專利名稱：一種用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
精液冷凍保存與人工授精技術(shù)相結(jié)合，在現(xiàn)代畜牧業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著巨大的作用。同時(shí)精液保存利用技術(shù)也是挖掘優(yōu)秀種公驢繁殖潛能的重要手段；采用冷凍精液可提高種公驢利用效率，降低種公驢的飼養(yǎng)頭數(shù)；而且由于選優(yōu)淘劣，投入凍精生產(chǎn)的種公驢生產(chǎn)性能和遺傳品質(zhì)優(yōu)良，加快了驢遺傳改良速度；人工授精技術(shù)還可減少生殖道疾病的發(fā)生與傳播，間接提高了母驢的受胎率；冷凍精液運(yùn)輸方便，可使與配母驢不受地域限制，等于延長(zhǎng)了種公驢的利用年限和使用地域。此外，目前世界多數(shù)國(guó)家，都已建立瀕?；蛘湎?dòng)物精液基因庫(kù)，以冷凍精液的形式長(zhǎng)期大量保存，以便將來(lái)隨時(shí)取用。2006年6月2日農(nóng)業(yè)部第662號(hào)發(fā)文公告，宣布德州驢等138個(gè)畜禽品種為國(guó)家級(jí)畜禽遺傳資源保護(hù)品種。但由于驢為季節(jié)性發(fā)情動(dòng)物、母畜繁殖周期長(zhǎng)、人工授精受胎率低等原因，國(guó)內(nèi)外對(duì)驢精液保存與冷凍技術(shù)一直未開(kāi)展系統(tǒng)性的研究，也未取得顯著性的突破?，F(xiàn)階段，驢繁殖主要采用本交方式，個(gè)別技術(shù)好的畜牧改良員有時(shí)也將采出的精液(鮮精)不稀釋或低倍稀釋(I 2 4)，立即給發(fā)情母驢輸精，它適用于母驢季節(jié)性發(fā)情較明顯，而且數(shù)量較多的地區(qū)。與本交相比，效率可提高5 — 10倍。但由于我國(guó)驢品種較多，養(yǎng)殖區(qū)分布較廣，多在山區(qū)或交通不便區(qū)域，且飼養(yǎng)方式多以散戶居多，母驢分布不集中，鮮精或低倍稀釋的精液人工授精技術(shù)推廣面積較少。此外，由于驢鮮精體外保存時(shí)間極短，幾小時(shí)后活力近乎喪失殆盡，這使得驢的鮮精人工授精技術(shù)受到時(shí)間、地點(diǎn)的極大限制。因此，驢繁殖生產(chǎn)中迫切需要保存時(shí)間更長(zhǎng)、攜帶更為方便的優(yōu)質(zhì)公驢精液來(lái)改良全社會(huì)的驢生產(chǎn)群體。精液保存分為 常溫(15 °C 25 °C)保存、低溫保存(0°C 5°C)和冷凍(一79°C 一 196°C)保存三種方法。常溫保存技術(shù)研究開(kāi)展的最早，相對(duì)比較成熟，但在常溫下，一方面微生物生長(zhǎng)迅速會(huì)影響精液質(zhì)量，另一方面常溫保存時(shí)精子活力下降較快。低溫保存技術(shù)相對(duì)冷凍保存而言操作簡(jiǎn)單方便，成本低，但低溫保存技術(shù)需要既能提供營(yíng)養(yǎng)又能保護(hù)精子的非滲透性低溫保護(hù)劑及稀釋液。冷凍保存是指將精液經(jīng)過(guò)特殊處理后置于液氮或干冰中，可保存該物種種質(zhì)資源數(shù)年甚至數(shù)十年，切實(shí)發(fā)揮良種公畜的遺傳資源。但由于不同公畜精子的生物學(xué)特性不同，其冷凍保存效果也存在很大的差別。如牛精液的冷凍保存技術(shù)比較成熟，尤其牛精液細(xì)管法程序生產(chǎn)已經(jīng)普及；但羊精子凍后普遍存在情期受胎率不穩(wěn)定、受胎率低、重復(fù)率低等諸多問(wèn)題；而豬的精子因含脂量較高，脫水比較困難，冷凍-解凍后精子存在超微結(jié)構(gòu)受到損傷(如精子膜、頂體和精子核泡化、損傷或破裂)、在雌性生殖道內(nèi)壽命縮短和受精率低等問(wèn)題，因而豬精液冷凍保存還一直處于試驗(yàn)階段。