專利名稱：一種有機(jī)菌液的制備方法、該方法制得的有機(jī)菌液及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物菌肥用有機(jī)菌液，屬于微生物肥料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著我國農(nóng)村經(jīng)濟(jì)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的加快，沼渣、草木灰、糠醛渣、動物糞便等工農(nóng)業(yè)廢棄物的排放量在大幅度增加。根據(jù)國家環(huán)保局開展的污染調(diào)查顯示僅2010年全國排放量為19億噸，為同年工業(yè)固體廢物(7. 8億噸)的2. 4倍，COD排放已達(dá)7118萬噸，大大超過了工業(yè)廢水與生活廢水的COD排放量之和。這嚴(yán)重導(dǎo)致了鄉(xiāng)村生態(tài)環(huán)境的惡化，它不僅污染空氣、水體和土壤，而且滋生了大量的蒼蠅蚊蟲和多種病源微生物，給人們的健康帶來了嚴(yán)重的威脅?；瘜W(xué)肥料的推廣對農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增收起到了關(guān)鍵作用，然而，多年來由于長期施用化 學(xué)肥料，有機(jī)肥不足，有機(jī)、無機(jī)養(yǎng)分比例失調(diào)，致使農(nóng)田生態(tài)環(huán)境、土壤理化性狀和土壤微生物系統(tǒng)受到不同程度的破壞，在一定程度上影響了農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量品質(zhì)。由于農(nóng)田長期不合理地施用大量的農(nóng)藥、化肥、除草劑、生長調(diào)節(jié)劑等化學(xué)合成物質(zhì)，再加上農(nóng)業(yè)自身廢棄物的不當(dāng)處置，污水灌溉和“三廢”不達(dá)標(biāo)排放以及酸雨等一系列問題，造成我國耕地污染不斷積累和加重。農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品的安全性正遇到前所未有的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，農(nóng)業(yè)污染已成為困擾我國農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要問題。工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生的固體廢棄物既含有氮磷鉀鈣鎂硫等大量和中量元素，還含有對作物生長起重要作用的硼、銅、鐵、錳、鋅等微量元素和大量的有機(jī)質(zhì)，是一種遲、速兼?zhèn)涞姆柿?。因此，用該廢棄物制成的肥料具有速效、遲效兩種功能，可做基肥和追肥，既可減少化月巴、農(nóng)藥的施用量，降低成本，又能有效地提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)?；钚杂袡C(jī)菌可將無機(jī)元素轉(zhuǎn)化為有益植物生長的有機(jī)化合物，改善土壤氧化還原條件，減低氮素脫氧和氧化過程，從而降低硝酸鹽含量。相對而言，生物肥料充分利用微生物的某種特征，以增加土壤中有效養(yǎng)分為目的，其施用量一般不大，在其生產(chǎn)過程中所消耗的能量也很少，且施用生物肥料的同時還可減少化肥的施用量，因而節(jié)約了施肥成本。復(fù)合微生物肥料不僅可以提高化學(xué)肥料的有效利用率，還有改善土壤的功效。應(yīng)用試驗(yàn)表明用孢芽孢桿菌生產(chǎn)的復(fù)合微生物肥料連續(xù)使用兩年以上，土壤中有益放線菌數(shù)量增加8. 4倍，固氮菌增加39倍，從而達(dá)到活化、蔬松土壤，提高土壤肥力的作用，有益微生物菌的大量繁殖，可以把多年沉積固定在土壤中的化學(xué)肥料活化后再一次供農(nóng)作物吸收利用。同時土壤中側(cè)孢芽孢桿菌數(shù)量的增力口，對土傳真菌性病害以及根結(jié)線蟲能進(jìn)行有效生物防治，其防治率可高達(dá)70-80%，與化學(xué)農(nóng)藥防效相當(dāng)，從而減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，提高農(nóng)作物的品質(zhì)和產(chǎn)量以及抗重茬的能力。復(fù)合微生物肥料在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用表明，在化學(xué)肥料利用率的提高，疏松土壤，減少江河污染，培肥地力，減少病蟲害的發(fā)生，增強(qiáng)作物的抗逆性等方面都有著非常好的效果。有機(jī)菌液是活性有機(jī)菌肥的核心，直接決定了活性有機(jī)菌肥的功效?，F(xiàn)有技術(shù)中活性有機(jī)菌肥的菌種一般從菌種庫中選擇。有些菌種在實(shí)驗(yàn)室條件下其功能表現(xiàn)優(yōu)異，但在實(shí)際生產(chǎn)肥料或用于農(nóng)田時，由于環(huán)境的差異，可能存活率低，使用后難以達(dá)到預(yù)期的效果。