專利名稱：用于確定glp-1類似物對2型糖尿病血糖調(diào)控機制的設(shè)備及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)控機制研究領(lǐng)域，尤其涉及一種用于確定GLP-I類似物對2型糖尿病血糖調(diào)控機制的設(shè)備以及將該設(shè)備在血糖調(diào)控機制中的研究。
背景技術(shù)：
21世紀以來2型糖尿病開始在全球范圍流行，已然成為全球第四位疾病相關(guān)死亡原因，給世界各國帶來巨大的經(jīng)濟負擔。2型糖尿病是一種遺傳和環(huán)境因素共同作用而形成的多基因遺傳性復雜疾病，以持續(xù)高血糖為顯著特征。長期持續(xù)的血糖升高會導致視網(wǎng)膜、腎臟和神經(jīng)病變等糖尿病微血管并發(fā)癥以及大血管并發(fā)癥,上述并發(fā)癥的發(fā)生風險與高血糖的暴露時間顯著相關(guān)。2型糖尿病個體高血糖成因有多種機制，其中肝臟、肌肉以及脂肪細胞的胰島素抵抗(Insulin Resistance, IR)是極為重要的原因,其原因如下(I)肝臟抵抗，主要表現(xiàn)為肝糖產(chǎn)生及輸出(Hepatic Glucose Production, HGP)增加，引起空腹高血糖，同時HGP的增加也是餐后血糖升高的重要原因之一。(2)肌肉抵抗，胰島素介導的葡萄糖攝取、氧化代謝能力障礙，肌糖原生成及貯存減少。(3)脂肪抵抗，胰島素抑制脂肪分解作用減弱，血游離脂肪酸(FFA)增高。而血漿高FFA水平又可同時促進肝糖產(chǎn)生過多，加重肝胰島素抵抗。同時抑制肌細胞胰島素介導的葡萄糖轉(zhuǎn)運及肌糖原的合成，加重已有的肌肉抵抗。研究表明，IR作為2型糖尿病的主要特征之一，在機體出現(xiàn)臨床高血糖前就已經(jīng)存在。當機體出現(xiàn)IR時，由于胰島素的生物效應減低，機體不僅出現(xiàn)高血糖，也常伴有血脂紊亂。近年來，對于2型糖尿病的研究不斷深入，不斷有GLP-I的類似物、衍生物和近似物等被合成或發(fā)現(xiàn)，例如中國CN1740198A、CN1951965A、CN1918177A中都披露了與GLP-1具有相當高相識度的物質(zhì)。在對這些物質(zhì)在正式應用在醫(yī)療中，都需要對其進行全方面的了解和研究。在確定調(diào)制機制過程中，通常會根據(jù)GLP-I衍生物、近似物與GLP-I的相識度而選用測試方式和測試試劑，由于測試試劑品種多種多樣，如果選用測試方法和測試試劑不對則該測試得出的結(jié)果是失敗，但實際測試過程中多數(shù)結(jié)果是無效的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在不足之處，提供適用于在不同動物體上測試GLP-I類似物在確定血糖調(diào)控機制的設(shè)備，使用該設(shè)備能方便，可以便捷、快速確定出2型糖尿病血糖調(diào)控機制。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于確定GLP-I類似物對2型糖尿病血糖調(diào)控機制的設(shè)備，所述設(shè)備包括動物代謝籠、尾部固定夾子；所述動物代謝籠內(nèi)設(shè)有網(wǎng)格板，所述網(wǎng)格板將動物代謝籠分為上下兩部分，動物代謝籠還設(shè)有進出代謝籠的門，動物代謝籠的側(cè)壁上設(shè)有進水孔和尾巴伸出孔。
在本發(fā)明提供的一優(yōu)選實施例中，其中所述進水孔和尾巴伸出孔分別設(shè)置在動物代謝籠的相對兩個側(cè)壁上。
在本發(fā)明提供的一優(yōu)選實施例中，其中所述設(shè)備還包括尾部放置臺，所述尾部放置臺的上表面與尾巴伸出孔下表面平齊。
在本發(fā)明提供的一優(yōu)選實施例中，其中所述動物代謝籠內(nèi)網(wǎng)格板下方還設(shè)有臺板。
在本發(fā)明提供的一優(yōu)選實施例中，其中在動物代謝籠側(cè)面設(shè)有卡口，所述網(wǎng)格板和臺板通過該卡口插入并固定在動物代謝籠中。
在本發(fā)明提供的一優(yōu)選實施例中，其中所述裝置還包括動物保定器，所述動物保定器具有一端開口的筒狀形狀。
