專利名稱:一種誘導(dǎo)葉柄愈傷組織形成多倍體英國(guó)梧桐的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種多倍體英國(guó)梧桐品種選育方法,特別是一種誘導(dǎo)葉柄愈傷組織形成多倍體英國(guó)梧桐的方法,屬于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的樹(shù)木育種技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù):
懸鈴木科(Platanaceae)植物僅含懸鈴木屬I(mǎi)屬。在我國(guó)引進(jìn)三個(gè)物種栽培,即一球的美國(guó)梧桐(/Vaiazw1S occidentalis Linn. ),二球的英國(guó)梧桐(Platanusacceri folia (kit.) Willd)和三球的法國(guó)梧桐 ipiatanus orientalis Linn.),其中以二球的英國(guó)梧桐最多.其樹(shù)形高大、雄偉端莊、枝葉繁茂、耐修剪、易繁殖、生長(zhǎng)快、壽命長(zhǎng)、抗 煙塵和空氣污染,是優(yōu)秀的庭院樹(shù)和行道樹(shù)種鄭萬(wàn)鈞.中國(guó)樹(shù)木志.1985:1923-1926;陳有民主編.園林樹(shù)木學(xué).1990:400-403。但是在武漢4月一 5月份球果干枯炸裂,其種子 上的冠毛隨處飛舞,不僅污染環(huán)境,且經(jīng)常吹入人口和人眼,導(dǎo)致人們的皮膚疼癢、咳嗽等不適及眼角膜炎等疾病。為此,解決懸鈴木飛毛問(wèn)題是一個(gè)極其困難,又必須解決的問(wèn)題。解決懸鈴木飛毛問(wèn)題的生物技術(shù)途徑有兩條。一是利用多倍體化后植株結(jié)實(shí)率明顯降低,而四倍體與二倍體雜交形成的三倍體就像無(wú)籽西瓜那樣完全不結(jié)實(shí),從而解決飛毛問(wèn)題;二是利用花器形成或減數(shù)分裂基因的失活去產(chǎn)生無(wú)花器或完全不育而不能形成種子的不產(chǎn)生飛毛的突變系,從而解決飛毛問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種誘導(dǎo)葉柄愈傷組織形成多倍體英國(guó)梧桐的方法,是通過(guò)秋水仙素誘導(dǎo)葉柄愈傷組織加倍形成多倍體英國(guó)梧桐新品種(系),以用于解決英國(guó)梧桐的“飛毛”問(wèn)題。本發(fā)明的技術(shù)方案為a.英國(guó)梧桐優(yōu)株種子的無(wú)菌萌發(fā);b.無(wú)菌苗葉柄愈傷組織誘導(dǎo);c.葉柄愈傷組織的秋水仙素處理;d.處理后愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng);e.愈傷組織分化出芽苗;f.芽苗分化出根;g.組培植株的移植;h.成活植株的比較觀察與選擇;1.選株的無(wú)性擴(kuò)繁成穩(wěn)定品種(系)。本發(fā)明的具體過(guò)程為
a.英國(guó)梧桐優(yōu)株種子的無(wú)菌萌發(fā)
選擇生長(zhǎng)旺盛、無(wú)病蟲(chóng)害的優(yōu)良英國(guó)梧桐單株上所結(jié)的果球,從中剝?nèi)》N子為研究材料,種子經(jīng)過(guò)O. 1%升萊處理16min—20min后,用無(wú)菌水沖洗三遍。將種子接種在萌發(fā)培養(yǎng)基上,每IOOml三角瓶接種15粒種子,在25°C黑暗或15001x光照12hr/d下萌發(fā)。接種7天一 15天后種子萌發(fā)出苗;
所述萌發(fā)培養(yǎng)基配方為1/2MS大量元素+MS的有機(jī)成分+MS的微量元素+MS的鐵鹽+0. lmg/L—O. 3mg/L6BA+4% 蔗糖 +0. 75% 瓊脂,ρΗ5· 8 ;
b.無(wú)菌苗葉柄愈傷組織誘導(dǎo)