另外，現(xiàn)有技術(shù)中也有采用復(fù)合菌種(不產(chǎn)生拮抗作用的2-3個菌株)來生產(chǎn)肥料，但是用復(fù)合菌種是一個比較復(fù)雜的問題，不能簡單地認(rèn)為，微生物的復(fù)合(或聯(lián)合)就是好多菌混合發(fā)酵，或是簡單的發(fā)酵后混合、組合。各菌種生長需要的溫度、適度、酸堿度等指標(biāo)不同，之間可能存在拮抗現(xiàn)象，可能造成復(fù)合菌種效果不理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種有機(jī)菌液及其制備方法，其菌種性強(qiáng)，功能多樣，與有機(jī)肥中的營養(yǎng)元素復(fù)合好。本發(fā)明的另一目的是提供該有機(jī)菌液的應(yīng)用。本發(fā)明有機(jī)菌液的制備方法采用的技術(shù)方案是
一種有機(jī)菌液的制備方法，其特征在，包括如下步驟
A)菌種選擇從制造有機(jī)肥的原料中選取若干樣品，從上述樣品中分離出芽孢桿菌、酵母菌、絲狀真菌、光合細(xì)菌、乳酸菌株、放線菌若干株；
通過統(tǒng)計分析，篩選上述菌株，在每個菌種中確定出效能最高的菌株作為核心菌種；在室內(nèi)培養(yǎng)條件下，將不同菌種兩兩在同一培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，觀察之間有無拮抗現(xiàn)象，若發(fā)現(xiàn)拮抗現(xiàn)象，則從其同一類中另外選擇菌株培養(yǎng)；通過比較觀察試驗(yàn)，在芽孢桿菌、酵母菌和絲狀真菌各選一種與其它菌種不拮抗的生物菌種作為必選菌種；在光合細(xì)菌菌株、乳酸菌菌株、放線菌菌株各選一種與其它菌種不拮抗的生物菌種作為可選菌種；
B)確定菌種最佳接種量和原料配比按照牛肉膏1.1% -2. 0%、蛋白胨1. 1% -2. 0%,氯化鈉O. 55% -O. 65%、瓊脂2% _3%，其余為水的基本量，制作基本培養(yǎng)基，基本培養(yǎng)基的pH值控制在6-8. 5 ;在基本培養(yǎng)基中接入上述三種必選菌種和可選菌種的一種或多種，放入搖床，裝液量為培養(yǎng)容器體積的20% -50%，搖床轉(zhuǎn)速為160-190轉(zhuǎn)/分鐘；按照菌種接種量、培養(yǎng)基中的每一種物質(zhì)設(shè)置基本量增加10%、增加20%、減少10%和減少20%共4個級別，改變培養(yǎng)基各成分的組成；觀察各菌株生長情況，確定最佳接種量，確定培養(yǎng)基中各組分適合的比例，制作出選擇性培養(yǎng)基；
C)斜面菌種制備在選擇性培養(yǎng)基中分別接入上述菌種，置于28°C恒溫箱培養(yǎng)72h，之后置于冰箱內(nèi)保存，備用；
D)克氏瓶菌種制備取克氏瓶若干個，分別裝入選擇性培養(yǎng)基，滅菌后每個克氏瓶中接入一種斜面菌種，置于36-45°C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)72h,備用；
E)菌種懸浮液制備將上述克氏瓶中的菌種在無菌條件下加入250mL無菌水，制成懸浮液；將克氏瓶中懸浮液倒入無菌的減壓瓶內(nèi)，包扎后即為菌種懸浮液；
F)一級種子液制備在減壓瓶中將上述懸浮液接入滅菌的一級種子液中，在36-45°C下發(fā)酵20h，通氣量與液體體積比值為O. 5-1. 0，攪拌速度為150-250轉(zhuǎn)/分；所述一級種子液中選擇性培養(yǎng)基的重量比為50% _60%，其余為上述各種菌種懸浮液；
G)有機(jī)菌液制備在發(fā)酵罐中注入選擇性培養(yǎng)基，將上述種子液按照占選擇性培養(yǎng)基重量10 % -12 %的比例接入發(fā)酵罐，在36-45°C下培養(yǎng)72h，通氣量與液體體積比值為O. 5-1.0，攪拌速度為150-250轉(zhuǎn)/分；當(dāng)含菌量達(dá)到活菌數(shù)50億株/mL以上，即為有機(jī)菌液。進(jìn)一步，所述制造有機(jī)肥的原料是指草木灰、糠醛渣、糞便、活性淤泥、農(nóng)作物秸桿等富含有機(jī)質(zhì)工農(nóng)業(yè)廢棄物中的一種或數(shù)種。
進(jìn)一步，在步驟F與步驟G之間還包括二級種子液制備的步驟，所述二級種子液制備的步驟為在選擇性培養(yǎng)基中加入O. 3% -O. 5%的淀粉、O. 5% -O. 7%的蔗糖、O. 3%的磷酸氫二鉀、O. 16% -O. 20%的磷酸二氫鉀、4. 0% -5. O %的豆柏、10%的鋸末后注入發(fā)酵罐；接種選擇性培養(yǎng)基重量比為2% -5%的一級種子液；溫度控制在36-45°C，攪拌轉(zhuǎn)速150-180轉(zhuǎn)/分，通氣量與液體體積比值為O. 5-1. 0，發(fā)酵24h后制成二級種子液。進(jìn)一步，所述步驟F中，在減壓瓶中，芽孢桿菌、酵母菌和絲狀真菌的菌種懸浮液接入量分別占總菌種懸浮液接入量的30% -50%、15% -25%、15% -25%。 進(jìn)一步，所述步驟F中，在減壓瓶中，接入懸浮液時，先接入必選菌種的懸浮液，培養(yǎng)一段時間以后再接入可選菌種的懸浮液。所述草木灰為生物發(fā)電廠中植物燃燒后的灰燼，含鉀量為6_12%。所述糠醛渣是生物質(zhì)類物質(zhì)如玉米芯、玉米桿、稻殼、棉籽殼以及農(nóng)副產(chǎn)品加工下腳料中的聚戊糖成分水 解生產(chǎn)糠醛產(chǎn)生的生物質(zhì)類廢棄物；優(yōu)選有機(jī)質(zhì)含量大于70%以上的糠醛渣。