在本發(fā)明提供的一優(yōu)選實施例中，其中所述動物保定器一端開口具有圓形或橢圓形的開口截面，所述開口截面中部向上凸出或向下凹進。
在本發(fā)明提供的一優(yōu)選實施例中，其中所述尾部固定夾子包括相對的兩個夾片， 所述夾片中間部具有圓弧形凹部，夾片兩端設(shè)有連接固件。
在本發(fā)明提供的一優(yōu)選實施例中，其中所述圓弧形凹部內(nèi)側(cè)面鋪設(shè)有彈性墊子。
在本發(fā)明提供的一優(yōu)選實施例中，其中所述設(shè)備還包括用于插入動物尾部的尾靜脈的靜脈留置針。
本發(fā)明提供的設(shè)備適用于在不同動物體上測試GLP-I類似物在確定血糖調(diào)控機制，該設(shè)備使用方便，可以便捷、快速確定出2型糖尿病血糖調(diào)控機制。


圖I是本發(fā)明提供設(shè)備中動物代謝籠的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是本發(fā)明提供設(shè)備中尾部固定夾子的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3是本發(fā)明提供設(shè)備中動物保定器的側(cè)視圖。
圖4是大鼠灌流流程不意圖。
圖5是Exenatide/對照液干預8周后，各組大鼠空腹膜島素、HOMA-IR和膜島素敏感指數(shù)比較圖。
圖6是Exenatide治療7周后,大鼠腹腔葡萄糖耐量對照試驗曲線圖。
圖7是Exenatide治療7周后,大鼠腹腔胰島素耐量對照試驗曲線圖。
圖8是葡萄糖總離子流色譜圖。
圖9是甲氧胺+硅烷化處理過的葡萄糖的質(zhì)譜圖。
圖10是葡萄糖標準曲線。
圖11是甘油總離子流色譜圖。
圖12是硅烷化處理過的甘油的質(zhì)譜圖。
圖13是甘油標準曲線。
圖14是甘油更新及糖異生相關(guān)參數(shù)。
圖15是高胰島素正糖鉗夾穩(wěn)態(tài)葡萄糖代謝相關(guān)參數(shù)。
具體實施方式
本發(fā)明提供適合在不同動物體上測試GLP-I類似物在確定血糖調(diào)控機制的設(shè)備， 可以便捷、快速確定出2型糖尿病血糖調(diào)控機制。
以下大鼠為實驗對象，通過實施例對本發(fā)明提供的設(shè)備作進一步詳細的說明，以便更好理解本發(fā)明創(chuàng)造的內(nèi)容，但實施例的內(nèi)容并不限制本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍。
實驗設(shè)備用于確定GLP-I類似物對2型糖尿病血糖調(diào)控機制的設(shè)備包括動物代謝籠I、動物保定器3、尾部固定夾子2。如圖I所示的動物代謝籠，動物代謝籠I中內(nèi)從上往下分別設(shè)有網(wǎng)格板11和臺板12，網(wǎng)格板11和臺板12通過設(shè)置在動物代謝籠側(cè)面的卡口，插入并固定在動物代謝籠中。在動物代謝籠上設(shè)有進去代謝籠的活動門15，動物代謝籠的側(cè)壁上設(shè)有進水孔13和尾巴伸出孔14，所述進水孔和尾巴伸出孔分別設(shè)置在動物代謝籠的相對兩個側(cè)壁上。在進行動物的示蹤灌流時，實驗動物置于動物代謝籠I中，動物的尾部從尾巴伸出孔 14內(nèi)伸出。伸出的尾部放置在尾部放置臺18上，尾部放置臺18的上表面與尾巴伸出孔14 下表面平齊。
如圖2所示的尾部固定夾子2，該固定夾子2用于固定插入靜脈留置針處的動物尾部。尾部固定夾子2由相對稱形狀的夾片21組成，在夾片21中間部具有圓弧形凹部，夾片 21兩端設(shè)有連接固件23。圓弧形凹部內(nèi)側(cè)面鋪設(shè)有彈性墊子22，彈性墊子22用于保護動物的尾部不會被固定夾子夾傷。如圖3所示的動物保定器3，該動物保定器3具有圓柱形的容器側(cè)壁，頂部具有橢圓形的開口截面31，底部設(shè)有動物透氣通孔32。動物保定器3 —端開口具有圓形或橢圓形的開口截面，所述開口截面中部向上凸出或向下凹進。
將實驗用的動物置于保定器內(nèi)，防止實驗過程中動物亂動。在進一步的實施例中， 在整個設(shè)備中還包括用于插入動物尾部的尾靜脈的靜脈留置針，靜脈留置針插入動物的尾部尾靜脈中用于示蹤灌流。
