培養(yǎng)的南京本地混合白粉菌新鮮孢子輕輕抖落在簇毛麥的幼苗上。接種白粉菌后的簇毛麥葉片保存在161。接種后011、451^11、111、211、411、611、1211、2411、4811、7211取樣，置于一70°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｓ肨RIZOL (InvitiOgen)提取受白粉菌誘導(dǎo)的簇毛麥葉片的RNAjlJ用AMV酶(Takara)合成反轉(zhuǎn)錄第一鏈,得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。應(yīng)用能特異擴(kuò)增Hv-FP3 的特異引物 P1(TGGATCACCTCTCTGATTTGTG(SEQ IDNO. 3))和P2(TGCTCGATCAGCGAATCTTA(SEQ IDNO. 4))，對(duì)該基因在受白粉菌誘導(dǎo)樣品中進(jìn)行實(shí)時(shí)熒 光定量PCR (Q-RT-PCR)分析。PCR反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(MylQ，Bio-Rad, USA)上擴(kuò)增并檢測(cè)熒光。20 μ I PCR 反應(yīng)體系中含 2 X SYBR Green PCR Master MixlO μ 1,0. 4nmol/μ I引物Pl和P2，上述獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μ I。擴(kuò)增參數(shù)為95°C lOmin，然后95°C 15s、56°C 30s，72°C lmin，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行溶解曲線的測(cè)定。檢測(cè)基因表達(dá)水平定量用MyiQ系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在簇毛麥葉片中HV-FP3受白粉菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，2h后表達(dá)水平達(dá)到峰值，之后開(kāi)始下調(diào)。Q-RT-PCR的結(jié)果表明，Hv-FP3可能與白粉病抗性相關(guān)(附圖2)。實(shí)施例3HV-FP3正義表達(dá)載體構(gòu)建及其轉(zhuǎn)化普通小麥揚(yáng)麥158利用上述經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)后的簇毛麥cDNA為模板，以可擴(kuò)增HV-FP3基因蛋白編碼區(qū)的引物對(duì) P3 (CGGGATCCATGGGCGCCTTGGATCACCT (SEQ ID NO. 5))和 P4(GGGGTACCTCACATGACGGTGCAGGCGTC SEQ ID NO. 6))進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，回收擴(kuò)增片段。用 BamHI和KpnI雙酶切將擴(kuò)增目標(biāo)片斷插入到載體pBI220 (Jefferson RA, Kavanagh TA, BevanMW. GUS fusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusionmarker inhigherplants. EMBO J. 1987, 6:3901-3907.)的 35s 啟動(dòng)子后面的多克隆位點(diǎn)BamHI和KpnI之間。由此將目標(biāo)基因Hv_FP3克隆到強(qiáng)啟動(dòng)子35s的下游，獲得表達(dá)載體pBI220:FP3 (附圖 3)。將構(gòu)建好的過(guò)量表達(dá)載體通過(guò)基因槍法轉(zhuǎn)化揚(yáng)麥158，挑選2800個(gè)幼胚愈傷進(jìn)行基因槍轟擊，轟擊前在高滲培養(yǎng)基(MS+ABA0. 5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2, 4_D2mg/L+葡萄糖30g/L+0. 4mol/L甘露醇，pH5. 8)上預(yù)處理4小時(shí)，轟擊后在高滲培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)。之后將愈傷組織轉(zhuǎn)移至恢復(fù)培養(yǎng)基(1/2MS (只有大量元素減半的MS) +水解酪蛋白500mg/L+2，4-D2mg/L+蔗糖30g/L，pH5. 8)上暗培養(yǎng)2周，再將其轉(zhuǎn)移至含有除草劑的篩選培養(yǎng)基上(1/2MS+ABA0. 5mg/L+ 水解酪蛋白 500mg/L+2，4-Dlmg/L+ 蔗糖 30g/L+4mg/L Bialaphos, pH5. 8)，篩選培養(yǎng)2周。然后將具有抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中(1/2MS+L-谷氨酞胺 I mmol/L+水解酪蛋白 200mg/L+KTlmg/L+IAA0. 5mg/L+鹿糖 30g/L+瓊脂0. 8%, pH5. 8)進(jìn)行分化，待分化芽長(zhǎng)至2-4cm時(shí)將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(l/2MS+KTlmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂0. 8%, pH5. 8)中。至再生苗長(zhǎng)約8cm、根系較健壯時(shí)，即可開(kāi)管煉苗1_2天，最后洗去根系攜帶的培養(yǎng)基殘?jiān)憧梢圃匀肱枥彛@得再生植株共190株。