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于驢精液冷凍保存的研究很少，主要原因是一方面是驢的繁殖率低，妊娠期長(zhǎng)；第二，由于不同的驢個(gè)體間其精液品質(zhì)有明顯的差異，且驢精子本身對(duì)低溫打擊特別敏感，在冷凍解凍過(guò)程中極易損傷，因而冷藏和冷凍后的精液極大地降低了受胎率；第三，由于驢發(fā)情時(shí)間長(zhǎng)，人工授精的時(shí)機(jī)掌握不準(zhǔn)確造成其妊娠率低；最后，公驢每次平均射精量多達(dá)70ml，密度較稀，且精清中的電解質(zhì)成分會(huì)促進(jìn)精子早衰。因而，驢的冷凍精液生產(chǎn)操作程度復(fù)雜，難度大，嚴(yán)重制約著冷凍精液的應(yīng)用。驢為馬屬動(dòng)物，分布甚廣，遍及亞、非、拉各大洲。德州驢，是中國(guó)五大優(yōu)良驢種之一，體格高大，結(jié)構(gòu)勻稱，外形美觀，體型方正，頭頸軀干結(jié)合良好。是改良小型驢種及作為種間雜交的一個(gè)理想品種。因此生產(chǎn)中亟需進(jìn)行德州驢精液的冷凍保存研究?？箖鰟┰诰豪鋬鲞^(guò)程中是必不可少的成分。在冷凍過(guò)程中，抗凍劑的作用主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面1.補(bǔ)充精子營(yíng)養(yǎng)；2.減少精液粘稠度；3.降低異物對(duì)精子影響；
4.緩和代謝產(chǎn)物對(duì)精子的危害作用；5.在冷凍過(guò)程中，保護(hù)精子，增強(qiáng)精子對(duì)低溫的抵抗力和抗氧化能力，減少精子的冷凍損傷。目前，在冷凍精液的制作過(guò)程中，常常選擇能夠抑制精子活動(dòng)，減少能量損耗，延長(zhǎng)精子壽命的抗凍劑。牛、羊、馬、豬精液冷凍保存的抗凍劑多用雞的卵黃，均取得了不錯(cuò)的冷凍保存效果。一方面卵黃可降低精子在向4°C降溫過(guò)程中遭受冷休克的受損程度；另一方面卵黃價(jià)格便宜，取材方便。但是，并非卵黃中所有成分均對(duì)精子有益，如卵黃中高密度脂蛋白可抑制精子呼吸，降低精子活率；第二，卵黃屬于動(dòng)物源性物質(zhì)，其中可能攜帶多種病原微生物，會(huì)引發(fā)生物安全問(wèn)題。如通過(guò)人工授精可引發(fā)受體母驢生殖道感染，影響受胎率，病原微生物還會(huì)影響精液的活率及保存時(shí)間；另一方面來(lái)源于不同時(shí)間、不同的生理狀態(tài)、不同個(gè)體的卵黃，卵黃的大小、含量多少等質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)很難統(tǒng)一，用于凍精生產(chǎn)不僅影響凍精產(chǎn)品的質(zhì)量，而且很難實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出一種用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑，解決了現(xiàn)有技術(shù)中母畜繁殖周期長(zhǎng)、人工授精受胎率低，驢的冷凍精液生產(chǎn)操作程度復(fù)雜，難度大的問(wèn)題。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的一種用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑，每IOOmL抗凍劑中包括下列組分酪蛋白1. O 3. 0g、葡萄糖 2. O 3. 0g、乳糖1. O 2. 0g、HEPES BUFFER3. O 6. 0g、甘油2. O 3. OmL、卵黃2 4mL、青霉素45 55萬(wàn)IU、慶大霉素4. 5 5. 5g、兩性霉素B 20 30mg，余量為HANK溶液。