當(dāng)無(wú)菌苗生長(zhǎng)3個(gè)一5個(gè)葉片時(shí),在無(wú)菌超凈工作臺(tái)上剪下完整葉片,保留O. 5cm—O.8cm葉柄和葉柄上1/5的葉片。再將剪好的葉片的葉柄直立插入到葉柄愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,每IOOml三角瓶接種10個(gè)處理的帶柄葉片。置于20001X光照10hr/d,25°C條件下培養(yǎng)。15天一25天在葉柄基部出現(xiàn)黃色緊實(shí)的圓球形愈傷組織;
所述葉柄愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS +1. Omg/L 2. Omg/L 6BA +1. Omg/L 2. 5mg/L NAA+ 4% sucrose + 0. 75% agar, pH5.8 ;
c.葉柄愈傷組織的秋水仙素處理
當(dāng)葉柄愈傷組織生長(zhǎng)到35天一40天時(shí),將帶愈傷組織的葉柄取出,在超凈工作臺(tái)上去除葉柄和殘留葉片,將愈傷組織置于添加500mg/L 750ml/L秋水仙素,但不加瓊脂的葉柄愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的葉柄愈傷組織加倍培養(yǎng)基中,放在溫室(25°C )搖床上,在50轉(zhuǎn)飛O轉(zhuǎn)/分鐘的速度下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)48hr 60hr ;
所述加倍培養(yǎng)基配方為MS+500mg/L 750mg/L秋水仙素+1. 0mg/L 2. 0mg/L 6BA+1. 0mg/L 2. 5mg/L NAA+4% sucrose , pH5. 8 ;
d.處理后愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng)
葉柄愈傷組織加倍處理完畢,取出愈傷組織經(jīng)無(wú)菌水沖洗三次和無(wú)菌濾紙吸干愈傷組織表面水分后,再將其接種到葉柄愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,恢復(fù)培養(yǎng)7天。e.愈傷組織分化出芽苗
經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)。15天 20天后愈傷組織呈現(xiàn)綠點(diǎn),25天 45天后陸續(xù)分化出芽苗,并可見(jiàn)叢苗出現(xiàn);
所述分化培養(yǎng)基配方為MS+1. 5mg/L 3. 0mg/L 6BA+3% sucrose+0. 75% agar pH5. 8 ;
f.芽苗分化出根
當(dāng)芽苗分化生長(zhǎng)到2. Ocm-8. Ocm時(shí),將芽苗靠近愈傷組織處剪斷移植于生根培養(yǎng)基中,20天 25天后芽苗基部分化出根而形成完整的組織培養(yǎng)植株;
所述生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+0. lmg/ L ^l. Omg/ L IBA+2% sucrose+0. 75% agar,pH5.8 ;
g.組培植株的移植
當(dāng)組培植株生長(zhǎng)到8. 0cnTl2. Ocm高,具有I個(gè) 3個(gè)根的時(shí)候,將進(jìn)行組培植株的移植。首先將要移植植株的培養(yǎng)瓶蓋打開(kāi),每瓶添加IOmf 15ml無(wú)菌水,放到常溫的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)緩苗2天,然后充分清洗掉植株根部的培養(yǎng)基,將植株移栽到滅菌的70%蛭石+15%細(xì)砂+15%園土的基質(zhì)中,澆上1/10MS大量元素溶液,蓋上薄膜和黑網(wǎng)(50%遮光率)。然后每2天噴灑1/10MS大量元素溶液,直至植株成活,再逐步揭開(kāi)黑網(wǎng)和薄膜,使組培苗健壯生長(zhǎng);
