專(zhuān)利名稱(chēng)：一種月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生方法，尤指一種以2，4-D和TDZ共同誘導(dǎo)中國(guó)月季月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生的方法及該方法在月月紅快速繁殖、基因轉(zhuǎn)化、人工體胚中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
體細(xì)胞胚胎發(fā)生(Somatic Embryogenesis)是指在離體培養(yǎng)條件下植物的體細(xì)胞通過(guò)與合子胚類(lèi)似的途徑發(fā)育成新個(gè)體的過(guò)程。由于其速度快、數(shù)量大、結(jié)構(gòu)完整等特點(diǎn)，利用體細(xì)胞胚胎發(fā)生進(jìn)行喬木樹(shù)種的人工種子育苗，可能成為未來(lái)人工林苗木來(lái)源的一種重要手段；由于體細(xì)胞胚胎往往產(chǎn)生于單個(gè)細(xì)胞，通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，有利于獲得純合的轉(zhuǎn)基因植株；此外，胚性培養(yǎng)物是全能性原生質(zhì)體的重要來(lái)源，可用于樹(shù)種的遺傳轉(zhuǎn)化及體細(xì)胞雜交等研究，達(dá)到改良森林樹(shù)種的目的。
體細(xì)胞胚胎發(fā)生是植物界的普遍現(xiàn)象，自1948年Curits等從蘭屬雜種胚愈傷組織中首次發(fā)現(xiàn)和正常胚相似的胚狀體結(jié)構(gòu)以來(lái)，已在43科97屬114種植物中有了體細(xì)胞胚胎發(fā)生的報(bào)道。木本植物的體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究起步較晚，但這個(gè)領(lǐng)域的研究卻取得了令人矚目的進(jìn)展。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)已從挪威云杉、油棕、石刁柏、歐洲七葉樹(shù)、胡桃楸、花旗松等樹(shù)種中有體細(xì)胞胚胎發(fā)生報(bào)道。月季是世界四大切花之一，也是中國(guó)十大名花之一，其中中國(guó)古老月季月月紅是現(xiàn)代月季的鼻祖，在月季/玫瑰育種中占有非常重要的位置。月季的體細(xì)胞胚胎發(fā)生雖已有報(bào)道，但未見(jiàn)月月紅體胚胎成功的報(bào)道。本發(fā)明人一直從事月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生和再生研究，發(fā)現(xiàn)通過(guò)激素調(diào)控可以誘導(dǎo)月月紅的器官發(fā)生(Organogenesis)，直接產(chǎn)生芽，但是誘導(dǎo)率和再生率非常低，未見(jiàn)合子胚類(lèi)似的體胚發(fā)生。不能形成快速、完整、幼化再生株系，難以通過(guò)基因轉(zhuǎn)化途徑改良月季(月月紅)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生方法，是含2，4-D、TDZ、ABA、GA3和L-脯氨酸的多種培養(yǎng)基在不同光質(zhì)和光強(qiáng)條件下的應(yīng)用，具體地說(shuō)，就是用上述激素和有機(jī)物組成搭配成不同培養(yǎng)基，在不同光質(zhì)和光強(qiáng)條件下對(duì)月月紅葉柄體細(xì)胞進(jìn)行分階段誘導(dǎo)，最后誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚胎和再生植株。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用技術(shù)方案是一種用于月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生的胚性愈傷誘導(dǎo)方法，該方法是將帶有O. 8-1. 2_葉柄的月月紅無(wú)菌芽嫩葉置于EP培養(yǎng)基中，在23°C 27°C黑暗培養(yǎng)2-6個(gè)月(一般2個(gè)月就可以獲得愈傷組織，如需獲得更多愈傷組織，可以延長(zhǎng)時(shí)間)，得到透明水潰狀或淺棕色的胚性愈傷組織；EP培養(yǎng)基組成SH培養(yǎng)基+2，4-D3.0mg/L+TDZ1.0mg/L+ L-脯氨酸300. O mg/L，并加入4. Og/L瓊脂糖固化培養(yǎng)基，PH值為5. 