作為優(yōu)選的技術(shù)方案，一種用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑，每IOOmL抗凍劑中包括下列組分酪蛋白2. 0g、葡萄糖 2. 5g、乳糖1. 5g、HEPES BUFFER 5. 0g、甘油 2. 5mL、卵黃 3mL、青霉素50萬(wàn)IU、慶大霉素5g、兩性霉素B 25mg，余量為HANK溶液。本發(fā)明提出又一種制備用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑的方法，其包括步驟I)按照每IOOmL抗凍劑中包含酪蛋白1. O 3. 0g、葡萄糖2. O 3. 0g、乳糖1. O
2.0g,HEPES BUFFER 3. O 6. 0g、甘油 2. O 3. OmL、卵黃 2 4mL、青霉素 45 55 萬(wàn) IU、慶大霉素4. 5 5. 5g、兩性霉素B 20 30mg，余量為HANK溶液稱取各組分，備用；2)將上述稱取的酪蛋白、葡萄糖、乳糖、HEPES BUFFER用HANK溶液配置成基礎(chǔ)液；3)向上述配置成的基礎(chǔ)液中添加步驟I)中稱取的青霉素、慶大霉素、兩性霉素B配置成I液；4)將所述I液整pH為7.1 7. 8，然后進(jìn)行過(guò)濾滅菌，放入3 5°C冰箱中備用5)使用前取所述I液，向其中加入步驟I)中稱取的卵黃，配置成II液，即得所述用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑。作為優(yōu)選的技術(shù)方案,按照每IOOmL抗凍劑中包含酪蛋白2. 0g、葡萄糖2. 5g、乳糖
1.5g、HEPES BUFFER 5. 0g、甘油2. 5mL、卵黃3mL、青霉素50萬(wàn)IU、慶大霉素5g、兩性霉素B25mg，余量為HANK溶液稱取備用。由于采用了上述技術(shù)方案，一種用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑及其制備方法，每IOOmL抗凍劑中包括下列組分酪蛋白1. O 3. 0g、葡萄糖2. O 3. 0g、乳糖1. O
2.0g,HEPES BUFFER 3. O 6. 0g、甘油 2. O 3. OmL、卵黃 2 4mL、青霉素 45 55 萬(wàn) IU、慶大霉素4. 5 5. 5g、兩性霉素B 20 30mg，余量為HANK溶液，解決了現(xiàn)有技術(shù)中母畜繁殖周期長(zhǎng)、人工授精受胎率低，驢的冷凍精液生產(chǎn)操作程度復(fù)雜，難度大的問(wèn)題。具體實(shí)驗(yàn)卵黃的取用雞蛋應(yīng)來(lái)源于無(wú)疫病的雞場(chǎng)，且所使用雞蛋須新鮮、完整、干凈，取用卵黃前先用75%酒精棉球?qū)Φ皻け砻孢M(jìn)行消毒，待酒精揮發(fā)盡后用蛋清分離器取出完整的卵黃；也可在雞蛋腰中線處敲開(kāi)一裂紋，將雞蛋一分兩半，利用二個(gè)蛋殼交替傾倒的方法，除去蛋清，留下卵黃；然后用滅菌的注射器穿過(guò)卵黃膜抽取卵黃。驢冷凍精液抗凍劑的制備方法
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用電子分析天平稱取酪蛋白1. O — 3. 0g、葡萄糖2. O — 3. 0g、乳糖1. O — 2. 0g、HEPES BUFFER 3. O - 6. 0g、甘油 2. O - 3. OmL、卵黃 2 — 4mL，將其溶解于 50mL HANK 溶液中，用磁力攪拌器攪拌均勻后，加HANK溶液到IOOmL成基礎(chǔ)液。在基礎(chǔ)液中添加青霉素50萬(wàn)IU、慶大霉素5g、兩性霉素B 25mg,配置成I液；用精密pH計(jì)調(diào)整pH為7.1 — 7. 8，然后用0. 22 μ m的濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌，放入4°C冰箱中備用。在進(jìn)行驢精液冷凍前，取360mL I液加入7. 