專利名稱：一種脂肪酶的制作方法
一種脂肪酶技術領域
本發(fā)明屬于微生物工程生物技術領域，具體涉及一種脂肪酶及重組表達工程菌株，即篩選的脂肪酶在畢赤酵母中的表達。
背景技術：
脂肪酶即三?；视王；饷?，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。脂肪酶基本組成單位僅為氨基酸，通常只有一條多肽鏈。它的催化活性僅僅決定于它的蛋白質結構。
脂肪酶廣泛的存在于動植物和微生物中。植物中含脂肪酶較多的是油料作物的種子，如蓖麻籽、油菜籽，當油料種子發(fā)芽時，脂肪酶能與其他的酶協(xié)同發(fā)揮作用催化分解油脂類物質生成糖類，提供種子生根發(fā)芽所必需的養(yǎng)料和能量；動物體內含脂肪酶較多的是高等動物的胰臟和脂肪組織，在腸液中含有少量的脂肪酶，用于補充胰脂肪酶對脂肪消化的不足，在肉食動物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在動物體內，各類脂肪酶控制著消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代謝等過程；細菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更為豐富 (Pandey等)。由于微生物種類多、繁殖快、易發(fā)生遺傳變異，具有比動植物更廣的作用P H、 作用溫度范圍以及底物專一性，且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業(yè)化大生產和獲得高純度樣品，因此微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來源，并且在理論研究方面也具有重要的意義。
脂肪酶的性質研究主要包括最適溫度與pH、溫度與pH穩(wěn)定性、底物特異性等幾個方面。迄今，已分離、純化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性質，它們在分子量、最適pH、 最適溫度、pH和熱穩(wěn)定性、等電點和其他生化性質方面存在不同(Veeraragavan等)?？傮w而言，微生物脂肪酶具有比動植物脂肪酶更廣的作用pH、作用溫度范圍，高穩(wěn)定性和活性， 對底物有特異性(Schmid等；Kazlauskas等)。
脂肪酶是重要的工業(yè)酶制劑品種之一，可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應，廣泛應用于油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等工業(yè)。不同來源的脂肪酶具有不同的催化特點和催化活力。其中用于有機相合成的具有轉酯化或酯化功能的脂肪酶的規(guī)模化生產對于酶催化合成精細化學品和手性化合物有重要意義。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種新型脂肪酶及其重組表達工程菌。即利用基因工程手段，篩選出新的脂肪酶基因，并轉化入畢赤酵母中，構建畢赤酵母工程菌。構建的工程菌能高效表達脂肪酶基因，且所產脂肪酶的酶學性質優(yōu)良，可廣泛用作飼料添加劑，提高飼料中油脂的利用率。
本發(fā)明一個方面提供一種新型的脂肪酶，其特征在于
I)其氨基酸序列為SEQ ID NO:1的脂肪酶；
2)其氨基酸序列與SEQ ID NO:1同源性高于80%的脂肪酶；
3)在I)或2)中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個或數(shù)個氨基酸得到的，具有脂肪酶活性的酶。
本發(fā)明另一方面提供了編碼上述脂肪酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO: 2。
本發(fā)明的脂肪酶，去掉信號肽后的氨基酸序列為SEQ ID NO: 3，其核苷酸的序列為 SEQ ID NO: 4。
本發(fā)明提供了一種表達載體，其包含上述編碼基酸序列為SEQ ID NO: 3的脂肪酶的核苷酸。
本發(fā)明另一方面提供了一種表達宿主細胞，其攜帶有表達上述脂肪酶基因的表達載體。
上述表達宿主細胞為畢赤酵母(Pichia pastoris)。
本發(fā)明脂肪酶用于制備飼料添加劑。
本發(fā)明的脂肪酶能顯著提高飼料中油脂類物質的利用率。日糧中降低75 Kcal/ kg油脂添加量后，通過添加脂肪酶，肉仔雞的生產性能優(yōu)于負對照，且與正對照幾乎一致， 所以能顯著降低飼料成本。而構建的畢赤酵母工程菌能夠高效表達本發(fā)明的脂肪酶，酶活水平達到229 u/mL·重組表達的脂肪酶最適作用溫度為40°C,最適pH為4. O。