所述動物糞便為人畜的糞便，機(jī)質(zhì)含量一般大于14%。所述農(nóng)作物秸桿為水稻、小麥等農(nóng)作物秸桿，有機(jī)質(zhì)含量平均為15%左右。所述城市淤泥為城市污水處理廠處理生活污水的淤泥，有機(jī)質(zhì)含量一般在50%以上。經(jīng)本發(fā)明研究人員發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有理論中的一些制作有機(jī)菌肥的有益菌種，在實(shí)際生產(chǎn)中并不能充分發(fā)揮其應(yīng)有的效果，這是因?yàn)閭鹘y(tǒng)理論并不能完全模擬實(shí)際生產(chǎn)中的情況，例如溫度、濕度、酸堿度等情況，可能存在著很大的誤差。有機(jī)肥料所使用的草木灰、糠醛渣、動物糞便等，其成分、沉積年份、所處的濕度、溫度情況差異很大，如果簡單按照傳統(tǒng)的理論選用菌種，很難達(dá)到理想的效果。為此，發(fā)明人想到了以現(xiàn)有理論為指導(dǎo)，從實(shí)際生產(chǎn)的原料中選取菌種。因?yàn)槊恳粋€環(huán)境都有其特定的微生物菌群，只有從這個環(huán)境中選取的經(jīng)過競爭，存活量大的優(yōu)勢菌種，才能有效保證選擇的菌種在用該原料制得的肥料中活性更高。另外，微生物菌的種類不同，其特點(diǎn)、功效，使用后效果差異較大，微生物菌功能有單一和多功能之分。過去常用的微生物菌有固氮菌(根瘤菌)，溶磷菌(巨大芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌)，硅酸鹽細(xì)菌即解鉀菌(膠質(zhì)芽孢桿菌)等，功能比較單一。復(fù)合菌(不產(chǎn)生拮抗作用的2-3個菌株)有著相互協(xié)同的作用效果，單獨(dú)使用單一一類菌種，均不能達(dá)到本發(fā)明有機(jī)肥的效果。選擇微生物菌時，在考慮其功能特點(diǎn)的同時，必需考慮所使用的微生物菌的抗逆性，即選擇抗高溫、抗干燥、抗酸堿、抗鹽份能力強(qiáng)的微生物菌種，這是復(fù)合微生物肥料產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵因素。有些菌種在實(shí)驗(yàn)室條件下其功能表現(xiàn)優(yōu)異，但在肥料生產(chǎn)或保存過程中大量死亡，存活率低，使用后難以達(dá)到預(yù)期的效果，因此在選擇微生物菌時應(yīng)從功能的特點(diǎn)和抗逆性綜合考慮選擇，其綜合指標(biāo)高的菌株才是優(yōu)秀的復(fù)合微生物肥料生產(chǎn)和應(yīng)用的菌種。芽孢桿菌(Bacillaceae)是細(xì)菌的一科，能形成芽孢(內(nèi)生孢子)的桿菌或球菌。包括芽孢桿菌屬、芽孢乳桿菌屬、梭菌屬、脫硫腸狀菌屬和芽孢八疊球菌屬等。它們對外界有害因子抵抗力強(qiáng)，分布廣，存在于土壤、水、空氣以及動物腸道等處。孢芽桿菌的作用是保濕性強(qiáng)，形成強(qiáng)度極為優(yōu)良的天然材料聚麩胺酸，為土壤的保護(hù)膜，防止肥份及水分流失；有機(jī)質(zhì)分解力強(qiáng)，增殖的同時，會釋出高活性的分解酵素，將難分解的大分子物質(zhì)分解成可利用的小分子物質(zhì)；產(chǎn)生豐富的代謝生成物，合成多種有機(jī)酸、酶、生理活性等物質(zhì)，及其它多種容易被利用的養(yǎng)份；抑菌、滅害力強(qiáng)，具有占據(jù)空間優(yōu)勢，抑制有害菌、病原菌等有害微生物的生長繁殖；除臭，可以分解產(chǎn)生惡臭氣體的有機(jī)物質(zhì)、有機(jī)硫化物、有機(jī)氮等，大大改善場所的環(huán)境。其特性是代謝快、繁殖快，四小時增殖10萬倍，標(biāo)準(zhǔn)菌四小時僅可繁殖6倍；生命力強(qiáng)，無濕狀態(tài)可耐低溫一 60°C、耐高溫+280°C，耐強(qiáng)酸、耐強(qiáng)堿、抗菌消毒、耐高氧(嗜氧繁殖)、耐低氧(厭氧繁殖)；體積大，體積比一般病源菌分子大四倍數(shù)，占據(jù)空間優(yōu)勢，抑制有害菌的生長繁殖。由于芽孢對熱、干燥、輻射、化學(xué)消毒劑和其他理化因素有較強(qiáng)的抵抗力，所以芽孢桿菌是我們從生產(chǎn)肥料的有機(jī)物中選擇的目標(biāo)菌種之一。酵母菌是一種單細(xì)胞真菌，在有氧和無氧環(huán)境下都能生存，屬于兼性厭氧菌。在有氧的情況下，它能把有機(jī)質(zhì)中的糖分解成二氧化碳和水，在有氧存在時，酵母菌生長較快。用酵母菌作發(fā)酵劑制作生態(tài)有機(jī)肥，具有發(fā)酵快，發(fā)酵好，既能高溫發(fā)酵，又能低溫發(fā)酵，大大縮短制作時間，降低成本等特點(diǎn)，所以酵母菌是我們從生產(chǎn)肥料的有機(jī)物中選擇的目標(biāo)菌種之一。