2 — 14. 4ml卵黃，用封口膜封好口后，上下顛倒混勻，于4°C冰箱中過(guò)夜，分層。第二天，吸去表層泡沫，將稀釋液中層倒入燒杯中，棄去下層沉淀。稀釋液經(jīng)4000rpm/min離心3次,每次30min,去除離心后的稀釋液表層雜質(zhì)及底層沉淀，取中層倒入鹽水瓶或藍(lán)口瓶中，加入6 — 9mL甘油，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，配置成II液，置于4°C冰箱中待用。I液配好后，可在4°C冰箱中存放約10天。II液現(xiàn)用現(xiàn)配，在4°C冰箱中存放時(shí)間不宜超過(guò)24h。實(shí)驗(yàn)例以德州驢精液冷凍保存進(jìn)行說(shuō)明。抗凍劑的配制用電子分析天平稱取酪蛋白3. 0g、葡萄糖2. 0g、乳糖1. 5g、HEPESBUFFER 3. 0g、甘油2. OmL、卵黃2mL，將其溶解于50mL HANK溶液中，用磁力攪拌器攪拌均勻后，加HANK溶液到IOOmL成基礎(chǔ)液。在基礎(chǔ)液中添加青霉素50萬(wàn)IU、慶大霉素5g、兩性霉素B 25mg，配置成I液；用精密PH計(jì)調(diào)整pH為7. 5，然后用0. 22 μ m的濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌，放入4°C冰箱中備用。在進(jìn)行驢精液冷凍前，取360mL I液加入8ml卵黃，用封口膜封好口后，上下顛倒混勻，于4°C冰箱中過(guò)夜，分層。第二天，吸去表層泡沫，將稀釋液中層倒入燒杯中，棄去下層沉淀。稀釋液經(jīng)4000rpm/min離心3次,每次30min,去除離心后的稀釋液表層雜質(zhì)及底層沉淀，取中層倒入鹽水瓶或藍(lán)口瓶中，加入6mL甘油，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆蚝螅渲贸蒊I液，置于4°C冰箱中待用。精液的采集利用假陰道法采集公驢精液，取出所采精液中的膠凍樣副性腺物，用8層無(wú)菌紗布過(guò)濾后，立即在配有38°C恒溫裝置的相差顯微鏡上鏡檢，評(píng)定精子活力，并用精子密度儀測(cè)量精子密度。所采集的精液為乳白色或灰白色，無(wú)異味，精子形態(tài)正常，密度> I億/ml，活力> 0. 7，方可用于制作細(xì)管冷凍精液。精液冷凍向原精液中，按1:1的比例加入I液，然后在22°C放置10!^11，以600\8/分，離心15min，去掉上清液，將各離心管中的粥狀精液用稀釋液II液進(jìn)行最后稀釋。精液稀釋按兩步法進(jìn)行先加入最終稀釋量的1/4，之后，經(jīng)初步稀釋的精液先在室溫下放置lOmin，然后加入剩余的II液稀釋液。最終稀釋完的精液移入一大的容器內(nèi)，用細(xì)管一體機(jī)進(jìn)行分裝操作，每支細(xì)管精子總量為7500萬(wàn)，體積為0. 5mL。把分裝后的細(xì)管精液放入不透明的開(kāi)蓋的塑料盒內(nèi)，再把塑料盒放入4°C的冷藏柜中平衡3-4h。平衡完畢后，將細(xì)管碼放在冷凍架上，碼放時(shí)應(yīng)注意細(xì)管擺放方向，使棉塞封口段靠近操作者。每架上放上一根類似于細(xì)管的標(biāo)記物，一頭驢用一個(gè)標(biāo)記物，便于識(shí)別。如同一架上有不同驢的細(xì)管精液，要分開(kāi)碼放，兩頭驢之間要隔開(kāi)一些距離，以免混淆。待冷凍儀溫度降到約4°C后，將碼放好的細(xì)管移入冷凍儀中，按照預(yù)先設(shè)定好的冷凍溫度曲線，自動(dòng)完成冷凍過(guò)程。細(xì)管凍精的解凍及 凍后活率檢測(cè)預(yù)先將恒溫水浴鍋中的水溫加熱至38°C，用鑷子將一支超低溫冷凍的細(xì)管從液氮中迅速取出后，投入38°C水浴中搖晃約30s，待完全溶解后立即取出，用紗布擦干水珠，再用細(xì)管剪先剪去超聲波封口端，再剪去棉塞端，將細(xì)管內(nèi)的精液全部置于一小試管內(nèi)，搖勻，取一滴于載玻片上，并蓋上蓋玻片，在配有38°C恒溫裝置的相差顯微鏡上鏡檢，評(píng)定精液常規(guī)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。