h.成活植株的比較觀察與選擇
根據(jù)多倍體和二倍體植株外部形態(tài)的差異,選取葉片變厚,葉色變濃的植株為初選多倍體株,再取候選多倍體株的葉片表皮細(xì)胞觀察氣孔密度和氣孔保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的葉綠體數(shù)。多倍體植株氣孔密度變小,氣孔變大,保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的葉綠體數(shù)目接近二倍體英國(guó)梧桐的二倍;再將多倍體葉片和二倍體葉片的細(xì)胞核進(jìn)行細(xì)胞流式分析儀的DNA含量測(cè)定,多倍體材料葉片中DNA含量相對(duì)為二倍體DNA量的二倍。經(jīng)過(guò)形態(tài)特征,氣孔觀察和DNA含量測(cè)定都明顯顯示出多倍體特點(diǎn)的植株確定為多倍體英國(guó)梧桐單株(本發(fā)明所指的多倍體英國(guó)梧桐單株是四倍體)。1.選株經(jīng)無(wú)性擴(kuò)繁成穩(wěn)定品種(系)由于英國(guó)梧桐可以靠枝條莖段繁殖,因此讓已確定為多倍體英國(guó)梧桐的單株生長(zhǎng)到SOcm-1OOcm時(shí)截取枝條,按每莖段含3個(gè)芽作為繁殖莖段,于立春后的2天-20天內(nèi)插植于苗床上進(jìn)行無(wú)性擴(kuò)繁,而成為穩(wěn)定的多倍體英國(guó)梧桐品種(系)。經(jīng)上述步驟選育的多倍體英國(guó)梧桐品種(系)具有幾種優(yōu)良效果1.經(jīng)過(guò)優(yōu)株上的種子無(wú)菌萌發(fā)后的無(wú)菌苗所取材料不易污染,而且條件易控制,能保證取材的一致性和無(wú)菌性操作。2.葉柄愈傷組織誘導(dǎo)頻率高,而且能夠在培養(yǎng)基中生長(zhǎng),吸收營(yíng)養(yǎng)快,生長(zhǎng)速度快。3.用葉柄愈傷組織進(jìn)行染色體加倍,誘導(dǎo)效果比整體小苗處理效果好,而且再分化出苗后產(chǎn)生嵌合體的頻率低。4.通過(guò)對(duì)選擇多倍體單株的莖段無(wú)性擴(kuò)繁,能較快地形成穩(wěn)定的多倍體英國(guó)梧·桐品種(系)而應(yīng)用于生產(chǎn)。本發(fā)明的多倍體英國(guó)梧桐新品系,將產(chǎn)生少生種子會(huì)不生種子的球果,免除了飛毛的產(chǎn)生,減少了城市污染,美化了城市環(huán)境。
圖1為本發(fā)明無(wú)菌苗葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的帶柄葉片圖片,
圖2為本發(fā)明20天后的圓球形愈傷組織圖片,
圖3為本發(fā)明愈傷組織分化出芽苗圖片,
圖4為本發(fā)明芽苗分化出根圖片,
圖5為本發(fā)明組培植株的移植生長(zhǎng)圖片,
圖6為本發(fā)明多倍體英國(guó)梧桐單株移植苗床上圖片。具體實(shí)驗(yàn)方式
下面以實(shí)施例一多倍體英桐11號(hào)的選育對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明a.英國(guó)梧桐優(yōu)株種子的無(wú)菌萌發(fā)
選擇一株果枝上僅生長(zhǎng)一個(gè)果球的突變體、無(wú)病蟲(chóng)害的優(yōu)良英國(guó)梧桐單株上所結(jié)的果球,從中剝?nèi)》N子為研究材料。種子經(jīng)過(guò)O. 1%升汞處理20min后,用無(wú)菌水沖洗三遍。將種子接種在由1/2MS大量元素+MS的有機(jī)成分+MS的微量元素+MS的鐵鹽+0. lmg/L6BA+4%蔗糖+0. 75%瓊脂,pH5. 8的萌發(fā)培養(yǎng)基上,每IOOml三角瓶接種15粒種子,在25°C黑暗下萌發(fā)。接種7天一 15天后種子萌發(fā)出苗。b.無(wú)菌苗葉柄愈傷組織誘導(dǎo)