4。在該培養(yǎng)條件下，月月紅的愈傷組織可以長(zhǎng)期培養(yǎng)，并保護(hù)體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力。上述無(wú)菌芽是取一年生半木質(zhì)化枝條表面消毒后，置于SP培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-3個(gè)月得到；SP 培養(yǎng)基組成MS 固體培養(yǎng)基+6-BA2. Omg/L+NAA O. lmg/L+GA33. 0mg/L，pH值為 6. O,121°C、125 kPa滅菌15min，培養(yǎng)條件溫度為23°C 27°C，每天16h光照，8h黑暗，光照強(qiáng)度為白光1600LUX，。上述表面消毒是指先用70%體積濃度的酒精消毒30秒，再置于O. 3%體積濃度的次氯酸鈉溶液中15分鐘,最后用無(wú)菌水清洗3次。本發(fā)明還提供一種月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，該方法是將上述月月紅胚性愈傷組織置于EM培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-3個(gè)月，得到兩片子葉為主的體細(xì)胞胚；EM培養(yǎng)基組成SH培養(yǎng)基+2，4-D1. 0mg/L+TDZ0. 2mg/L+L_ 脯氨酸 300mg/L+ABA2. 5mg/L+ GAS3. Omg/L，培養(yǎng)條件溫度為23°C 27°C，每天16h光照，8h黑暗，光照強(qiáng)度為紅光400Lux。本發(fā)明另提供一種月月紅體細(xì)胞胚胎再生植株方法，該方法是將上述月月紅體細(xì)胞胚置于SP2培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-3個(gè)月以產(chǎn)生芽，再按常規(guī)技術(shù)培育出植株；SP2培養(yǎng)基組成MS 固體培養(yǎng)基 +6-BA1. 0mg/L+NAA0. 2mg/L+L-脯氨酸 300mg/L+ GAS3. 0mg/L,培養(yǎng)條件溫度為23°C 27°C，每天16h光照，8h黑暗，光照強(qiáng)度為普通白光1600Lux。本發(fā)明還提供在月月紅轉(zhuǎn)基因和種質(zhì)改良、創(chuàng)新中的應(yīng)用，以及在月月紅人工種子制作、良種推廣中的應(yīng)用。現(xiàn)有技術(shù)通過(guò)單一的2，4-D誘導(dǎo)，在暗培養(yǎng)結(jié)合單一白光下培養(yǎng)的方法，雖然能誘導(dǎo)出芽狀胚，但出現(xiàn)頻率非常低；沒(méi)有培養(yǎng)出合子胚類(lèi)似的子葉，營(yíng)養(yǎng)積累不夠，再生難，不正常胚多，用于快速繁殖和基因轉(zhuǎn)化相當(dāng)困難。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中多體細(xì)胞胚胎發(fā)生頻率低、再生難、不正常胚多等問(wèn)題。采用本發(fā)明的方法，利用2，4-D和TDZ結(jié)合共同誘導(dǎo)，胚性愈傷誘導(dǎo)率大大提高；利用暗培養(yǎng)結(jié)合低光強(qiáng)紅光(400LUX)再到普通白光(1600LUX)，增加體胚誘導(dǎo)過(guò)程中胚對(duì)紅光的偏好和對(duì)光強(qiáng)的適應(yīng)性，促進(jìn)胚養(yǎng)分的積累和子葉的形成；利用ABA的適當(dāng)增加，促進(jìn)體胚由芽向單個(gè)子葉、雙子葉和多個(gè)子葉過(guò)渡。從而確定最佳誘導(dǎo)雙子葉體胚的濃度和條件，大大提高成苗的再生率。在月月紅快速繁殖、基因轉(zhuǎn)化、人工體胚及月季品種改良中有廣泛的應(yīng)用前景。


圖I是月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生圖。其中A、球形原胚，B、單子葉期原胚，C、心形期原胚，D、三子葉形原胚；E-G為含1.0 mg/LABA的培養(yǎng)基上不同光處理產(chǎn)生的芽和胚E、在暗培養(yǎng)中產(chǎn)生的芽狀胚，F(xiàn)、在紅光處理下產(chǎn)生的胚，G、在白光條件下產(chǎn)生的胚；H-O為不同濃度的ABA處理產(chǎn)生的體胚H、紅光處理下沒(méi)有ABA的培養(yǎng)基上產(chǎn)生芽和單子葉胚，I、紅光處理下含有2. 5mg/L ABA的培養(yǎng)基上主要產(chǎn)生雙子葉胚，J_0為隨著ABA濃度的增加出現(xiàn)的不正常胚三子葉胚J、四子葉胚K、叢芽胚P、叢指胚Q、根狀胚R、喇叭狀胚S。圖2是月月紅不同體細(xì)胞胚胎再生正常芽的頻率圖。其中C0_沒(méi)有子葉的芽狀胚、Cl-單子葉胚、C2-雙子葉胚、Cp-多子葉、叢指胚及
