專利名稱：一種利用沼渣、沼液固體發(fā)酵生產放線菌肥料的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生產放線菌肥料的方法。
背景技術：
放線菌是一類與人類關系極為密切而又具有巨大應用價值的資源微生物，不僅在物質循環(huán)中起重要作用，而且以豐富的次生代謝產物產生能力而著稱，放線菌可代謝產生抗生索、氨基酸、酶制劑、維生素和除草劑等多種重要的生物活性物質。1929年青霉素的發(fā)現(xiàn)標志著抗生素時代的到來，隨后Waksman發(fā)現(xiàn)的鏈霉素解決了當時結核病這個社會問題而引起廣泛關注，并激發(fā)了人類對新抗篩選的興趣。截止2000年發(fā)現(xiàn)的微生物來源的新生理活性物質已達16000種，其中有70%以上是由放線菌產生的。放線菌來源的抗生素在臨床疾病治療中發(fā)揮著重要作用，臨床上使用的抗生素有2/3來源于放線菌；放線菌產生的 抗生素也是農用抗生素的最主要來源，如阿維鏈霉菌產生的阿維菌素是重要的殺蟲和殺蝸齊U、井岡霉素可用于防治水稻紋枯病等。放線菌中的弗蘭克氏菌可與非豆科植物共生，且同一種弗蘭克氏菌可以侵染不同種屬的宿主植物，為自然界的氮素循環(huán)和農林業(yè)的氮素供應做出了巨大貢獻，并有良好的應用前景。自1947年到1997年的50年間在JA上發(fā)表的共約4300種新微生物代謝產物產生菌及活性分布情況。因此，放線菌作為一類重要的微生物資源，研究受到了世界各國學者的極大重視。目前已在放線菌研究方面做了大量工作，其中最有成效的當屬放線菌來源的生物活性物質的研究、放線菌分類學研究和放線菌遺傳學研究等。放線菌分類學研究不僅可以為放鹽堿環(huán)境中放線菌多相分類及免培養(yǎng)研究線菌資源的開發(fā)利用和有效控制有害放線菌提供理論指導，而且可以為研究放線菌的系統(tǒng)演化關系提供材料和依據(jù)，豐富生物多樣性研究的內容。因而，放線菌分類研究具有理論和實際雙重意義。目前對于放線菌的培養(yǎng)普遍使用人工合成培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中富含大量營養(yǎng)物質，但原料成本相對較高，應用于農業(yè)肥料用放線菌生產過程中提高了生產成本消耗。

發(fā)明內容
本發(fā)明是要解決現(xiàn)有肥料用放線菌培養(yǎng)方法原料成本高的問題，提供了一種利用沼渣、沼液固體發(fā)酵生產放線菌肥料的方法本發(fā)明一種利用沼渣、沼液固體發(fā)酵生產放線菌肥料的方法，是按以下步驟進行的一、試管培養(yǎng)種子培養(yǎng)a、配制試管培養(yǎng)基按質量份數(shù)稱取淀粉2 2. 5份、硝酸鉀O. I O. 2份、磷酸二氫鉀O. 03 O. 05份、硫酸鎂O. 001 O. 002份、瓊脂2 2. 2份與95 96份水混合均勻，然后進行高溫滅菌，即得到試管培養(yǎng)基；b、將放線菌接種于試管培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為28 32°C的條件下，斜面靜置培養(yǎng)48 96h，然后用ImL無菌水洗脫試管斜面培養(yǎng)物后，得到洗脫液；二、固體孢子種子培養(yǎng)c、配制種子培養(yǎng)基將小米與水按質量比為I : (I 2)的比例混合，浸泡20 24h，然后進行高溫滅菌，即得到種子培養(yǎng)基；d、將步驟一中的洗脫液接種于種子培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為28 32°C的條件下，搖瓶培養(yǎng)72 120h，得到放線菌孢子菌液；三、發(fā)酵培養(yǎng)e、發(fā)酵原料的制備按質量份數(shù)稱取沼渣70 90份、麥麩皮10 30份和CaCO3O. 5 2份混合均勻，即得到發(fā)酵原料，用沼液調節(jié)發(fā)酵原料的含水量為40 45%，然后進行高溫滅菌；f、將步驟二中的放線菌孢子菌液按接種量為O. 5 5%接種于滅菌后的發(fā)酵原料中，然后在發(fā)酵溫度為28 32°C、發(fā)酵原料厚度為10 20cm的條件下進行發(fā)酵70 96h，即得到放線菌肥料。