絲狀真菌即是霉菌。霉菌是絲狀真菌的俗稱，意即"發(fā)霉的真菌〃，它們往往能形成分枝繁茂的菌絲體，但又不象蘑菇那樣產(chǎn)生大型的子實(shí)體。在潮濕溫暖的地方，很多物品上長出一些肉眼可見的絨毛狀、絮狀或蛛網(wǎng)狀的菌落，那就是霉菌。霉菌的孢子具有小、輕、干、多，以及形態(tài)色澤各異、休眠期長和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，每個個體所產(chǎn)生的孢子數(shù)，經(jīng)常是成千上萬的，有時竟達(dá)幾百億、幾千億甚至更多。這些特點(diǎn)有助于霉菌在自然界中隨處散播和繁殖。植物利用的鉀主要來自土壤，但土壤中絕大部分鉀是以礦物鉀的形式存在，多存在于鋁硅酸鹽礦石中，不易被植物直接利用。只有當(dāng)?shù)V物鉀經(jīng)過物理、化學(xué)及生物風(fēng)化作用轉(zhuǎn)變?yōu)樗傩р浐?，才為植物所利用。絲狀真菌對含鉀礦物具有極強(qiáng)的分解作用。所以絲狀真菌是我們從生產(chǎn)肥料的有機(jī)物中選擇的目標(biāo)菌種之一。光合細(xì)菌(簡稱PSB)是地球上出現(xiàn)最早、自然界中普遍存在、具有原始光能合成體系的原核生物，是在厭氧條件下進(jìn)行不放氧光合作用的細(xì)菌的總稱，是一類沒有形成芽孢能力的革蘭氏陰性菌，是一類以光作為能源、能在厭氧光照或好氧黑暗條件下利用自然界中的有機(jī)物、硫化物、氨等作為供氫體兼碳源進(jìn)行光合作用的微生物。光合細(xì)菌適應(yīng)性強(qiáng)，能忍耐高濃度的有機(jī)廢水，對酚、氰等毒物有一定的忍受和分解能力，具有較強(qiáng)的分解轉(zhuǎn)化能力。光合細(xì)菌可增加生物固氮作用，提高根際固氮效應(yīng)，增進(jìn)土壤肥力。此外，光合細(xì)菌對作物病害控制方面也有一定作用。光合細(xì)菌是我們從生產(chǎn)肥料的有機(jī)物中選擇的目標(biāo)菌種之一。乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱。凡是能從葡萄糖或乳糖的發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌統(tǒng)稱為乳酸菌。乳酸菌可以降低土壤中硝酸離子濃度，解決土壤酸化問題；乳酸菌體內(nèi)細(xì)胞之中水分約70%，有大量乳酸菌時，可保持土壤水分，同時乳酸菌還可以吸收空氣中約20%的水分保持一定的土壤水分；乳酸菌含糖及乳酸，因而促進(jìn)了那些以微生物及其分解產(chǎn)物為食的土壤微型動物(如蚯蚓類、甲蟲類)的數(shù)量大量的增加，使整個耕層的微生態(tài)系統(tǒng)組成發(fā)生根本變化，提高了土壤生物活性和緩沖能力；有效微生物在土壤中的迅速繁殖和不斷補(bǔ)充，抑制了土壤中病原微生物的侵襲和發(fā)展；抑制有害微生物的生存與繁殖，減輕并逐步消除土傳病蟲害和連作障礙；不用除草劑，可抑制與消除雜草乳酸菌能生成乳酸和生理活性物質(zhì)，乳酸可使雜草的種皮變軟，使其容易吸收水份，并受生理活性物質(zhì)的影響而打破休眠；增強(qiáng)植物的代謝功能，提高光合作用，促進(jìn)種子發(fā)芽，根系發(fā)達(dá)，早開花，多結(jié)實(shí)。乳酸菌是我們從生產(chǎn)肥料的有機(jī)物中選擇的目標(biāo)菌種之一。放線菌(Actinomycete)是原核生物的一個類群。大多數(shù)有發(fā)達(dá)的分枝菌絲。放線菌與人類的生產(chǎn)和生活關(guān)系極為密切，目前廣泛應(yīng)用的抗生素約70%是各種放線菌所產(chǎn)生。典型絲狀放線菌主要屬于鏈霉菌屬(StrepHomyces)和小單孢菌屬(Micromonospora)兩類。均屬好氣性異養(yǎng)型，能夠廣泛利用纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)、木質(zhì)素等含碳和含氮化合物。最適pH值為6.8-7.5，最適溫度為25-30°〇。農(nóng)田土壤中檢出的放線菌主要是鏈霉菌屬。放線菌是我們從生產(chǎn)肥料的有機(jī)物中選擇的目標(biāo)菌種之一。菌株的篩選和聯(lián)合菌群的應(yīng)用，是許多科學(xué)家正在致力的工作。聯(lián)合菌群的應(yīng)用是一個比較復(fù)雜的問題，不能簡單地認(rèn)為，微生物的復(fù)合(或聯(lián)合)就是好多菌混合發(fā)酵，或是簡單的發(fā)酵后混合、組合。新菌種的選育、改造和重組，單一功能向多功能發(fā)展(如肥藥合一)，與營養(yǎng)元素或有機(jī)物的合理復(fù)合等 。生物技術(shù)的發(fā)展給菌株的重組、改造提供了基礎(chǔ)和可能。發(fā)明人經(jīng)實(shí)踐生產(chǎn)、摸索發(fā)現(xiàn)，從生產(chǎn)肥料的有機(jī)物中選擇含量最高以上六種細(xì)菌，只要相互之間不發(fā)生拮抗，就能發(fā)揮很好的肥效，達(dá)到改善土壤的目的。篩選菌種時，可以采用代謝通量分析方法。確定菌種最佳接種量和原料配比時，也可以采用正交試驗(yàn)和響應(yīng)面法，這樣效率高；在相同發(fā)酵時間情況下，發(fā)酵更徹底，產(chǎn)品質(zhì)量更高，沒有臭味。代謝通量分析(metabolic flux analysis, MFA)是用計量矩陣模型表示擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)下胞內(nèi)反應(yīng)的一種定量分析方法。