叢芽胚等不正常胚，平均值是三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，在0. 05水平上沒(méi)有顯著差異用同一字母(a, b, c)表不。圖3是體細(xì)胞胚胎再生的小植株圖。其中C2 :雙子葉胚再生的植株，Cl :單子葉胚再生的植株，CO :無(wú)子葉胚再生的芽，R :開(kāi)花的再生植株。圖中箭頭所指為芽上殘留的子葉。
具體實(shí)施例方式以下將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地說(shuō)明。實(shí)施例I植物材料選取北京林業(yè)大學(xué)苗圃中的月月紅(R. chinensis Jacq.) —年生半木質(zhì)化枝條進(jìn)行表面消毒(先用70%的酒精消毒30秒，再置于O. 3%的次氯酸鈉溶液中15分鐘，最后用無(wú)菌水清洗3次)。置于含6-BA 2. Omg/L、O. lmg/L NAA及3. Omg/L GA3的MS固體培養(yǎng)基 (含這些激素的培養(yǎng)基定名為SP培養(yǎng)基)上培養(yǎng)2個(gè)月以產(chǎn)生無(wú)菌芽。無(wú)菌芽每月繼代到新鮮SP培養(yǎng)基上，所有培養(yǎng)基調(diào)整pH值為6.0后于121°C、125 kPa滅菌15min。培養(yǎng)條件溫度為23°C 27°C，每天16h光照，8h黑暗，光照強(qiáng)度為普通白光1600Lux。結(jié)果表明，月月紅在SP培養(yǎng)基上生長(zhǎng)正常健壯，增殖系數(shù)平均為5芽/月。實(shí)施例2愈傷組織的誘導(dǎo)用帶有Imm葉柄的無(wú)菌芽嫩葉置于EP培養(yǎng)基上(EP培養(yǎng)基為基本的SH培養(yǎng)基加
3.Omg/L 2，4-D、lmg/L TDZ及300. O mg/L L-脯氨酸，用4. Og/L瓊脂糖固化培養(yǎng)基，調(diào)整pH值至5. 4)，置于23-27°C暗培養(yǎng)2個(gè)月。結(jié)果表明，含3mg/L 2，4_D和lmg/LTDZ的培養(yǎng)基可以產(chǎn)生淺棕色或透明水潰狀胚性愈傷，誘導(dǎo)率約為25%。實(shí)施例3體細(xì)胞胚胎發(fā)生大部分胚性愈傷(一般為棕褐色的松散顆粒，或透明水潰狀愈傷塊)在優(yōu)化的EM培養(yǎng)基上(優(yōu)化的EM培養(yǎng)基為基本的SH培養(yǎng)基加I. Omg/L 2，4_D、0. 2 mg/L TDZ、2. 5mg/L ABA,3 mg/L GA3及300. 0 mg/L L-脯氨酸，用4. Og/L瓊脂糖固化培養(yǎng)基。調(diào)整pH值至
5.4 )培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23 °C 27 °C，光照為暗培養(yǎng)、或紅光(400Lux，光16h/暗8h )、或普通白光(1600Lux，光16h/暗8h)。兩周后會(huì)產(chǎn)生球形的原胚(見(jiàn)圖1A)。一部分在后續(xù)培養(yǎng)中繼續(xù)分化出各種類(lèi)型的胚(見(jiàn)圖IB-圖1D)。實(shí)施例4不同光照條件下的體細(xì)胞胚胎發(fā)生將EP培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的胚性愈傷(一般為棕褐色的松散顆粒，或透明水潰狀愈傷塊)繼代到誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的EM培養(yǎng)基上(EM培養(yǎng)基為基本的SH培養(yǎng)基加I. Omg/L 2，4-D、0.2 mg/L TDZU. 0mg/L ABA、3mg/L GA3 及 300. Omg/L L-脯氨酸，用 4. Og/L 瓊脂糖固化培養(yǎng)基，調(diào)整pH值至5. 4)，分成三組，分別置于暗培養(yǎng)、紅光(13W Mini TwisterEnergy Saver Red,Phillips,光強(qiáng)約為 7. 2MMo I τα2 s—1)和白光(TLP 36 ff/840, Phillips,光強(qiáng)約為27.0 μΜοΙ m_2 s—1)培養(yǎng)2個(gè)月。