提取所有再生植株基因組DNA，對(duì)轉(zhuǎn)化植株利用載體上啟動(dòng)子引物P5(TGCGATAAAGGAAAGGCTATC (SEQ ID NO. 7))和基因內(nèi)部引物 P6 (AGTCCATCTTCACCTTGATGTTC(SEQ ID NO. 8))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以鑒定陽(yáng)性植株。PCR程序10_50ng/μ I基因組DNA模板，ΙΟμΜ 的 5’引物和 3’引物各 O. 5μ I ；2. 5μ IlOXbuffer ；2. 5μ 12. 5mM 的 dNTP ；1. 5μ 125mM^Mg2+ ；0. 25μ I (5U/ μ l)Taq polymerase (TaKaRa)，加水至 25 μ I。PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 3min ；94°C 45s, 58°C 45s, 72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0 PCR產(chǎn)物經(jīng) 8% 的聚丙烯凝膠電泳檢測(cè)。其中5株可以擴(kuò)增約510bp的目的條帶，初步鑒定為陽(yáng)性植株，株系編號(hào)依次為1^-10-2,1^-17-3,1^-27-3,1^-32-1,1^-39-3 (附圖 4)。選取成株期的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，利 用隨機(jī)挑選的陰性轉(zhuǎn)基因植株Tfl-4以及轉(zhuǎn)基因受體揚(yáng)麥158作為陰性對(duì)照植株，提取葉片總RNA，利用Hv-FP3基因的特異引物Pl和P2，進(jìn)行Q-RT-PCR分析。結(jié)果表明與對(duì)照揚(yáng)麥158相比，T0-1-4植株中的Hv_FP3基因的表達(dá)量沒(méi)有顯著變化；Tq-10-2、Tq-32-1植株中的Hv-FP3基因的表達(dá)量上調(diào)了約2. 3-2. 9倍；T0-39-3植株中的Hv-FP3基因的表達(dá)量上調(diào)約5. 8倍；TQ-17-3植株中的Hv_FP3基因的表達(dá)量上調(diào)約8. 7倍，植株1-27-3中Hv-FP3基因的表達(dá)量上調(diào)了約14倍。(附圖5)。實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因植株的白粉病抗性鑒定用江蘇南京地區(qū)田間采集的白粉病菌混合菌種同時(shí)接種Ttl代轉(zhuǎn)基因植株、轉(zhuǎn)基因受體品種揚(yáng)麥158，進(jìn)行苗期離體和成株期白粉病抗性鑒定?？剐澡b定標(biāo)準(zhǔn)采用“0-9級(jí)”白粉病抗性反應(yīng)型的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，0-2級(jí)為高抗、3-4級(jí)為中抗、5級(jí)以上為感病。苗期離體抗性鑒定的兩次重復(fù)結(jié)果表明揚(yáng)麥158和陰性轉(zhuǎn)基因植株Tc1-H表現(xiàn)為中感或高感；陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)為高抗。苗期離體和成株期白粉病抗性鑒定結(jié)果基本一致(表I)。表I轉(zhuǎn)基因植株的白粉病抗性鑒定
權(quán)利要求
1.一個(gè)簇毛麥金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HV-FP3，其特征在于其CDNA序列如SEQ ID NO.1所/Jn ο
2.權(quán)利要求1所述金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HV-FP3編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于其氨基酸序列如 SEQID NO. 2 所示。
3.含有權(quán)利要求1所述的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HV-FP3的表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因HV-FP3的表達(dá)載體是以PBI220為出發(fā)載體，將權(quán)利要求1所述的Hv-FP3基因插入pBI220的BamHI 和KpnI酶切位點(diǎn)間所得。
5.權(quán)利要求1所述的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Hv-FP3在培育抗白粉病和/或抗赤霉病小麥品種中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3或4所述的含金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Hv-FP3的表達(dá)載體在培育抗白粉病和 /或抗赤霉病小麥品種中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)簇毛麥金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及其所編碼的蛋白質(zhì)和應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。Hv-FP3的cDNA序列為SEQ ID NO.1及其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.2。該基因來(lái)自二倍體簇毛麥(Haynaldia villosa，VV，2n=14)，在抗白粉病二倍體簇毛麥中受白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)增強(qiáng)。將Hv-FP3基因轉(zhuǎn)化感白粉病小麥品種揚(yáng)麥158，對(duì)轉(zhuǎn)基因T0代植株進(jìn)行白粉病抗性鑒定，結(jié)果表明Hv-FP3基因的過(guò)量表達(dá)可以提高揚(yáng)麥158對(duì)白粉病的抗性。Hv-FP3可望用于基因工程育種，將其導(dǎo)入易感白粉病小麥品種中，有望提高小麥的白粉病抗性。
文檔編號(hào)A01H5/00GK103014023SQ201210574738
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月26日
發(fā)明者李穎波, 王秀娥, 曹愛(ài)忠, 王海燕, 邢莉萍, 肖進(jìn), 費(fèi)菲, 祝燕飛 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)