當(dāng)無(wú)菌苗生長(zhǎng)4個(gè)葉片時(shí),無(wú)菌剪下完整葉片,保留O. 5cm葉柄和葉柄上1/5的葉片。再將剪好的葉片的葉柄直立插入到葉柄愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+1. 0mg/L6BA+l. 5mg/LNAA+4%sucrose+0. 75% agar ,pH5. 8)中,每100ml三角瓶接種10個(gè)處理的帶柄葉片(附圖片I)。置于2000LX光照10hr/d,25°C條件下培養(yǎng)。15天一25天在葉柄基部出現(xiàn)黃色緊實(shí)的圓球形愈傷組織(附圖片2)。c.葉柄愈傷組織的秋水仙素處理
當(dāng)葉柄愈傷組織生長(zhǎng)到40天時(shí),將帶愈傷組織的葉柄取出,在超凈工作臺(tái)上去除葉柄和殘留葉片,將愈傷組織置于添加500mg/L秋水仙素,但不加瓊脂的葉柄愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的葉柄愈傷組織加倍培養(yǎng)基中,放在溫室(25°C)搖床上,在50轉(zhuǎn)/分鐘的速度下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)48hr。d.處理后愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng)
葉柄愈傷組織處理完畢,取出愈傷組織經(jīng)無(wú)菌水沖洗三次和無(wú)菌濾紙吸干愈傷組織表面水分后,再將其接種到葉柄愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,恢復(fù)培養(yǎng)7天。e.愈傷組織分化出芽苗
經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基(MS+2. Omg/L 6BA+3%sucrose+0. 75% agarpH5. 8)中分化培養(yǎng)。15天 20天后愈傷組織呈現(xiàn)綠點(diǎn),25天 45天后陸續(xù)分化出芽苗,并可見(jiàn)叢苗出現(xiàn)(附圖片3)。f.芽苗分化出根 當(dāng)芽苗分化生長(zhǎng)到2. Ocm-8. Ocm高時(shí),將芽苗靠近愈傷組織處剪斷移植于生根培養(yǎng)基(1/2MS+0. 3mg/lIBA+2%sucrose+0. 75%agar, pH5. 8)中,20 天 25 天后芽苗基部分化出根而形成完整的組織培養(yǎng)植株(附圖片4)。g.組培植株的移植當(dāng)組培植株生長(zhǎng)到8. 0cnTl2. Ocm高,具有I個(gè) 3個(gè)根的時(shí)候,進(jìn)行組培植株的移植。首先將要移植植株的培養(yǎng)瓶蓋打開(kāi),每瓶添加15ml無(wú)菌水,放到常溫的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)緩苗2天,然后充分清洗掉植株根部的培養(yǎng)基,將植株移栽到滅菌的70%蛭石+15%細(xì)砂+15%園土的基質(zhì)中。澆上1/10MS大量元素溶液,蓋上薄膜和黑網(wǎng)(50%遮光率)。然后每2天噴灑1/10MS大量元素溶液,直至植株成活,再逐步揭開(kāi)黑網(wǎng)和薄膜,使組培苗健壯生長(zhǎng)(附圖片5)。h,成活植株的比較觀察與選擇
根據(jù)多倍體和二倍體植株外部形態(tài)的差異,選取葉片變厚,葉色變濃的植株為初選多倍體株,再取候選多倍體株的葉片表皮細(xì)胞觀察氣孔密度和氣孔保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的葉綠體數(shù)。多倍體植株氣孔密度變小,氣孔變大,保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的葉綠體數(shù)目接近二倍體英國(guó)梧桐的二倍;再將多倍體葉片和二倍體葉片的細(xì)胞核進(jìn)行細(xì)胞流式分析儀的DNA含量測(cè)定,多倍體材料葉片中DNA含量相對(duì)為二倍體DNA量的二倍。經(jīng)過(guò)形態(tài)特征,氣孔觀察和DNA含量測(cè)定都明顯顯示出多倍體特點(diǎn)的植株確定為多倍體英國(guó)梧桐單株(附圖片6)。1.選株經(jīng)無(wú)性擴(kuò)繁成穩(wěn)定品種(系)