培養(yǎng)條件溫度為25±2°C，光照周期為每天光16h，暗8h。其它的胚性愈傷組織在EP培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，以便保持其胚胎發(fā)生的能力。結(jié)果表明，含0. 2mg/L TDZ和300. 0mg/L L-脯氨酸的EM培養(yǎng)基有利于胚性愈傷的生長(zhǎng)，特別是含有TDZ的培養(yǎng)基上胚胎發(fā)生頻率是未加TDZ的培養(yǎng)基的胚胎發(fā)生頻率的4倍。長(zhǎng)時(shí)間放在含TDZ的EP培養(yǎng)基上培養(yǎng)可產(chǎn)生非羽狀復(fù)葉的真葉(見(jiàn)圖IN-圖10)，TDZ濃度越高，葉片越成半透明玻璃化的葉片(見(jiàn)圖10)。暗培養(yǎng)芽的誘導(dǎo)和分生的頻率最高，但產(chǎn)生的不正常苗的頻率也最高(見(jiàn)圖1E);紅光條件下胚胎發(fā)生的頻率最高，產(chǎn)生不正常苗的頻率最低(圖1F);在有光條件下(包括紅光和白光)，產(chǎn)生的胚往往先形成子葉(圖IF及圖1G)，不同的是，紅光條件下愈傷能繼續(xù)保持淺棕紅色、水潰狀，并持續(xù)保持胚胎發(fā)生的能力，而在白光下，愈傷組織容易變成白色、綠色、表面干硬，逐漸喪失胚胎發(fā)生的能力。實(shí)施例5不同ABA水平對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響將培養(yǎng)12周的胚性愈傷組織分成5組，每組約I克，在含不同濃度ABA (O、I. O、
2.5,5. Omg/L)的EM培養(yǎng)基上培養(yǎng)2個(gè)月。EM培養(yǎng)基的其它組份同實(shí)施例4。
結(jié)果表明，在紅光條件下，胚胎發(fā)生過(guò)程中胚胎的子葉數(shù)與EM培養(yǎng)基中ABA的含量成正相關(guān)，未含ABA的EM培養(yǎng)基中產(chǎn)生的胚有芽狀胚和子葉胚兩種(圖1H)，含ABA
I.Omg/L的EM培養(yǎng)基上產(chǎn)生胚以單片子葉胚為主，含ABA 2. 5mg/L EM培養(yǎng)基上產(chǎn)生胚以?xún)善尤~為主(圖II)，這些子葉胚或胚都具有兩極性，即同時(shí)具有芽的生長(zhǎng)端和根的生長(zhǎng)端(圖IL及圖1M)，而在含ABA 5. Omg/L的EM培養(yǎng)基上產(chǎn)生的胚會(huì)有三片(圖1J)、四片(圖1K)甚至多子葉胚，以及其它非正常胚如芽狀胚、根狀胚、手指狀胚和喇叭狀胚等(見(jiàn)圖IP-圖1S)。因此，結(jié)合實(shí)施例4和實(shí)施例5可知，EM培養(yǎng)基最好配方為基本的SH培養(yǎng)基加 I. Omg/L 2, 4-D,O. 2 mg/L TDZ、2. 5mg/L ABA,3 mg/L GA3 R 300. 0 mg/L L-脯氨酸，用4. Og/L瓊脂糖固化培養(yǎng)基，pH值調(diào)至5. 4。實(shí)施例6不同體細(xì)胞胚胎的植株再生將EM培養(yǎng)基上產(chǎn)生的不同的類(lèi)型體細(xì)胞胚胎轉(zhuǎn)入SP2培養(yǎng)基(SP2培養(yǎng)基組成MS 固體培養(yǎng)基 +6-BA1. Omg/L+NAAO. 2mg/L+L_ 脯氨酸 300mg/L+ GAS3. Omg/L)培養(yǎng) 2 個(gè)月以促進(jìn)芽產(chǎn)生，培養(yǎng)條件溫度為23°C 27°C，每天16h光照，8h黑暗，光照強(qiáng)度為普通白光1600Lux,見(jiàn)圖2,再以常規(guī)技術(shù)培育出植株。結(jié)果表明，兩片子葉的胚再生成為植株的能力最強(qiáng)(圖3C2及圖3R)，再生率達(dá)50%左右；其次是無(wú)子葉的芽，再生率可達(dá)30%左右，見(jiàn)圖3C0 ;單片子葉胚的再生率約為15%左右，見(jiàn)圖3C1 ;其它類(lèi)型胚的再生率最低，在5%以下。
權(quán)利要求
1.一種用于月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生的胚性愈傷誘導(dǎo)方法，其特征在于該方法是將帶有O. 8-1. 2mm葉柄的月月紅無(wú)菌芽嫩葉置于EP培養(yǎng)基中，在23°C 27°C黑暗培養(yǎng)2_6個(gè)月，得到透明水潰狀或淺棕色的胚性愈傷組織；EP培養(yǎng)基組成SH培養(yǎng)基+2，4-D3. Omg/L+TDZ1. Omg/L+ L-脯氨酸300. O mg/L,并加入4. Og/L瓊脂糖固化培養(yǎng)基，pH值為5. 4。