實驗溶液配置配置下列用于確定GLP-I類似物對2型糖尿病血糖調(diào)控機制的試劑，包括鏈脲佐菌素注射液、磷酸鹽緩沖溶液、閃爍液和衍生化試劑。其中，鏈脲佐菌素注射液中含有鏈脲佐菌素、檸檬酸和檸檬酸鈉。所述磷酸鹽緩沖溶液中含有氯化鈉、氯化鉀、十二水合磷酸氫二鈉和無水磷酸二氫鉀。所述閃爍液中含有b-PBD ;所述衍生化試劑中含有甲氧基胺鹽酸鹽鏈脲佐菌素注射液配制將取一定量朽1檬酸和朽1檬酸鈉，將其加入雙蒸水中配置成朽1 檬酸緩沖液，將檸檬酸緩沖的PH值調(diào)節(jié)至4. 5，用高壓蒸汽消毒，保存在4°C冰箱備用。待需要使用時，稱取的鏈脲佐菌素加入之前配置的檸檬酸緩沖液中混合，充分攪拌后即配置成鏈脲佐菌素注射液。
磷酸鹽緩沖溶液(PBS)配制取一定量氯化鈉、氯化鉀、十二水合磷酸氫二鈉和無水磷酸二氫鉀加入雙蒸水中，用高壓蒸汽消毒，保存在4°C冰箱備用。其中加入各物質(zhì)的重量為氯化鈉7、份、氯化鉀O. I、. 3份、十二水合磷酸氫二鈉3 4份、無水磷酸二氫鉀O.2 O. 4 份。
閃爍液配制用微量分析天平稱取適量閃爍物質(zhì)溶于二甲苯中，輕輕振蕩混勻，室溫保存?zhèn)溆?。?yōu)選用b-PBD作為閃爍物質(zhì)，配制的b-PBD閃爍液的濃度為O. 6^1. 2%。
衍生化試劑配制用微量分析天平稱取適量衍生化物質(zhì)溶于吡啶中，輕輕振蕩混勻，室溫保存?zhèn)溆谩?yōu)選用甲氧基胺鹽酸鹽(Methoxyamine hydrochloride, Μ0Χ),配制的 Μ0Χ)衍生化試劑中MOX的濃度為94 96%。
以下通過將上述試劑應用在確定GLP-I類似物對2型糖尿病血糖調(diào)控機制中，來詳細說明該試劑在確定GLP-I類似物對2型糖尿病血糖調(diào)控機制中的應用，以下GLP-I類似物以艾塞那肽(Exenatide)為例子。
大鼠建模以大鼠為實驗對象，以便更好說明本發(fā)明提供的設(shè)備。選用28只平均體重在 123. 5±8. 5 g左右的SPF級雄性SD大鼠，基礎(chǔ)飼料適應性喂養(yǎng)I周后，隨機分為以下四組 以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)的正常對照組(記為C組)、N=6，以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)的正常對照+Exenatide干預組(記為C+E組)、N=6，以高脂飼料喂養(yǎng)的2型糖尿病大鼠組(記為D組)、N=8，以高脂飼料喂養(yǎng)的2型糖尿病大鼠+Exenatide干預組(記為D+E組)、N=8。
所有大鼠按照SPF級動物房飼養(yǎng)要求于室溫18 25°C、相對濕度50 80%條件下喂養(yǎng)、自由攝食、飲水。喂養(yǎng)10周后，所有大鼠均過夜空腹12小時，于次日早晨9時始，D組與D+E組大鼠予以1%STZ注射液(臨用前現(xiàn)配)30mg/kg腹腔一次性注射，在30秒內(nèi)注射完畢。C組與C+E組大鼠等體積腹腔一次性注射O. 1M、pH值為4. 5的檸檬酸緩沖液。
采用快速血糖儀檢測給藥72 h后大鼠尾靜脈隨機血糖，連續(xù)三次以上測得血糖 ^ 16.7 mmol/L作為糖尿病大鼠成模標準。STZ腹腔注射后，每天觀察大鼠的體重、活動狀態(tài)、攝食飲水、尿量變化。每天監(jiān)測尿糖，當尿糖< +++時(陽性反應)，不予處理；當尿糖 ^ +++時，給予f 3u甘精胰島素皮下注射預防大鼠發(fā)生高滲性昏迷甚至死亡。每周針刺鼠尾取血，用快速血糖儀測定血糖。
糖尿病模型建立后第3天起，C+E組與D+E組大鼠每日腹部皮下注射Exenatide 5 μ g。C組與D組大鼠腹部皮下注射等體積生理鹽水作為對照，治療8周。
腹腔葡萄糖耐量試驗在開始Exenatide干預后第7周進行腹腔葡萄糖耐量試驗。進行試驗前一天，暫停 Exenatide及其相應對照液注射一次，所有大鼠過夜空腹12 16小時，次晨9時始，給予20% 葡萄糖注射液lg/kg體重一次性腹腔注射。分別在注射前(Omin)以及注射后30min、60min 及120min由鼠尾取血,快速血糖儀測定血糖。
腹腔胰島素耐量試驗在腹腔葡萄糖耐量試驗后3天進行腹腔胰島素耐量試驗。在試驗前一天，暫停 Exenatide及其相應對照液注射一次，所有大鼠過夜空腹12 16小時，次晨9時始，將生物合成人胰島素諾和靈R溶于無菌PBS液，予大鼠腹腔一次性注射(O. 75Iu/kg體重)。分別在注射前(Omin)以及注射后30min、60min及90 min由鼠尾取血,快速血糖儀測定血糖。