它假定一定時間內(nèi)，胞內(nèi)中間代謝產(chǎn)物的濃度不變，根據(jù)代謝途徑中各反應(yīng)的計量關(guān)系以及實(shí)驗(yàn)中測得的底物消耗速率或者產(chǎn)物生成速率，基于質(zhì)量平衡以及可能的能量平衡來確定未知的反應(yīng)速率，進(jìn)而確定代謝網(wǎng)絡(luò)的通量分配圖。代謝通量分析不僅精確的定量描述代謝特性，還可以提供一些菌體生理方面更深入的一些信息。通過比較代謝通量的變化，我們就可以對遺傳和環(huán)境擾動的影響給予充分的評價，并能對特定途徑和反應(yīng)的重要性進(jìn)行準(zhǔn)確的描述。正交試驗(yàn)設(shè)計(Orthogonalexperimental design)是研究多因素多水平的又一種設(shè)計方法,它是根據(jù)正交性從全面試驗(yàn)中挑選出部分有代表性的點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，這些有代表性的點(diǎn)具備了“均勻分散，齊整可比”的特點(diǎn)，正交試驗(yàn)設(shè)計是分式析因設(shè)計的主要方法。是一種高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計方法。本發(fā)明統(tǒng)計分析、篩選高效微生物菌劑時，可以參考代謝通量分析的理論。增加二級種子液培育步驟，可以進(jìn)一步擴(kuò)繁菌種。由于芽孢桿菌、酵母菌和絲狀真菌在實(shí)際生產(chǎn)中作用最大，可優(yōu)先繁殖；其加入的量也可以較可選菌種大一些。本發(fā)明所述的有機(jī)菌液，由上述方法制得。該有機(jī)菌液可在微生物肥料生產(chǎn)用作菌種母劑，并可按O. 5-1 %比例添加到有機(jī)肥中混合使用。由于這些菌種是從生產(chǎn)微生物肥料的原料中選育的，通過了自然選擇，因此活性更高，微生物的存活率達(dá)到95%以上。由于菌種之間不產(chǎn)生拮抗，因而可以共生；由于菌種多，各菌種之間有不同的功效，因此能達(dá)到復(fù)合的效果。該有機(jī)菌液也可以直接用作拌種劑，作為拌種劑時，添加到農(nóng)作物種子中混合，用于播種到農(nóng)田中。該有機(jī)菌液也可用于制作固體菌粉，所述固體菌粉的制作方法為向發(fā)酵液中加入吸附基質(zhì)吸附，經(jīng)板框過濾機(jī)脫水濃縮，再在40-60°C熱風(fēng)中干燥，形成含水量< 5%的固體菌粉；所述吸附基質(zhì)為草炭土、輕質(zhì)碳酸鈣、硅藻土或粘土中的一種或數(shù)種。固體菌粉可以加入有機(jī)肥中，也可作為拌種劑使用。
本發(fā)明從草木灰、糠醛渣等固體廢棄物中篩選、培育菌種液，有助于使這些固體廢棄物充分發(fā)酵，并通過自身活動分解灰分及土壤中的無機(jī)磷化物和無機(jī)鉀鹽，使易流失的水溶性無機(jī)鹽經(jīng)過一系列生物降解化合反應(yīng)，形成了 K4[Fe(CN)6]等大分子多酸型絡(luò)合物、多齒配位體和各種螯合物，減少養(yǎng)分流失，以提高肥效和利用率；同時由于利用了工農(nóng)業(yè)廢渣，也是實(shí)現(xiàn)環(huán)保的一大舉措。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1。從要生產(chǎn)肥料的糠醛渣、草木灰采集含有特定微生物的有機(jī)物質(zhì)樣品100個，分離出芽孢桿菌56株、酵母菌132株、光合菌27株、放線菌18株、乳酸菌23株、絲狀真菌18株。通過統(tǒng)計分析，從各類菌種中確定16株優(yōu)良的菌株。對16種備選菌株按照芽孢桿菌、酵母菌、放線菌和絲狀真菌、光合菌和乳酸菌進(jìn)行歸類，首先在每一類中選擇出效能最高的菌株作為核心菌種。在室內(nèi)培養(yǎng)條件下，將不同菌種兩兩在同一培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，觀察之間有 無拮抗現(xiàn)象，若發(fā)現(xiàn)拮抗現(xiàn)象，則從其同一類中另外選擇菌株培養(yǎng)。通過比較觀察試驗(yàn)，確定芽孢桿菌、酵母菌和絲狀真菌為生物發(fā)酵劑的基本組成菌種，另外I株光合菌菌株、I株乳酸菌菌株和I株放線菌菌株為產(chǎn)品的組成菌種，產(chǎn)品共含6個菌種。在實(shí)驗(yàn)室模擬工廠生產(chǎn)發(fā)酵過程，對影響發(fā)酵的各因素逐一進(jìn)行試驗(yàn)，確定適合每種有益微生物的最適培養(yǎng)條件。按照牛肉膏1. 1% -2. 0%、蛋白胨1. 1% -2. 0%、氯化鈉O. 55 % -O. 65 %、瓊脂2 % -3 %，其余為水的基本量，制作基本培養(yǎng)基，基本培養(yǎng)基的pH值控制在6-8. 5 ;在基本培養(yǎng)基中接入上述三種必選菌種和可選菌種的一種或多種，放入搖床，裝液量為培養(yǎng)容器體積的20%-50%，搖床轉(zhuǎn)速為160-190轉(zhuǎn)/分鐘；按照菌種接種量、培養(yǎng)基中的每一種物質(zhì)設(shè)置基本量增加10%、增加20%、減少10%和減少20%共4個級別，改變培養(yǎng)基各成分的組成；觀察各菌株生長情況，確定培養(yǎng)基中各組分適合的比例，制作出選擇性培養(yǎng)基。正常情況下，芽孢桿菌在20-50°C范圍內(nèi)均能正常生長，酵母菌的生長溫度范圍在10-50°C，放線菌和絲狀真菌的生長溫度在20-70°C。也可以在各生長溫度范圍內(nèi)縮小溫度梯度試驗(yàn)，確定其最佳培育溫度。斜面菌種制備。在選擇性培養(yǎng)基中分別接入上述菌種，置于28°C恒溫箱培養(yǎng)72h，之后置于冰箱內(nèi)保存，備用；