2.如權(quán)利要求I所述的一種用于月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生的胚性愈傷誘導(dǎo)方法，其特征在于所述無(wú)菌芽是取一年生半木質(zhì)化枝條表面消毒后，置于SP培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-3個(gè)月得到；SP 培養(yǎng)基組成MS 固體培養(yǎng)基 +6-BA2. Omg/L+NAA O. lmg/L+GA33. Omg/L, pH 值為 6. 0，121°C、125 kPa滅菌15min，培養(yǎng)條件溫度為23°C 27°C，每天16h光照，8h黑暗，光照強(qiáng)度為普通白光1600Lux。
3.如權(quán)利要求2所述的一種用于月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生的胚性愈傷誘導(dǎo)方法，其特征在于所述表面消毒是指先用70%體積濃度的酒精消毒30秒，再置于O. 3%體積濃度的次氯酸鈉溶液中15分鐘，最后用無(wú)菌水清洗3次。
4.一種月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生方法，其特征在于該方法是將按權(quán)利要求I或2或3所述方法得到的月月紅胚性愈傷組織置于EM培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-3個(gè)月，得到兩片子葉為主的體細(xì)胞胚；EM培養(yǎng)基組成SH培養(yǎng)基+2，4-D1. 0mg/L+TDZ0. 2mg/L+L-脯氨酸300mg/L+ABA2. 5mg/L+ GAS3. Omg/L,培養(yǎng)條件溫度為23°C 27°C，每天16h光照，8h黑暗，光照強(qiáng)度為紅光400Lux。
5.一種月月紅體細(xì)胞胚胎再生植株方法，其特征在于該方法是將按權(quán)利要求4所述方法得到的月月紅體細(xì)胞胚置于SP2培養(yǎng)基上培養(yǎng)1-3個(gè)月以產(chǎn)生芽，再按常規(guī)技術(shù)培育出植株；SP2培養(yǎng)基組成MS固體培養(yǎng)基+6-BA1. 0mg/L+NAA0. 2mg/L+L-脯氨酸300mg/L+GAS3. 0mg/L,培養(yǎng)條件溫度為23°C 27°C，每天16h光照，8h黑暗，光照強(qiáng)度為普通白光1600Luxo
6.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法在月月紅轉(zhuǎn)基因和種質(zhì)改良、創(chuàng)新中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法在月月紅人工種子制作、良種推廣中的應(yīng)用。
全文摘要
一種月月紅體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生方法，該方法是以帶葉柄的月月紅(Rosa chinensis Jacq.)無(wú)菌芽嫩葉為材料通過(guò)添加有2,4-D、TDZ和L-脯氨酸的SH培養(yǎng)基共同作用，誘導(dǎo)出愈傷組織，然后在紅光作用下誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，進(jìn)一步獲得再生植株的過(guò)程。該方法用不同的培養(yǎng)基，分別在暗培養(yǎng)、紅光培養(yǎng)和普通白光的條件下，獲得高頻發(fā)生的體細(xì)胞胚胎，正常植株再生率達(dá)到50%左右。高頻發(fā)生的體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生方法在基因轉(zhuǎn)化、基因功能驗(yàn)證、快速繁殖、樹(shù)齡幼化、人工種子創(chuàng)制、種質(zhì)改良與創(chuàng)新方面具有極廣泛的用途。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102884984SQ201210434709
公開(kāi)日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2012年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月5日
發(fā)明者陳己任, 熊興耀, 鄧子牛 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)