本發(fā)明利用沼氣發(fā)酵廢棄物一沼渣、沼液代替原有人工合成培養(yǎng)基作為發(fā)酵底物，降低了培養(yǎng)放線菌的成本，在培養(yǎng)過程中，通過對放線菌培養(yǎng)，使COD含量極高的沼液得以應用，避免了直接排放對環(huán)境造成的污染。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式的一種利用沼渣、沼液固體發(fā)酵生產放線菌肥料的方法，是按以下步驟進行的一、試管培養(yǎng)種子培養(yǎng)a、配制試管培養(yǎng)基按質量份數(shù)稱取淀粉2 2. 5份、硝酸鉀O. I O. 2份、磷酸二氫鉀O. 03 O. 05份、硫酸鎂O. 001 O. 002
份、瓊脂2 2. 2份與95 96份水混合均勻，然后進行高溫滅菌，即得到試管培養(yǎng)基；b、將放線菌接種于試管培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為28 32°C的條件下,斜面靜置培養(yǎng)48 96h,然后用ImL無菌水洗脫試管斜面培養(yǎng)物后，得到洗脫液；二、固體孢子種子培養(yǎng)c、配制種子培養(yǎng)基將小米與水按質量比為I : (I 2)的比例混合，浸泡20 24h，然后進行高溫滅菌，即得到種子培養(yǎng)基；d、將步驟一中的洗脫液接種于種子培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為28 32°C的條件下，搖瓶培養(yǎng)72 120h，得到放線菌孢子菌液；三、發(fā)酵培養(yǎng)e、發(fā)酵原料的制備按質量份數(shù)稱取沼渣70 90份、麥麩皮10 30份和CaCO3O. 5 2份混合均勻，即得到發(fā)酵原料，用沼液調節(jié)發(fā)酵原料的含水量為40 45%，然后進行高溫滅菌；f、將步驟二中的放線菌孢子菌液按接種量為O. 5 5%接種于滅菌后的發(fā)酵原料中，然后在發(fā)酵溫度為28 32°C、發(fā)酵原料厚度為10 20cm的條件下進行發(fā)酵70 96h，即得到放線菌肥料。本實施方式中的接種量是指移入種子液的體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。本實施方式利用沼氣發(fā)酵廢棄物——沼渣、沼液代替原有人工合成培養(yǎng)基作為發(fā)酵底物，降低了培養(yǎng)放線菌的成本,在培養(yǎng)過程中，通過對放線菌培養(yǎng),使COD含量極高的沼液得以應用，避免了直接排放對環(huán)境造成的污染。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中所述的按質量份數(shù)稱取淀粉2. 2份、硝酸鉀O. 15份、磷酸二氫鉀O. 04份、硫酸鎂O. 0015份、瓊脂2. I份與95. 5份水混合均勻。其他步驟和參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是步驟一中所述的高溫滅菌為在溫度為120°C的條件下滅菌30min。其他步驟和參數(shù)與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同的是步驟二中所述的將小米與水按質量比為I : I. 5的比例混合，浸泡24h。其他步驟和參數(shù)與
具體實施例方式
一至三之一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一至四之一不同的是步驟二中所述的高溫滅菌為在溫度為120°C的條件下滅菌20min。其他步驟和參數(shù)與具體實施方式
一至四之一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至五之一不同的是步驟三中所述的沼渣和沼液的制備方法為高溫沼氣發(fā)酵法，具體方法為按質量份數(shù)稱取新鮮牛糞40份、水60份混合均勻，厭氧54°C培養(yǎng)14天，培養(yǎng)剩余物即為沼渣和沼液。其他步驟和參數(shù)與具體實施方式
一至五之一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一至六之一不同的是步驟三中所述的高溫滅菌為在溫度為120°C的條件下滅菌40min。其他步驟和參數(shù)與具體實施方式