大鼠示蹤灌流將大鼠腹面向上平放，用動物保定器固定大鼠。將鼠尾輕輕拉直，以一膠帶固定鼠尾于操作臺板上。用一細針刺激大鼠尾部，如果鼠尾無反應，則提示麻醉良好，如鼠尾對針刺有疼痛反應，則可以于尾根部追加O. 5%利多卡因O. 5 lml。術(shù)者持一尖銳的三角形外科手術(shù)刀距離鼠尾根部2. 5cm處，作一長約Icm縱行切口，不能太深，以免傷及皮下之尾動脈。然后垂直于前縱行切口底端，向左做一 2mm橫向切口，呈一反向的L形。
用一小止血鉗在上述L形切口的游離端小心分離皮下組織，暴露覆蓋于尾動脈上方的白色結(jié)締組織層。用三角形外科手術(shù)刀刀尖在動脈上方白色結(jié)締組織層輕輕刺一小洞，然后從該小洞中伸入小眼科剪尖端，緊貼結(jié)締組織正下方，剪開結(jié)締組織層，暴露其正下方約5mm之尾動脈。
使用一眼科鑷小心分離尾動脈周圍附著的深層結(jié)締組織，注意避免損傷周圍小血管。分離完畢后，在動脈下方近心端放置一絲線備用。術(shù)者左手持一眼科鑷夾住暴露尾動脈的遠端，略用力向后上方提起，使動脈繃緊，血流被阻斷而進一步擴張動脈。右手持預先使用肝素鈉溶液濕潤的一次性使用靜脈留置針(美國BD Insyte, 22GX I. 0ΙΝ),近心端方向， 與尾動脈呈約15°置入充血擴張的尾動脈。與尾靜脈穿刺相似，注意穿刺針尖刺破動脈管壁進入O. 5cm左右后，即將穿刺針稍稍向后退出少許，以免導管繼續(xù)深入時，鋒利的穿刺針刺破動脈管壁，造成穿刺失敗。當靜脈導管進入大鼠尾動脈Icm左右后，向后拔出穿刺針， 如見鮮紅色的動脈血快速充滿導管，即說明置管成功。繼續(xù)置入O. 5cm后，立即以肝素鈉濕潤的無菌輸液接頭封閉導管尾部備用。將前述動脈下方近心端放置的備用絲線打結(jié)扎緊， 將置入的動脈導管固定于血管內(nèi)。為防止導管滑脫，再用縫合針將內(nèi)有導管的尾動脈部分與血管附近的結(jié)締組織縫合廣2針，加強固定。術(shù)中，創(chuàng)面如有少量出血，可噴撒少量腎上腺素后壓迫數(shù)分鐘止血。
當導管安全固定于大鼠尾動脈內(nèi)后，在創(chuàng)口處噴撒長效局部麻醉藥布比卡因適量，縫合皮膚后，于皮膚創(chuàng)面處再噴撒適量布比卡因，對置管創(chuàng)面進行長時鎮(zhèn)痛。最后在大鼠尾根部放置一自制的尾夾備用，同時經(jīng)尾動脈導管注射少量肝素鈉溶液，以防止導管堵塞。
將置管完畢的大鼠從自制的保定器中取出，放入實驗用的特制代謝籠。通過大鼠尾根部固定的尾夾將大鼠尾部固定于籠外。大鼠靜息半小時以上，將手術(shù)應激降到最低，以利后續(xù)相關(guān)實驗操作。尾靜脈置管處用高精度恒速灌流泵予生理鹽水 ο μ l/rnin持續(xù)輸注，以保持尾靜脈開放。
在大鼠尾動脈置管處采集一基礎(chǔ)血樣(O. 5ml)后,使用Harvard泵由大鼠尾靜脈恒速灌流3」H-葡萄糖(O. 5 μ Ci/kg/min)和U-13C-甘油(O. 84 μ mol/kg/min)，速度均為 10 μ 1/min,恒速灌流75分鐘。在基礎(chǔ)期灌流結(jié)束的最后10分鐘(第65 75分鐘)內(nèi)，每隔 3分鐘于大鼠尾動脈置管處取動脈血樣O. 5ml。
取完血后，繼續(xù)以Harvard泵由大鼠尾靜脈恒速灌流3_3H_葡萄糖(O. 5 μ Ci/kg/ min, 10 μ 1/min),同時以另一 Harvard泵由大鼠尾靜脈恒速灌流生物合成人胰島素諾和靈 R (5mu/kg/min, 10 μ 1/min)，共持續(xù)90分鐘。每10分鐘從大鼠尾動脈置管處取血10 μ 1， 以手持血糖儀監(jiān)測大鼠血糖一次，當大鼠血糖開始下降且低于6mmol/l左右時，以另一高精度恒速灌流泵從大鼠尾靜脈處輸注50%葡萄糖溶液，根據(jù)所測得的血糖值調(diào)整其灌流速度，保持大鼠血糖穩(wěn)定在6-7mmol/l左右。在鉗夾結(jié)束前的20分鐘(即整個實驗的第145分鐘)時，由大鼠尾靜脈一次性注射I μ Ci 2-脫氧-D-I-14C-葡萄糖，用來測定肌肉組織平均葡萄糖攝取率。在胰島素鉗夾期灌流結(jié)束前的10分鐘開始(第155 165分鐘)，每隔3分鐘于大鼠尾動脈置管處取動脈血樣Iml。灌流結(jié)束時，予3%的戊巴比妥鈉(50mg/kg)由尾靜脈輸入全身麻醉大鼠后，打開胸腔，心臟穿刺取血，并迅速采取胰腺、肝臟、骨骼肌(腓腸肌)， 一部分置于液氮后，-80°C保存。另取部分上述組織以2%戊二醛溶液固定以備后續(xù)組織超微結(jié)構(gòu)觀察。上述所得動脈血樣離心，棄去血球部分，將血漿轉(zhuǎn)入含有抗凝劑的試管，-80°C保存待測。圖4為整個大鼠灌流流程的示意圖。