克氏瓶菌種制備取克氏瓶若干個，分別裝入選擇性培養(yǎng)基，滅菌后每個克氏瓶中接入一種斜面菌種，置于36_45°C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)72h,備用。菌種懸浮液制備將上述克氏瓶中的菌種在無菌條件下加入250mL無菌水,制成懸浮液；將克氏瓶中懸浮液倒入無菌的減壓瓶內(nèi)，包扎后即為菌種懸浮液。一級種子液制備在減壓瓶中將上述懸浮液接入滅菌的一級種子液中，在36-45°C下發(fā)酵20h，通氣量與液體體積比值為O. 5-1. 0，攪拌速度為150-250轉(zhuǎn)/分；所述一級種子液中選擇性培養(yǎng)基的重量比為50% _60%，其余為上述各種菌種懸浮液。有機(jī)菌液制備在發(fā)酵罐中注入選擇性培養(yǎng)基，將上述種子液按照占選擇性培養(yǎng)基重量10 % -12 %的比例接入發(fā)酵罐，在36-45°C下培養(yǎng)72h，通氣量與液體體積比值為
O.5-1. 0，攪拌速度為150-250轉(zhuǎn)/分；當(dāng)含菌量達(dá)到活菌數(shù)50億株/mL以上，即為有機(jī)菌液。
實(shí)施例2。從生產(chǎn)肥料的活性污泥、畜禽糞便、草木灰、農(nóng)作物秸桿中采集含有特定微生物的有機(jī)物質(zhì)樣品100個，分離出芽孢桿菌52株、酵母菌112株、光合菌26株、放線菌20株、乳酸菌25株、絲狀真菌20株。通過統(tǒng)計分析，從各類菌種中確定24株優(yōu)良的菌株。對24種備選菌株按照芽孢桿菌、酵母菌、放線菌和絲狀真菌、光合菌和乳酸菌進(jìn)行歸類，首先在每一類中選擇出效能最高的菌株作為核心菌種。在室內(nèi)培養(yǎng)條件下，將不同菌種兩兩在同一培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，觀察之間有無拮抗現(xiàn)象，若發(fā)現(xiàn)拮抗現(xiàn)象，則從其同一類中另外選擇菌株培養(yǎng)。通過比較觀察試驗(yàn)，確定芽孢桿菌、酵母菌和絲狀真菌為生物發(fā)酵劑的基本組成菌種，另外I株光合菌菌株、I株乳酸菌菌株，產(chǎn)品共含5個菌種。在實(shí)驗(yàn)室模擬工廠生產(chǎn)發(fā)酵過程 ，對影響發(fā)酵的各因素逐一進(jìn)行試驗(yàn)，確定適合每種有益微生物的最適培養(yǎng)條件?？衫酶叽x通量分析技術(shù)篩選高效微生物菌劑，采用正交試驗(yàn)和響應(yīng)面法確定菌種最佳接種量和原料配比，具體做法是按照牛肉膏1.1% -2. 0%、蛋白胨1. 1% -2. 0%、氯化鈉O. 55% -O. 65%、瓊脂2_3%，其余為水的基本量，制作基本培養(yǎng)基，基本培養(yǎng)基的PH值控制在6-8. 5 ;在基本培養(yǎng)基中接入上述三種必選菌種和可選菌種的一種或多種，放入搖床，裝液量為培養(yǎng)容器體積的20-50%,搖床轉(zhuǎn)速為160-190轉(zhuǎn)/分鐘；按照菌種接種量、培養(yǎng)基中的每一種物質(zhì)設(shè)置基本量增加10%、增加20%、減少10%和減少20%共4個級別，改變培養(yǎng)基各成分的組成；觀察各菌株生長情況，確定培養(yǎng)基中各組分適合的比例，制作出選擇性培養(yǎng)基。正常情況下，芽孢桿菌在20-50°C范圍內(nèi)均能正常生長，酵母菌的生長溫度范圍在10-50°C，放線菌和絲狀真菌的生長溫度在20-70°C。也可以在各生長溫度范圍內(nèi)縮小溫度梯度試驗(yàn)，確定其最佳培育溫度。高代謝通量分析技術(shù)是指是用計量矩陣模型表示擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)下胞內(nèi)反應(yīng)的一種定量分析方法。它假定一定時間內(nèi)，胞內(nèi)中間代謝產(chǎn)物的濃度不變，根據(jù)代謝途徑中各反應(yīng)的計量關(guān)系以及實(shí)驗(yàn)中測得的底物消耗速率或者產(chǎn)物生成速率，基于質(zhì)量平衡以及可能的能量平衡來確定未知的反應(yīng)速率，進(jìn)而確定代謝網(wǎng)絡(luò)的通量分配圖。代謝通量分析不僅精確的定量描述代謝特性，還可以提供一些菌體生理方面更深入的一些信息。通過比較代謝通量的變化，我們就可以對遺傳和環(huán)境擾動的影響給予充分的評價，并能對特定途徑和反應(yīng)的重要性進(jìn)行準(zhǔn)確的描述。正交試驗(yàn)又叫正交試驗(yàn)設(shè)計(Orthogonal experimental design)是研究多因素多水平的又一種設(shè)計方法，它是根據(jù)正交性從全面試驗(yàn)中挑選出部分有代表性的點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，這些有代表性的點(diǎn)具備了“均勻分散，齊整可比”的特點(diǎn)，正交試驗(yàn)設(shè)計是分式析因設(shè)計的主要方法。是一種高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計方法。日本著名的統(tǒng)計學(xué)家田口玄一將正交試驗(yàn)選擇的水平組合列成表格，稱為正交表。響應(yīng)面是指通過一系列確定性實(shí)驗(yàn)，用多項(xiàng)式函數(shù)來近似隱式極限狀態(tài)函數(shù)。通過合理地選取試驗(yàn)點(diǎn)和迭代策略，來保證多項(xiàng)式函數(shù)能夠在失效概率上收斂于真實(shí)的隱式極限狀態(tài)函數(shù)的失效概率。斜面菌種制備。在選擇性培養(yǎng)基中分別接入上述菌種，置于28°C恒溫箱培養(yǎng)72h，之后置于冰箱內(nèi)保存，備用；