由于英國(guó)梧桐可以靠枝條莖段繁殖,因此讓已確定為多倍體英國(guó)梧桐的單株生長(zhǎng)到SOcm-1OOcm時(shí)截取枝條,按每莖段含3個(gè)芽莖作為繁殖莖段,于立春后的2天-20天內(nèi)插植于苗床上進(jìn)行無(wú)性擴(kuò)繁,而成為穩(wěn)定的多倍體英國(guó)梧桐品系一多倍體英桐11號(hào)。
權(quán)利要求
1. 一種誘導(dǎo)葉柄愈傷組織形成多倍體英國(guó)梧桐的方法,其特征在于選育過(guò)程為 a.英國(guó)梧桐優(yōu)株種子的無(wú)菌萌發(fā) 選擇優(yōu)良英國(guó)梧桐單株的種子經(jīng)過(guò)O. 1%升汞消毒處理16min — 20min后,接種在萌發(fā)培養(yǎng)基上,在25°C黑暗或15001x光照12hr/d下萌發(fā),接種7天一 15天后種子萌發(fā)出苗;所述萌發(fā)培養(yǎng)基配方為1/2MS大量元素+MS的有機(jī)成分+MS的微量元素+MS的鐵鹽+0. lmg/L—O. 3mg/L6BA+4% 蔗糖 +0. 75% 瓊脂,ρΗ5· 8 ; b.無(wú)菌苗葉柄愈傷組織誘導(dǎo) 當(dāng)無(wú)菌苗生長(zhǎng)3個(gè)一5個(gè)葉片時(shí),在超凈工作臺(tái)上剪下完整葉片,保留O. 5cm—O. 8cm葉柄和葉柄上1/5的葉片,再將剪好的葉片的葉柄直立插入到葉柄愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,置于20001X光照10hr/d,25°C條件下培養(yǎng),15天一25天在葉柄基部出現(xiàn)黃色緊實(shí)的圓球形愈傷組織; 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+1. O mg/L 2. Omg/L 6BA+1. O 2. 5mg/L NAA +4% Sucrose+0. 75% 瓊脂,ρΗ5· 8 ; c.葉柄愈傷組織的秋水仙素處理 當(dāng)葉柄愈傷組織生長(zhǎng)到35天一40天時(shí),將愈傷組織置于添加500mg/L 750ml/L秋水仙素,但不加瓊脂的葉柄愈傷組織加倍培養(yǎng)基中,放在溫室(25°C)搖床上,在50轉(zhuǎn)飛O轉(zhuǎn)/分鐘的速度下旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)48hr 60hr ; 所述加倍培養(yǎng)基配方為MS+500mg/L 750mg/L秋水仙素+1. Omg/L2. Omg/L 6BA+1. Omg/L 2. 5mg/LNAA+4% Sucrose , pH5. 8 ; d.處理后愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng) 葉柄愈傷組織加倍處理完畢,取出愈傷組織經(jīng)無(wú)菌水沖洗和吸干表面水分后,接種到葉柄愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,恢復(fù)培養(yǎng)7天; e.愈傷組織分化出芽苗 經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基中分化培養(yǎng) 15天 20天后愈傷組織呈現(xiàn)綠點(diǎn),25天 45天后陸續(xù)分化出芽苗,并可見(jiàn)叢苗出現(xiàn); 所述分化培養(yǎng)基配方為MS+1. 5mg/L 3. 0mg/L 6BA+3% Sucrose+0. 