血漿樣品測定(酸性消化法)取50 μ I大鼠同位素示蹤劑灌流前采集之血漿(基礎(chǔ)血漿)，置低鉀玻璃測量杯。加入 50 μ I的60% HClO4,再加入100 μ I的30%Η202。加蓋密閉后置70°C水浴中消化I. 5小時(注意僅將測量杯下半部浸入水中)。取出測量杯，加入3ml乙二醇甲醚和3ml含O. 8%b-PBD的二甲苯。液體閃爍計數(shù)儀經(jīng)過淬滅校正，測量該血漿樣本的本底3H dpm值。再取相同大鼠同位素灌流后所采集之血漿，按照上述方法測量該血漿樣本的總3H dpm值。采用氧化酶法測定該50 μ I血漿樣本的總葡萄糖量(μ mol),并計算該血漿樣本的3-3H-葡萄糖的比活度 (SA)0
肌肉組織2-脫氧-D-I-14C-葡萄糖比活度測定(酸性消化法)稱取待測濕肌組織約O. Ig,置低鉀玻璃測量杯。加入200 μ I的60%HC104，再加入 400 μ I的30% Η202。加蓋密閉后置70°C水浴中消化I. 5小時(注意僅將測量杯下半部浸入水中)，將待測肌肉組織消化成為無色液體。取出測量杯，加入IOml乙二醇甲醚和8ml 含0.8%b-PBD的二甲苯。液體閃爍計數(shù)儀經(jīng)過淬滅校正，測量該樣本的總14C dpm值。取 50 μ I同只大鼠同位素示蹤劑灌流前采集之血漿(基礎(chǔ)血漿)按照之前血漿樣品測定中采用的方法，測定該血漿樣本的本底14C dpm值，并計算該組織樣本單位質(zhì)量(g)的2-脫氧-D-I-14C-葡萄糖放射活性。
血漿U-13C甘油和1，2，3-13C-葡萄糖豐度測定將I, 2，3-13C-葡萄糖(彡99%，Sigma公司)與普通葡萄糖(彡99%，Sigma公司)分別配制成96 μ g/ml和202 μ g/ml的溶液，互相摻入成理論質(zhì)量比為0%、0. 5%、1%、2%、4%和6%等數(shù)量級的溶液，離心濃縮真空抽干后備衍生化用。
與葡萄糖標準品處理相似，將U-13C-甘油(彡99%,美國Cambridge Isotope)與普通甘油O 99%, Sigma公司)分別配制成117 μ g/ml和214 μ g/ml的溶液,互相摻入成理論質(zhì)量比為0%、0. 5%、1%、2%、4%、6%及10%等數(shù)量級的溶液，離心濃縮真空抽干后備衍生化用。
取20 μ I血漿置于I. 5ml的干凈EP管內(nèi)，在上述EP管內(nèi)加入50ul蒸餾水，在振蕩器上振蕩5秒鐘混合均勻。加O. 5ml預冷的無水乙醇后振蕩I分鐘混合均勻，以3000轉(zhuǎn) /分鐘速度離心10分鐘。取上清液轉(zhuǎn)移入I. 5ml新EP管中，將含有上清液的新EP管開口狀態(tài)下放入離心濃縮儀，65°C下，離心濃縮2小時，真空抽干。在真空抽干的EP管內(nèi)，加入 100 μ I預先配制的MOX衍生化試劑，振蕩混勻60秒后，轉(zhuǎn)移入標準螺紋口 4ml透明樣品瓶內(nèi)(帶Teflon隔墊)，注意密閉。將上述密閉的透明樣品瓶置于80°C烘箱內(nèi)加熱2小時，取出透明樣品瓶，待冷卻后加入100 μ I BSTFA+1%TMCS,再加入300 μ I吡啶，振蕩混勻15 30 秒后，置于80°C烘箱內(nèi)再加熱30分鐘。從烘箱內(nèi)取出樣品瓶后，轉(zhuǎn)移瓶內(nèi)液體入鉗口 2ml 透明進樣瓶(帶Teflon隔墊)內(nèi)，密閉瓶蓋后，置入GC-MS儀待測。
空腹胰島素測定使用前輕輕的徹底混勻磁分離試劑，確保磁性微粒懸浮均勻備用，清洗濃縮液4. 3ml 加純化水至45ml混合均勻備用。
準備各濃度標準品用試管各2只，血清、血漿、質(zhì)控品用試管各2只，放置于試管架上。測定前將各試劑放至室溫(18 25°C)，加樣前充分混勻。設(shè)定恒溫水浴鍋溫度為 370C ±1°C。準備好磁分離免疫測定儀。