一至六之一相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一至七之一不同的是步驟三中所述的按質量份數(shù)稱取沼渣80份、麥麩皮20份和CaCO3L 5份混合均勻，即得到發(fā)酵原料。其他步驟和參數(shù)與具體實施方式
一至七之一相同。
具體實施方式
九本實施方式與具體實施方式
一至八之一不同的是步驟三中所述的發(fā)酵溫度為30°C。其他步驟和參數(shù)與具體實施方式
一至八之一相同。
具體實施方式
十本實施方式與具體實施方式
一至九之一不同的是步驟三中所述的發(fā)酵原料厚度為15cm。其他步驟和參數(shù)與具體實施方式
一至九之一相同。通過以下試驗驗證本發(fā)明的有益效果試驗I :本試驗一種利用沼渣、沼液固體發(fā)酵生產放線菌肥料的方法，是按以下步驟進行的一、試管培養(yǎng)種子培養(yǎng)a、配制試管培養(yǎng)基按質量份數(shù)稱取淀粉2. 2份、硝酸鉀
O.15份、磷酸二氫鉀O. 04份、硫酸鎂O. 0015份、瓊脂2. I份與95. 5份水混合均勻，然后在溫度為120°C的條件下滅菌30min，即得到試管培養(yǎng)基；b、將放線菌接種于試管培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為30°C的條件下，斜面靜置培養(yǎng)72h，然后用ImL無菌水洗脫試管斜面培養(yǎng)物后，得到洗脫液；二、固體孢子種子培養(yǎng)a、配制種子培養(yǎng)基將小米與水按質量比為I : 1.5的比例混合，浸泡22h，然后在溫度為120°C的條件下滅菌20min，即得到種子培養(yǎng)基；b、將步驟一中的洗脫液接種于種子培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為30°C的條件下，搖瓶培養(yǎng)96h，得到放線菌孢子菌液；三、發(fā)酵培養(yǎng)a、發(fā)酵原料的制備按質量份數(shù)稱取沼渣80份、麥麩皮20份和CaCO3L 5份混合均勻，即得到發(fā)酵原料，用沼液調節(jié)發(fā)酵原料的含水量為43%，然后在溫度為120°C的條件下滅菌40min ;b、將步驟二中的放線菌孢子菌液按接種量為3%接種于滅菌后的發(fā)酵原料，然后在發(fā)酵溫度為30°C、發(fā)酵原料厚度為15cm的條件下進行發(fā)酵90h，即得到放線菌肥料。其中步驟三中所述的沼渣和沼液的制備方法為高溫沼氣發(fā)酵法按質量份數(shù)稱取新鮮牛糞40份、水60份混合均勻，厭氧54°C培養(yǎng)14天，培養(yǎng)剩余物即為沼渣、沼液。本試驗中的放線菌為細黃鏈霉菌GIM5406Streptomycesjingyangesis,買自上海北諾生物科技有限公司。本試驗利用沼氣發(fā)酵廢棄物一沼渣、沼液代替原有人工合成培養(yǎng)基作為發(fā)酵底物，降低了培養(yǎng)放線菌的成本，在培養(yǎng)過程中，通過對放線菌培養(yǎng)，使COD含量極高的沼液得以應用，避免了直接排放對環(huán)境造成的污染。應用梯度稀釋平板菌落計數(shù)法計算出每克放線菌肥料中含活孢子500億以上。
權利要求
1.一種利用沼渣、沼液固體發(fā)酵生產放線菌肥料的方法，其特征在于利用沼渣、沼液固體發(fā)酵生產放線菌肥料的方法是按以下步驟進行的一、試管培養(yǎng)種子培養(yǎng)a、配制試管培養(yǎng)基按質量份數(shù)稱取淀粉2 2. 5份、硝酸鉀O. I O. 2份、磷酸二氫鉀O. 03 O. 05份、硫酸鎂O. 001 O. 002份、瓊脂2 2. 2份與95 96份水混合均勻，然后進行高溫滅菌，即得到試管培養(yǎng)基；b、將放線菌接種于試管培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為28 32°C的條件下，斜面靜置培養(yǎng)48 96h，然后用ImL無菌水洗脫試管斜面培養(yǎng)物后，得到洗脫液；二、固體孢子種子培養(yǎng)C、配制種子培養(yǎng)基將小米與水按質量比為I : (I 2)的比例混合，浸泡20 24h，然后進行高溫滅菌，即得到種子培養(yǎng)基；d、將步驟一中的洗脫液接種于種子培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為28 32°C的條件下，搖瓶培養(yǎng)72 120h，得到放線菌孢子菌液；三、發(fā)酵培養(yǎng)e、發(fā)酵原料的制備按質量份數(shù)稱取沼渣70 90份、麥麩皮10 30份和CaCO3O. 5 2份混合均勻，即得到發(fā)酵原料，用沼液調節(jié)發(fā)酵原料的含水量為40 45%，然后進行高溫滅菌；f、將步驟二中的放線菌孢子菌液按接種量為O. 