克氏瓶菌種制備取克氏瓶若干個，分別裝入選擇性培養(yǎng)基，滅菌后每個克氏瓶中接A一種斜面菌種，置于36_45°C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)72h。菌種懸浮液制備將上述克氏瓶中的菌種在無菌條件下加入250mL無菌水,制成懸浮液；將克氏瓶中懸浮液倒入無菌的減壓瓶內(nèi)，包扎后即為菌種懸浮液。在減壓瓶芽孢桿菌、酵母菌和絲狀真菌的菌種懸浮液接入量分別占總菌種懸浮液接入量的30% -50%,15% -25%、15% -25%。接入菌種是先接入芽孢桿菌、酵母菌和絲狀真菌的菌種懸浮液，培養(yǎng)8小時以后再接入其他菌種的懸浮液。一級種子液制備在減壓瓶中將上述懸浮液接入滅菌的一級種子液中，在36-45°C下發(fā)酵20h，通氣量與液體體積比值為O. 5-1. 0，攪拌速度為150-250轉(zhuǎn)/分；所述一級種子液中選擇性培養(yǎng)基的重量比為50% _60%，其余為上述各種菌種懸浮液。二級種子液制備在選擇性培養(yǎng)基中加入O. 3% -O. 5%的淀粉、O. 5% -O. 7%的蔗糖、O. 3%的磷酸氫二鉀、O. 16% -O. 20%的磷酸二氫鉀、4. 0-5. O %的豆柏、10%的鋸末后注入發(fā)酵罐；接種選擇性培養(yǎng)基重量比為2% -5%的一級種子液；溫度控制在36-45°C，攪拌轉(zhuǎn)速150-180轉(zhuǎn)/分，通氣量與液體體積比值為O. 5-1. 0，發(fā)酵24小時后制成二級種子液。有機(jī)菌液制備在發(fā)酵罐中注入選擇性培養(yǎng)基，將上述種子液按照占選擇性培養(yǎng)基重量10 % -12 %的比例接入發(fā)酵罐，在36-45°C下培養(yǎng)72h，通氣量與液體體積比值為 O. 5-1. 0，攪拌速度為150-250轉(zhuǎn)/分；當(dāng)含菌量達(dá)到活菌數(shù)50億株/mL以上，即為有機(jī)菌液。實(shí)施例3。一種拌種劑，即實(shí)施例2制得的有機(jī)菌液。按照占播種油菜種子的重量的
O.05-0. 10%的比例添加到農(nóng)作物種子中混合，用于播種到農(nóng)田中。選擇有機(jī)質(zhì)含量為45%的有機(jī)肥料，不采用拌種劑拌種，編號為I ;另外一組有機(jī)質(zhì)含量為45%的有機(jī)肥料，采用上述方法拌種，編號為2。 按50kg/畝的量分別將1、2施于兩塊油菜田中，油菜為品種為秦優(yōu)7號，播種后20天測量各油菜田的油菜葉柄長度、葉綠素含量、可溶性糖含量。結(jié)果表明，油菜葉柄長度、葉綠素含量、可溶性糖均提高了 10%以上。實(shí)施例4?！N活性有機(jī)菌肥，該有機(jī)菌肥為發(fā)酵后有機(jī)肥加入實(shí)施例2制得菌種液后制得。加入量為重量比的0.7%。所述有機(jī)肥由糠醛渣、草木灰、活性污泥堆放后制得，其中有機(jī)質(zhì)的含量為45%。堆放要求寬4m，高2m。保持溫度為65_75°C，含水量為67-70%，pH值為8. 0-9. O。每1-2天翻垛一次，檢測微生物含量、pH值、溫度、含水量、有機(jī)質(zhì)含量等指標(biāo)，視實(shí)際情況向混合物中加入水、菌液、糠醛渣、草木灰，視腐熟程度或垛內(nèi)溫度確定翻垛次數(shù)。當(dāng)垛內(nèi)含水量穩(wěn)定在10% -20%，溫度為頂?shù)椒€(wěn)定在45-50°C、pH值降到6. 5-6. 9時，腐熟過程完成，得到有機(jī)肥。加入上述菌種液后獲得有機(jī)菌肥。
權(quán)利要求
1.一種有機(jī)菌液的制備方法，其特征在，包括如下步驟 A)菌種選擇從制造有機(jī)肥的原料中選取若干樣品，從上述樣品中分離出芽孢桿菌、酵母菌、絲狀真菌、光合細(xì)菌、乳酸菌株、放線菌若干株； 通過統(tǒng)計分析，篩選上述菌株，在每個菌種中確定出效能最高的菌株作為核心菌種；在室內(nèi)培養(yǎng)條件下，將不同菌種兩兩在同一培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，觀察之間有無拮抗現(xiàn)象，若發(fā)現(xiàn)拮抗現(xiàn)象，則從其同一類中另外選擇菌株培養(yǎng)；通過比較觀察試驗(yàn)，在芽孢桿菌、酵母菌和絲狀真菌各選一種與其它菌種不拮抗的生物菌種作為必選菌種；在光合細(xì)菌菌株、乳酸菌菌株、放線菌菌株各選一種與其它菌種不拮抗的生物菌種作為可選菌種； B)確定菌種最佳接種量和原料配比按照牛肉膏1.1% -2. O %、蛋白胨1. 1% -2. O %、氯化鈉O. 55% -O. 65%、瓊脂2% _3%，其余為水的基本量，制作基本培養(yǎng)基，基本培養(yǎng)基的pH值控制在6-8. 