第一次孵育(免疫反應)用微量移液器吸取30 μ I各濃度標準品、質(zhì)控品、及待測大鼠血漿，加至標記好的相應試管的底部。用微量移液器加15 μ I Insulin抗試劑一FITC 至各試管，用微量移液器加15 μ I Insulin抗試劑一ALP至各試管。用塑料薄膜覆蓋試管架，置于生化搖擺平臺上，輕輕往復震蕩試管架，使試管內(nèi)試劑徹底混勻。試管連架置37°C 水浴30分鐘。
磁分離①向各試管中加入60 μ I磁分離試劑。磁分離試劑使用前應充分搖勻， 確保磁性微粒均勻懸浮。每加液10支試管搖勻磁分離試劑瓶一次。操作全過程小于5分鐘。②再次用塑料薄膜覆蓋試管，置于生化搖擺平臺上，輕輕往復震蕩試管架，使試管內(nèi)試劑輕輕地徹底混勻。③試管連架置37°C水浴6分鐘。④試管連架放入磁分離器，磁場中沉淀2分鐘。確保每支試管底部都與分離器表面接觸。⑤用一大而緩慢的圓周運動倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上，用強有力的動作拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。⑥放正分離器，加150 μ I稀釋后的清洗液至各試管。⑦從分離器取出試管架放至搖擺平臺，激烈振蕩，徹底混勻。⑧試管連架放入磁分離器，磁場中沉淀2分鐘。 確保每支試管底部都與分離器表面接觸。⑨用一大而緩慢的圓周運動倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上，用強有力的動作拍擊分離器底部以除去粘在管壁上的所有液滴。⑩重復上述⑥ ⑨步驟一次。
第二次孵育(酶反應)①準備一支空白試管，做好標記放置試管架上，為磁分離酶聯(lián)免疫測定儀校零。②從分離器中取出試管架，迅速加90μ I基質(zhì)至各試管，包括空白管。 ③再次用塑料薄膜覆蓋試管，置于生化搖擺平臺上，往復震蕩試管架，使試管內(nèi)試劑徹底混勻。④試管連架置37°C水浴30分鐘。⑤加300 μ I終止液至各試管包括空白管，其加液順序與加基質(zhì)順序相同，5分鐘內(nèi)加完。⑥把試管架放入磁分離器，沉淀15分鐘。⑦用空白管在550nm校零。在550nm、492nm讀取標準品、質(zhì)控品、血漿樣本的吸光值。
根據(jù)標準品的濃度與所測OD值繪制標準曲線，并計算出標準曲線的直線回歸方程式，將待測樣品的OD值代入方程式，算出待測樣品的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為待測樣品的濃度。
血脂測定使用Dimension Rel MAX自動生化分析儀測定。其中甘油三酯(triglyceride,TG)采用 LPL酶終點法測定，總膽固醇(total cholesterole，TC)采用膽固醇氧化酶法(CHOD-PAP) 測定，高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterole, HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(lower density lipoprotein-cholesterole, LDL-C),均米用直接法測定。
數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)使用SPSS 17. O統(tǒng)計分析軟件包進行統(tǒng)計分析。所有計量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)土標準差(土s)表示，多組間均數(shù)比較首先采用方差分析(AN0VA)，若方差分析有顯著性則進一步行均數(shù)間的兩兩比較。同一血漿參數(shù)前后比較采用配對樣本t檢驗。P〈0.05為有統(tǒng)計學意義，P〈0.01為有顯著統(tǒng)計學意義。
結(jié)果各組大鼠體重監(jiān)測結(jié)果實驗開始時(O周)，四組大鼠體重無明顯統(tǒng)計學差異 (P=0. 407)。C組及C+E組大鼠予普通飼料，D組及D+E組大鼠予高脂飼料喂養(yǎng)10周后，四組大鼠體重組間比較出現(xiàn)統(tǒng)計學差異。高脂飼料喂養(yǎng)的D組及D+E組大鼠體重均較普通飼料喂養(yǎng)的C組及C+E組大鼠體重顯著增加(P〈0. 01)。而在小劑量STZ注射(30mg/kg體重) 誘導模型組大鼠成糖尿病并予Exenatide或者等體積生理鹽水皮下注射8周后，C+E組大鼠體重較C組顯著降低(P〈0. 01), D+E組大鼠體重較D組顯著降低(P〈0. 01),詳細數(shù)據(jù)如表 I所示。