5 5%接種于滅菌后的發(fā)酵原料中，然后在發(fā)酵溫度為28 32°C、發(fā)酵原料厚度為10 20cm的條件下進行發(fā)酵70 96h，即得到放線菌肥料。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種利用沼渣、沼液固體發(fā)酵生產放線菌肥料的方法，其特征在于步驟一中所述的按質量份數(shù)稱取淀粉2. 2份、硝酸鉀O. 15份、磷酸二氫鉀O. 04份、硫酸鎂O. 0015份、瓊脂2. I份與95. 5份水混合均勻。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種利用沼渣、沼液固體發(fā)酵生產放線菌肥料的方法，其特征在于步驟一中所述的高溫滅菌為在溫度為120°C的條件下滅菌30min。
4.根據(jù)權利要求I所述的一種利用沼渣、沼液固體發(fā)酵生產放線菌肥料的方法，其特征在于步驟二中所述的將小米與水按質量比為I : I. 5的比例混合，浸泡24h。
5.根據(jù)權利要求I所述的一種利用沼渣、沼液固體發(fā)酵生產放線菌肥料的方法，其特征在于步驟二中所述的高溫滅菌為在溫度為120°C的條件下滅菌20min。
6.根據(jù)權利要求I所述的一種利用沼渣、沼液固體發(fā)酵生產放線菌肥料的方法，其特征在于步驟三中所述的沼渣和沼液的制備方法為高溫沼氣發(fā)酵法，具體方法為按質量份數(shù)稱取新鮮牛糞40份、水60份混合均勻，厭氧54°C培養(yǎng)14天，培養(yǎng)剩余物即為沼渣、沼液。
7.根據(jù)權利要求I所述的一種利用沼渣、沼液固體發(fā)酵生產放線菌肥料的方法，其特征在于步驟三中所述的高溫滅菌為在溫度為120°C的條件下滅菌40min。
8.根據(jù)權利要求I所述的一種利用沼渣、沼液固體發(fā)酵生產放線菌肥料的方法，其特征在于步驟三中所述的按質量份數(shù)稱取沼渣80份、麥麩皮20份和CaCO3L 5份混合均勻，即得到發(fā)酵原料。
9.根據(jù)權利要求I所述的一種利用沼渣、沼液固體發(fā)酵生產放線菌肥料的方法，其特征在于步驟三中所述的發(fā)酵溫度為30°C。
10.根據(jù)權利要求I所述的一種利用沼渣、沼液固體發(fā)酵生產放線菌肥料的方法，其特征在于步驟三中所述的發(fā)酵原料厚度為15cm。
全文摘要
一種利用沼渣、沼液固體發(fā)酵生產放線菌肥料的方法，它涉及一種生產放線菌肥料的方法。本發(fā)明是要解決現(xiàn)有肥料用放線菌培養(yǎng)方法原料成本高的問題。本發(fā)明的方法為一、試管培養(yǎng)種子培養(yǎng)a、配制試管培養(yǎng)基；b、將放線菌接種于試管培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；二、固體孢子種子培養(yǎng)a、配制種子培養(yǎng)基；b、將培養(yǎng)的放線菌接種于種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；三、發(fā)酵培養(yǎng)a、制備發(fā)酵原料；b、向滅菌后的發(fā)酵原料接種放線菌的孢子，然后進行發(fā)酵，即得到放線菌肥料。本發(fā)明中利用沼氣發(fā)酵廢棄物——沼渣、沼液代替原有人工合成培養(yǎng)基作為發(fā)酵底物，降低了培養(yǎng)放線菌的成本。本發(fā)明應用于微生物領域。
文檔編號C05F11/08GK102942391SQ201210467929
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權日2012年11月19日
發(fā)明者谷軍, 張介馳, 原韜, 張曉彥, 于德水 申請人:黑龍江省科學院微生物研究所