圖1 :本發(fā)明構建的重組表達載體質粒圖譜。
圖2 :畢赤酵母工程菌發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳分析圖，其中箭頭所指為重組表達的脂肪酶。
圖3 :重組表達的脂肪酶溫度作用曲線圖。
圖4 :重組表達的脂肪酶pH作用曲線圖。
具體實施方式
以下實施例是為了更好地說明闡述本發(fā)明內容，本領域相關的技術人員可以借助實施例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護和權利要求范圍不限于所提供的案例。
實施例1斜臥青霉脂肪酶基因的克隆
1.1總DNA的提取
將斜臥青霉(P. decumberns)過夜培養(yǎng),取適量菌體置于離心管中，13000 rpm 離心 5 min，棄上清；加入 400 μ I 抽提緩沖液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS);然后加IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打儀劇烈振蕩2min左右；65°C水浴 20min后，加入200 μ I IOM NH4AC,冰浴IOmin ;13000rpm離心lOmin，取上清；加入2倍體積的無水乙醇，_20°C放置30min ； 13000 rpm離心lOmin，棄上清；用70%乙醇洗滌2次；晾干,加入水溶解,于-20°C保存。
1. 2總RNA的制備
OMEGA公司的E. Z. N. A. Fungal RNA Kit制備斜臥青霉的mRNA，其制備過程參照試劑盒的操作手冊。
1. 3基因克隆
以1.1中提取的基因組總DNA為模板，分別利用引物對(ATGATGATCAATTGGAAG和 TCAAATATGGAAAGACGC)進行 PCR 擴增。PCR 擴增條件為 94°C 5min ；94°C 30S ；55°C 30S, 72°C 2min 30個循環(huán)；72°C IOmin0利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物。
以1. 2中提取的基因組總RNA為模板，擴增其cDNA序列。采用TaKaRa公司的 PrimeScript RT-PCR Kit 擴增 cDNA 基因序列。
1. 4測序分析
將1. 3中回收的擴增產物分別連接到pMD18 T-載體，相應的克隆載體分別命名為 pT-lipl和pT-lip2，把陽性克隆送至北京華大基因研究中心進行測序分析。測序結果為 Lip I和Lip 2比對分析顯不該基因序列不含有內含子，Lipl和Lip 2的核昔酸序列均為 SEQ ID NO: 2，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
經(jīng)NCBI 的 BLAST 比對發(fā)現(xiàn)，SEQ ID NO:1 與 Aspergillus flavus NRRL3357 菌的胞外脂肪酶氨基酸序列的同源性最高，同源性為73%。該蛋白屬于酯酶-脂肪酶家族，具有脂肪酶保守催化和結構域。
1. 5信號肽預測
利用網(wǎng)站http://smart, embl-heidelberg. de/對 SEQ ID NO:1 的氨基酸序列進行預測分析，結果顯示序列的前18個氨基酸為信號肽，去除信號肽后的氨基酸序列為SEQ ID NO: 3，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 4。
實施例2表達去掉信號肽的脂肪酶基因的工程菌的構建
2.1畢赤酵母工程菌的構建
以質粒pT- Lip 2 為模板，利用引物(GGGGTACCATGATGATCAATTGGAAG 和 GCTCTAGATCAAATATGGAAAGACGC)進行 PCR 擴增，PCR 擴增條件是 94°C 5min ；94°C 30S ；55°C 30S，72°C 2min 30個循環(huán)；72°C IOmin0擴增產物凝膠回收后，先進行XbaI和Kpn I雙酶切。同樣，對表達質粒PPIC9K也進行XbaI和Kpn I雙酶切。用T4連接酶把雙酶切產物即克隆基因和表達載體4°C連接過夜。最后，把連接產物導入大腸桿菌DH5a。相應的陽性克隆表達質粒命名為pPIC-Lip,該質粒圖譜如圖1所示。