表I實驗過程中大鼠體重變化吋同 C周)C組 (n=6)C+E組 (n=6)D組 (n=5)D+E組 (η =5)POMAAtll122.5±3.2121.3±4.4126.4±5.20.40710448.4±34.2467.3±8.7557.2±25.fA534.0±24.2'*0.00018531.9±37.6474.3+24.9"468.2+29.0"397.6±13./*φ0.000同一時間點內(nèi)，與C組比，*p < 0.01 ;與C+E組比，aP < 0.01 ;與0組比，p <0.05。 備注C組為正常對照組、C+E組為正常對照加用Exenatide處理組、D組為糖尿病模型組、 D+E組為糖尿病加用Exenatide處理組,其中C+E組及D+E組從第10周起開始予Exenatide 5 μ g/d,皮下注射一日一次處理。
各組大鼠血糖監(jiān)測結(jié)果實驗開始時，四組大鼠基礎(chǔ)空腹血糖無明顯統(tǒng)計學差異 (P =0.663)。10周后，給予高脂飼料喂養(yǎng)的D組和D+E組大鼠空腹血糖與隨機血糖均較普通飼料喂養(yǎng)的C組及C+E組大鼠血糖升高，但四組大鼠血糖無明顯統(tǒng)計學差異(P =0.091和 P =0. 135)。而在小劑量STZ注射(30mg/kg體重)后，D組與D+E組大鼠隨機血糖均較注射前顯著升高，穩(wěn)定在> 16.7mmol/L的水平，兩組之間無明顯統(tǒng)計學差異(P>0. 05)。而采用檸檬酸緩沖液等體積注射后的C組及C+E組大鼠其血糖注射前后無明顯變化。同一時間點比較(STZ注射后3天)，D組與D+E組大鼠隨機血糖也較C組與C+E組顯著升高(P〈0. 01)。 誘導模型組大鼠成糖尿病后8周，D組大鼠空腹血糖持續(xù)升高，顯著高于其他三組大鼠空腹血糖(P〈0. 01)。而D+E組大鼠經(jīng)過Exenatide皮下注射干預8周后，血糖顯著低于未受干預的D組大鼠(P〈0. 01),但仍高于C組及C+E組(P〈0. 01)。而經(jīng)過Exenatide皮下注射干預8周后的C+E組大鼠空腹血糖也低于C組，出現(xiàn)統(tǒng)計學意義(P〈0. 05)，詳細數(shù)據(jù)如表2所/Jn ο
表2實驗過程中大鼠體重變化吋間C組C+E組D組D+E組η(M)(η=6)(η 二 6)(η 二 5)(η=5)ΓO124.4 ±7,7122.5±3.2121.3±4.4126.4±5.20.40710448.4±34.2467.3±8.7557.2±25.f0.00018531.9±37.6474.3±24.9"468.2±29.ι 397.6±13./αφ0.000同一時間點內(nèi)，與C組比*P < 0.01 ;與C+E組比aP < 0.01 ;與D組比p < O. 05。備注C組為正常對照組，C+E組為正常對照加用Exenatide處理組，D組為糖尿病模型組，D+E 組為糖尿病加用Exenatide處理組；其中C+E組及D+E組從第10周起開始予Exenatide 5 μ g/d,皮下注射一日一次處理。
各組大鼠血糖監(jiān)測結(jié)果實驗開始時，四組大鼠基礎(chǔ)空腹血糖無明顯統(tǒng)計學差異9/17 頁iP =0. 663)。10周后，予高脂飼料喂養(yǎng)的D組和D+E組大鼠空腹血糖與隨機血糖均較普通飼料喂養(yǎng)的C組及C+E組大鼠血糖升高，但四組大鼠血糖無明顯統(tǒng)計學差異Gd =0. 091和 P =0. 135)。而在小劑量STZ注射(30mg/kg體重)后，D組與D+E組大鼠隨機血糖均較注射前顯著升高，穩(wěn)定在> 16.7mmol/L的水平，兩組之間無明顯統(tǒng)計學差異O°>0. 05)。而采用檸檬酸緩沖液等體積注射后的C組及C+E組大鼠其血糖注射前后無明顯變化。同一時間點比較(STZ注射后3天)，D組與D+E組大鼠隨機血糖也較C組與C+E組顯著升高G°〈0. 01)。 誘導模型組大鼠成糖尿病后8周，D組大鼠空腹血糖持續(xù)升高，顯著高于其他三組大鼠空腹血糖(7X0. 01)。而D+E組大鼠經(jīng)過Exenatide皮下注射干預8周后，血糖顯著低于未受干預的D組大鼠0°〈0. 01),但仍高于C組及C+E組(/X0. 01)。而經(jīng)過Exenatide皮下注射干預8周后的C+E組大鼠空腹血糖也低于C組，出現(xiàn)統(tǒng)計學意義0°〈0. 05)，詳細數(shù)據(jù)如表3和表4所示。