75% agar, pH5. 8 ; f.芽苗分化出根 當(dāng)芽苗分化生長(zhǎng)到2. Ocm-8. Ocm時(shí),將芽苗靠近愈傷組織處剪斷移植于生根培養(yǎng)基中,20天 25天后芽苗基部分化出根而形成完整的組織培養(yǎng)植株; 所述生根培養(yǎng)基配方為l/2MS+0. lmg/ L ^l. Omg/ L IBA+2% sucrose +0. 75% agar, ρΗ5· 8 ; g.組培植株的移植 當(dāng)組培植株生長(zhǎng)到8. 0cnTl2. Ocm高,具有I個(gè) 3個(gè)根的時(shí)候,將進(jìn)行組培植株的移植,首先將要移植植株的培養(yǎng)瓶蓋打開(kāi),每瓶添加IOmf 15ml無(wú)菌水,放到常溫的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)緩苗2天,然后充分清洗掉植株根部的培養(yǎng)基,將植株移栽到滅菌的70%蛭石+15%細(xì)砂+15%園土的基質(zhì)中,澆上1/10MS大量元素溶液,蓋上薄膜和黑網(wǎng),然后每2天噴灑1/10MS大量元素溶液,直至植株成活,再逐步揭開(kāi)黑網(wǎng)和薄膜,使組培苗健壯生長(zhǎng); h.成活植株的比較觀察與選擇 根據(jù)多倍體和二倍體植株外部形態(tài)的差異,選取葉片變厚,葉色變濃的植株為初選多倍體株,再取候選多倍體株的葉片表皮細(xì)胞觀察氣孔密度和氣孔保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的葉綠體數(shù)多倍體植株氣孔密度變小,氣孔變大,保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)的葉綠體數(shù)目接近二倍體英國(guó)梧桐的二倍;再將多倍體葉片和二倍體葉片的細(xì)胞核進(jìn)行細(xì)胞流式分析儀的DNA含量測(cè)定,多倍體材料葉片中DNA含量相對(duì)為二倍體DNA量的二倍; 經(jīng)過(guò)形態(tài)特征,氣孔觀察和DNA含量測(cè)定都明確顯示出多倍體特點(diǎn)的植株確定為多倍體英國(guó)梧桐單株;1.選株經(jīng)無(wú)性擴(kuò)繁成穩(wěn)定品種、品系 將已確定為多倍體英國(guó)梧桐的單株生長(zhǎng)到80cm-100cm時(shí)截取枝條,按每莖段含3個(gè)芽作為繁殖莖段,于立春后的2天-20天內(nèi)插植于苗床上進(jìn)行無(wú)性擴(kuò)繁,而成為穩(wěn)定的多倍體英國(guó)梧桐品種(系)。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種誘導(dǎo)葉柄愈傷組織形成多倍體英國(guó)梧桐的方法,是通過(guò)秋水仙素誘導(dǎo)葉柄愈傷組織加倍形成多倍體英國(guó)梧桐新品種(系),以用于解決英國(guó)梧桐的“飛毛”問(wèn)題。其步驟為a)英國(guó)梧桐優(yōu)株種子的無(wú)菌萌發(fā),b)無(wú)菌苗葉柄愈傷組織誘導(dǎo),c)葉柄愈傷組織的秋水仙素處理,d)處理后愈傷組織的恢復(fù)培養(yǎng),e)愈傷組織分化出苗,f)芽苗分化出根,g)組培植株的移植,h)成活植株后的觀察和選擇,i)選株的無(wú)性擴(kuò)繁成穩(wěn)定品種(系)。本發(fā)明的多倍體英國(guó)梧桐新品種,有利于產(chǎn)生少種子或無(wú)種子的球果,免除了飛毛的產(chǎn)生,減少了城市污染,美化了城市環(huán)境。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102986527SQ20121043529
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月5日
發(fā)明者蔡得田, 陳冬玲, 王維, 宋兆建, 何玉池 申請(qǐng)人:湖北大學(xué)