表達質粒pPIC-Lip用Sac I酶切電泳鑒定后，經(jīng)乙醇沉淀濃縮，測定DNA濃度， 以3yg/μ L濃度稀釋質粒片段保存?zhèn)溆?。制備畢赤酵母GSl 15電轉化感受態(tài)細胞，最后重懸于I mL預冷的電泳緩沖液中(含ImM MgCl2, IOmM HEPES, 250mM蔗糖，pH 7.8)。在 80μ L感受態(tài)細胞中加入5μ L線性化重組質粒；電轉化(條件為1500V、200Q、25yF);最后涂布于麗平板(麗培養(yǎng)基組分1. 34%ΥΝΒ，4Χ 1(Γ5%生物素，O. 5%甲醇)，挑選重組菌株。 將其中一株重組菌株命名為Pichia pastoris Pi_Lip，測序結果表明插入的片段為SEQ ID NO: 4，表明擴增中沒有出現(xiàn)錯誤。
實施例3發(fā)酵和酶學性質測定
3.1畢赤酵母工程菌搖瓶發(fā)酵
將上述畢赤酵母工程菌(Pichia pastoris P1-Lip)接種于5ml BMGY ( 1%酵母提取物，2%蛋白陳，1. 34 % YNB, 4X10_5%生物素，1%甘油)，30°C培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，把菌體加入50ml BMMY誘導培養(yǎng)基(I %酵母提取物，2%蛋白陳，I· 34 % YNB, 4X10_5% 生物素，O. 5%甲醇)，每12小時補加50 μ L甲醇，誘導培養(yǎng)5天，取上清液，測定其酶活水平達到 229u/ml。
脂肪酶活力
Ig固體酶粉(或Iml液體酶),在一定溫度和pH條件下，Imin水解底物產生I μ mo I 的可滴定的脂肪酸，即為一個酶活力單位，以u/g(u/ml)表示。
酶活測定方法
取兩個IOOml三角瓶，分別于空白瓶(A)和樣品瓶⑶中各加入底物溶液4. OOml 和磷酸緩沖液5. 00ml，再于A瓶中假如95%乙醇15. 00ml，于40°C ±0. 2°C水浴中預熱5min， 然后于A、B瓶中各加待測酶液1. 00ml，立即混勻計時，準確反應15min后，于B瓶中立即補加95%乙醇15. OOml終止反應，取出；于空白和樣品溶液中各加酚酞指示液兩滴，用氫氧化鈉標準溶液滴定，直至微紅色并保存30s，不褪色為滴定終點，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液的體積。
脂肪酶的酶活力按下列公式計算
權利要求
1.一種脂肪酶，其特征在于 1)其氨基酸序列為SEQID NO:1的脂肪酶； 2)其氨基酸序列與SEQID NO:1同源性高于80%的脂肪酶； 3)在I)或2)中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個或數(shù)個氨基酸得到的，具有脂肪酶活性的酶。
2.編碼權利要求1所述的脂肪酶的基因，其核苷酸序列為SEQID NO: 2。
3.一種脂肪酶，其特征在于所述的脂肪酶是將權利要求1所述的脂肪酶去掉信號肽后形成的，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 3。
4.編碼權利要求3所述的脂肪酶的基因，其核苷酸序列為SEQID NO: 4。
5.一種表達載體，所述的表達載體用于表達權利要求3所述的脂肪酶。
6.如權利要求5所述的表達載體，其攜帶有權利要求4所述的基因。
7.—種表達宿主細胞，其攜帶有權利要求5所述的表達載體。
8.如權利要求7所述的宿主細胞,所述的細胞為畢赤酵母(Pichiapastoris)。
9.權利要求1或3所述的脂肪酶在制備飼料添加劑中的應用。
10.一種飼料添加劑，所述的飼料添加劑為權利要求3所述的脂肪酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型的脂肪酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO: 1。本發(fā)明的脂肪酶，去掉信號肽后的氨基酸序列為SEQ ID NO: 3。本發(fā)明還提供了一種畢赤酵母細胞，其攜帶有表達上述脂肪酶基因的表達載體。本發(fā)明的脂肪酶能顯著提高飼料中油脂類物質的利用率。日糧中降低75Kcal/kg油脂添加量后，通過添加脂肪酶，肉仔雞的生產性能優(yōu)于負對照，且與正對照幾乎一致，所以能顯著降低飼料成本。而構建的畢赤酵母工程菌能夠高效表達本發(fā)明的脂肪酶，酶活水平達到229u/ml。重組表達的脂肪酶最適作用溫度為40℃，最適pH為4.0。
文檔編號A23K1/165GK103013950SQ20121049982
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月30日 優(yōu)先權日2012年11月30日
發(fā)明者黃亦鈞, 趙倩, 許韡, 劉艷萍, 王華明, 張慧丹, 曲音波, 劉國棟, 陳梅 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司