表3實驗過程中大鼠空腹血糖變化
權(quán)利要求
1.一種用于確定GLP-I類似物對2型糖尿病血糖調(diào)控機制的設(shè)備，其特征在于，所述設(shè)備包括動物代謝籠、尾部固定夾子；所述動物代謝籠內(nèi)設(shè)有網(wǎng)格板，所述網(wǎng)格板將動物代謝籠分為上下兩部分，動物代謝籠還設(shè)有進出代謝籠的門，動物代謝籠的側(cè)壁上設(shè)有進水孔和尾巴伸出孔。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的設(shè)備，其特征在于，所述進水孔和尾巴伸出孔分別設(shè)置在動物代謝籠的相對兩個側(cè)壁上。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的設(shè)備，其特征在于，所述設(shè)備還包括尾部放置臺，所述尾部放置臺的上表面與尾巴伸出孔下表面平齊。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的設(shè)備，其特征在于，所述動物代謝籠內(nèi)網(wǎng)格板下方還設(shè)有臺板。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或4所述的設(shè)備，其特征在于，在動物代謝籠側(cè)面設(shè)有卡口，所述網(wǎng)格板和臺板通過該卡口插入并固定在動物代謝籠中。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的設(shè)備，其特征在于，所述裝置還包括動物保定器，所述動物保定器具有一端開口的筒狀形狀。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述設(shè)備，其特征在于，所述動物保定器一端開口具有圓形或橢圓形的開口截面，所述開口截面中部向上凸出或向下凹進。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的設(shè)備，其特征在于，所述尾部固定夾子包括相對的兩個夾片，所述夾片中間部具有圓弧形凹部，夾片兩端設(shè)有連接固件。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的設(shè)備，其特征在于，所述圓弧形凹部內(nèi)側(cè)面鋪設(shè)有彈性墊子。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的設(shè)備，其特征在于，所述設(shè)備還包括用于插入動物尾部的尾靜脈的靜脈留置針。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于確定GLP-1類似物對2型糖尿病血糖調(diào)控機制的設(shè)備及其應用，所述設(shè)備包括動物代謝籠、尾部固定夾子；所述動物代謝籠內(nèi)設(shè)有網(wǎng)格板，所述網(wǎng)格板將動物代謝籠分為上下兩部分，動物代謝籠還設(shè)有進出代謝籠的門，動物代謝籠的側(cè)壁上設(shè)有進水孔和尾巴伸出孔。本發(fā)明提供的設(shè)備適用于在不同動物體上測試GLP-1類似物在確定血糖調(diào)控機制，該設(shè)備使用方便，可以便捷、快速確定出2型糖尿病血糖調(diào)控機制。
文檔編號A01K15/02GK102920526SQ20121044044
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月7日
發(fā)明者陸穎理, 夏芳珍, 吳暉, 翟華玲, 杜世春, 孟盈, 許瀟 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院