解凍后精液品質(zhì)鑒定1.頂體完整性檢測(cè)。采用FITC標(biāo)記的花生凝集素染色后，用熒光顯微鏡檢測(cè)冷凍-解凍后的精子頂體的完整性。取30 UL解凍后的細(xì)管精液涂片，之后自然風(fēng)干。自然干燥后的抹片在20-22°C的甲醇中浸泡10分鐘固定。然后在每個(gè)風(fēng)干后的抹片上滴上含有100mg/mL的FITC標(biāo)記的花生凝集素的染液，放置在37°C的暗濕盒中染色30min。之后，用PBS沖洗，風(fēng)干抹片后，滴加抗熒光淬滅劑，蓋上蓋玻片，用無(wú)色指甲油封片后，在熒光顯微鏡下檢查精子頂體的狀況。2. DNA完整性檢測(cè)。利用吖啶橙(AO)染色后，用熒光顯微鏡檢測(cè)冷凍-解凍后的精子DNA的完整性。用TNE緩沖液將解凍后的精液稀釋至適宜濃度，之后，取200 ii L稀釋后的精液立即加入400 ii L去垢劑。30s后，加入1.2mL AO染料染色。染色后，取15yL精液滴加到載玻片上，蓋上蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。根據(jù)精子頭部顏色判定精子DNA是完整或是降解。3.線粒體活性檢測(cè)。利用羅丹明123 (R123)與碘化丙啶(PI)染色后，用熒光顯微鏡檢測(cè)冷凍-解凍后的精子線粒體活性。用PBS將解凍后的精液稀釋至適宜濃度，取ImL稀釋后的精液加入1. 5mL離心管中，向其中加入3 ii L羅丹明123。將離心管放置在37°C的暗濕盒中20min，之后，加入IOii L鵬化丙淀，直于37 C的暗濕盒中鮮育lOmin。之后，精液經(jīng)600Xg離心6min。離心后，去上清，用ImL PBS重懸下層精子團(tuán)塊。取IOyL重懸后的精液滴在載玻片上，再滴加10 UL抗熒光淬滅劑。將玻片置于熒光顯微鏡下觀察。根據(jù)精子顯示顏色，判斷精子線粒體活性。4.質(zhì)膜完整性檢測(cè)。利用低滲膨脹實(shí)驗(yàn)(HOST)檢測(cè)精子質(zhì)膜的完整性。取50 y L解凍后的精液加入ImL的低滲溶液中。混勻后,置于37°C孵育60min,之后,取15 y L精液樣品滴加在載玻片上，加上蓋玻片后，根據(jù)精子尾部是否卷曲，判斷精子質(zhì)膜是否完整。人工授精試驗(yàn)將上述研制的冷凍精液解凍后人工輸入發(fā)情母驢體內(nèi)，配妊率為55. 7%，達(dá)到了鮮精配種效果。評(píng)定結(jié)果應(yīng)用本發(fā)明的抗凍劑以及精液的冷凍-解凍方法，其評(píng)定結(jié)果如下1.冷凍-解凍后精子的活率達(dá)到40%以上；2.精子的頂體完整率達(dá)到84%以上；3.每劑細(xì)管中有效精子數(shù)不少于3000萬(wàn)個(gè)；4.有活性線粒體的精子達(dá)到13%以上；5.精子的質(zhì)膜完整率達(dá)到38%以上。


為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為本發(fā)明的制備方法的工藝流程示意圖。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。如圖1所示，一種用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑，每IOOmL抗凍劑中包括下列組分酪蛋白1. 0 3. 0g、葡萄糖 2. 0 3. 0g、乳糖1. 0 2. 0g、HEPES BUFFER3. 0 6. 0g、甘油2. 0 3. OmL、卵黃2 4mL、青霉素45 55萬(wàn)IU、慶大霉素4. 5 5. 5g、兩性霉素B 20 30mg，余量為HANK溶液。