5 ;在基本培養(yǎng)基中接入上述三種必選菌種和可選菌種的一種或多種，放入搖床，裝液量為培養(yǎng)容器體積的20% -50%，搖床轉(zhuǎn)速為160-190轉(zhuǎn)/分鐘；按照菌種接種量、培養(yǎng)基中的每一種物質(zhì)設(shè)置基本量增加10%、增加20%、減少10%和減少20%共4個級別，改變培養(yǎng)基各成分的組成；觀察各菌株生長情況，確定最佳接種量，確定培養(yǎng)基中各組分適合的比例，制作出選擇性培養(yǎng)基； C)斜面菌種制備在選擇性培養(yǎng)基中分別接入上述菌種，置于28°C恒溫箱培養(yǎng)72h，之后置于冰箱內(nèi)保存，備用； D)克氏瓶菌種制備取克氏瓶若干個，分別裝入選擇性培養(yǎng)基，滅菌后每個克氏瓶中接入一種斜面菌種，置于36-45°C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)72h,備用； E)菌種懸浮液制備將上述克氏瓶中的菌種在無菌條件下加入250mL無菌水，制成懸浮液；將克氏瓶中懸浮液倒入無菌的減壓瓶內(nèi)，包扎后即為菌種懸浮液； F)一級種子液制備在減壓瓶中將上述懸浮液接入滅菌的一級種子液中，在36-45°C下發(fā)酵20h，通氣量與液體體積比值為O. 5-1. 0，攪拌速度為150-250轉(zhuǎn)/分；所述一級種子液中選擇性培養(yǎng)基的重量比為50% _60%，其余為上述各種菌種懸浮液； G)有機(jī)菌液制備在發(fā)酵罐中注入選擇性培養(yǎng)基，將上述種子液按照占選擇性培養(yǎng)基重量10% -12%的比例接入發(fā)酵罐，在36-45°C下培養(yǎng)72h，通氣量與液體體積比值為O.5-1.0，攪拌速度為150-250轉(zhuǎn)/分；當(dāng)含菌量達(dá)到活菌數(shù)50億株/mL以上，即為有機(jī)菌液。
2.如權(quán)利要求1所述的一種有機(jī)菌液的制備方法，其特征在于所述制造有機(jī)肥的原料是指草木灰、糠醛渣、糞便、活性淤泥、農(nóng)作物秸桿等富含有機(jī)質(zhì)工農(nóng)業(yè)廢棄物中的一種或數(shù)種。
3.如權(quán)利要求1所述的一種有機(jī)菌液的制備方法，其特征在于，在步驟F與步驟G之間還包括二級種子液制備的步驟，所述二級種子液制備的步驟為在選擇性培養(yǎng)基中加入O.3% -O. 5%的淀粉、O. 5% -O. 7%的蔗糖、O. 3%的磷酸氫二鉀、O. 16% -O. 20%的磷酸二氫鉀、4. O % -5. O %的豆柏、10%的鋸末后注入發(fā)酵罐；接種選擇性培養(yǎng)基重量比為2 % -5 %的一級種子液；溫度控制在36-45°C，攪拌轉(zhuǎn)速150-180轉(zhuǎn)/分，通氣量與液體體積比值為O.5-1. O,發(fā)酵24h后制成二級種子液。
4.如權(quán)利要求1或2所述的一種有機(jī)菌液的制備方法，其特征在于所述步驟F中，在減壓瓶中，芽孢桿菌、酵母菌和絲狀真菌的菌種懸浮液接入量分別占總菌種懸浮液接入量的 30% -50%U5% -25%U5% -25%。
5.如權(quán)利要求1或2所述的一種有機(jī)菌液的制備方法，其特征在所述步驟F中，在減壓瓶中，接入懸浮液時，先接入必選菌種的懸浮液，培養(yǎng)一段時間以后再接入可選菌種的懸浮液。
6.一種有機(jī)菌液，其特征在于由權(quán)利要求1到5任意一權(quán)利要求所述的方法制得。
7.如權(quán)利要求1到5任意一權(quán)利要求所述方法制得的有機(jī)菌液的應(yīng)用，其特征在于該有機(jī)菌液可以用作拌種劑，用于播種到農(nóng)田中。
8.如權(quán)利要求1到5任意一權(quán)利要求所述方法制得的有機(jī)菌液的應(yīng)用，其特征在于該有機(jī)菌液可在微生物肥料生產(chǎn)時用作菌種母劑，或按O. 5% -1 %比例添加到有機(jī)肥中混合使用。
9.如權(quán)利要求1到5任意一權(quán)利要求所述方法制得的有機(jī)菌液的應(yīng)用，其特征在于該有機(jī)菌液可用于制作固體菌粉，所述固體菌粉的制作方法為向發(fā)酵液中加入吸附基質(zhì)吸附，經(jīng)板框過濾機(jī)脫水濃縮，再在40-60°C熱風(fēng)中干燥，形成含水量< 5%的固體菌粉；所述吸附基質(zhì)為草炭土、輕質(zhì)碳酸鈣、硅藻土或粘土中的一種或數(shù)種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種有機(jī)菌液的制備方法、該方法制得的有機(jī)菌液及應(yīng)用。所述有機(jī)菌液從草木灰、糠醛渣、糞便、活性淤泥、農(nóng)作物秸稈等富含有機(jī)質(zhì)工農(nóng)業(yè)廢棄物中選育，通過篩選、擴(kuò)繁后制得。該有機(jī)菌液具有菌種活性高的特點(diǎn)，可在微生物肥料生產(chǎn)時用作菌種母劑或直接作為拌種劑使用。
文檔編號C05F11/08GK103011916SQ201210542550
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月14日
發(fā)明者顏桂榮 申請人:山東新超農(nóng)業(yè)科技有限公司