一種用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑，每IOOmL抗凍劑中包括下列組分酪蛋白2. 0g、葡萄糖 2. 5g、乳糖1. 5g、HEPES BUFFER 5. 0g、甘油 2. 5mL、卵黃 3mL、青霉素50萬(wàn)IU、慶大霉素5g、兩性霉素B 25mg，余量為HANK溶液。一種制備用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑的方法，包括步驟I)按照每IOOmL抗凍劑中包含酪蛋白1. 0 3. 0g、葡萄糖2. 0 3. 0g、乳糖1. 0
2.0g,HEPES BUFFER 3. 0 6. 0g、甘油 2. 0 3. OmL、卵黃 2 4mL、青霉素 45 55 萬(wàn) IU、慶大霉素4. 5 5. 5g、兩性霉素B 20 30mg，余量為HANK溶液稱取各組分，備用；2)將上述稱取的酪蛋白、葡萄糖、乳糖、HEPES BUFFER用HANK溶液配置成基礎(chǔ)液；3)向上述配置成的基礎(chǔ)液中添加步驟I)中稱取的青霉素、慶大霉素、兩性霉素B配置成I液；4)將所述I液整pH為7.1 7. 8，然后進(jìn)行過(guò)濾滅菌，放入3 5°C冰箱中備用；5)使用前取所述·I液，向其中加入步驟I)中稱取的卵黃，配置成II液，即得所述用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑。按照每IOOmL抗凍劑中包含酪蛋白2. 0g、葡萄糖2. 5g、乳糖1. 5g、HEPESBUFFER5. 0g、甘油2. 5mL、卵黃3mL、青霉素50萬(wàn)IU、慶大霉素5g、兩性霉素B 25mg,余量為HANK溶液稱取備用。實(shí)施例一按照每IOOmL抗凍劑中包含酪蛋白1. 0g、葡萄糖2. 0g、乳糖1. 0g、HEPESBUFFER
3.0g、甘油2. OmL、卵黃2mL、青霉素45萬(wàn)IU、慶大霉素4. 5g、兩性霉素B 20mg，余量為HANK溶液稱取各組分，備用；2)將上述稱取的酪蛋白、葡萄糖、乳糖、HEPES BUFFER用HANK溶液配置成基礎(chǔ)液；3)向上述配置成的基礎(chǔ)液中添加步驟I)中稱取的青霉素、慶大霉素、兩性霉素B配置成I液；4)將所述I液整pH為7. 1，然后進(jìn)行過(guò)濾滅菌，放入3°C冰箱中備用；5)使用前取所述I液，向其中加入步驟I)中稱取的卵黃，配置成II液，即得所述用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑。實(shí)施例二按照每IOOmL抗凍劑中包含酪蛋白2. 0g、葡萄糖2. 5g、乳糖1. 5g、HEPESBUFFER
5.0g、甘油2. 5mL、卵黃3mL、青霉素50萬(wàn)IU、慶大霉素5g、兩性霉素B 25mg,余量為HANK溶液稱取各組分，備用；2)將上述稱取的酪蛋白、葡萄糖、乳糖、HEPES BUFFER用HANK溶液配置成基礎(chǔ)液；3)向上述配置成的基礎(chǔ)液中添加步驟I)中稱取的青霉素、慶大霉素、兩性霉素B配置成I液；4)將所述I液整pH為7. 5，然后進(jìn)行過(guò)濾滅菌，放入4°C冰箱中備用；5)使用前取所述I液，向其中加入步驟I)中稱取的卵黃，配置成II液，即得所述用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑。實(shí)施例三按照每IOOmL抗凍劑中包含酪蛋白3. 0g、葡萄糖3. 0g、乳糖2. 0g、HEPESBUFFER
6.0g、甘油3. OmL、卵黃4mL、青霉素55萬(wàn)IU、慶大霉素5. 5g、兩性霉素B 30mg,余量為HANK溶液稱取各組分，備用；2)將上述稱取的酪蛋白、葡萄糖、乳糖、HEPES BUFFER用HANK溶液配置成基礎(chǔ)液；
3)向上述配置成的基礎(chǔ)液中添加步驟I)中稱取的青霉素、慶大霉素、兩性霉素B配置成I液；4)將所述I液整pH為7. 8，然后進(jìn)行過(guò)濾滅菌，放入5°C冰箱中備用；5)使用前 取所述I液，向其中加入步驟I)中稱取的卵黃，配置成II液，即得所述用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑，其特征在于，每IOOmL抗凍劑中包括下列組分酪蛋白1. 0 3. 0g、葡萄糖 2. 0 3. 0g、乳糖1. 0 2. 0g,HEPES BUFFER3. 0 6. 0g、甘油2. 0 3. OmL、卵黃2 4mL、青霉素45 55萬(wàn)IU、慶大霉素4. 5 5. 5g、兩性霉素B20 30mg，余量為HANK溶液。
2.如權(quán)利要求1所述的一種用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑，其特征在于，每IOOmL抗凍劑中包括下列組分 酪蛋白2. 0g、葡萄糖2. 5g、乳糖1. 5g、HEPES BUFFER 5. 0g、甘油2. 5mL、卵黃3mL、青霉素50萬(wàn)IU、慶大霉素5g、兩性霉素B 25mg，余量為HANK溶液。
3.一種制備如權(quán)利要求1所述的用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑的方法，其特征在于，包括步驟 1)按照每IOOmL抗凍劑中包含酪蛋白1.0 3. 0g、葡萄糖2. 0 3. 0g、乳糖1. 0 2.0g,HEPES BUFFER 3. 0 6. 0g、甘油 2. 0 3. OmL、卵黃 2 4mL、青霉素 45 55 萬(wàn) IU、慶大霉素4. 5 5. 5g、兩性霉素B 20 30mg，余量為HANK溶液稱取各組分，備用； 2)將上述稱取的酪蛋白、葡萄糖、乳糖、HEPESBUFFER用HANK溶液配置成基礎(chǔ)液； 3)向上述配置成的基礎(chǔ)液中添加步驟I)中稱取的青霉素、慶大霉素、兩性霉素B配置成I液； 4)將所述I液整pH為7.1 7. 8，然后進(jìn)行過(guò)濾滅菌，放入3 5°C冰箱中備用； 5)使用前取所述I液，向其中加入步驟I)中稱取的卵黃，配置成II液，即得所述用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑。
4.如權(quán)利要求3所述的一種制備用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑的方法，其特征在于按照每IOOmL抗凍劑中包含酪蛋白2. 0g、葡萄糖2. 5g、乳糖1. 5g、HEPES BUFFER·5.0g、甘油2. 5mL、卵黃3mL、青霉素50萬(wàn)IU、慶大霉素5g、兩性霉素B 25mg,余量為HANK溶液稱取備用。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種用于驢精液冷凍保存的酪蛋白抗凍劑及其制備方法，每100mL抗凍劑中包括下列組分酪蛋白1.0～3.0g、葡萄糖2.0～3.0g、乳糖1.0～2.0g、HEPES BUFFER 3.0～6.0g、甘油2.0～3.0mL、卵黃2～4mL、青霉素45～55萬(wàn)IU、慶大霉素4.5～5.5g、兩性霉素B 20～30mg，余量為HANK溶液，解決了現(xiàn)有技術(shù)中母畜繁殖周期長(zhǎng)、人工授精受胎率低，驢的冷凍精液生產(chǎn)操作程度復(fù)雜，難度大的問(wèn)題。
文檔編號(hào)A01N1/02GK103039433SQ20121052907
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者張燕, 王長(zhǎng)法, 張瑞濤, 朱濤濤, 王玲玲, 鞠志花, 黃金明, 齊超, 高運(yùn)東, 仲躋峰, 侯明海, 王銀朝, 閆金華 申請(qǐng)人:山東天龍牧業(yè)科技有限公司, 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心