專利名稱：利用體細胞胚繁育文山兜蘭苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種利用體細胞胚繁育文山兜蘭苗的方法，屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
文山5 蘭iPaph. FeflsAafleflseO 為蘭科(Orchidaceae) 5 蘭屬(PaphiopediUtnH物，是蘭科中的珍品，被《華盛頓公約》列為iv級珍稀瀕危物種，是極具觀賞價值的世界級花卉名品。文山兜蘭花期長，花色莊重、素雅，花型奇特，其唇瓣狀如拖鞋，故有“拖鞋蘭”之稱，背萼特別發(fā)達，具有艷麗的花紋。中國的兜蘭屬植物雖然豐富，但由于過度采集，走私出境猖獗以及生境破壞等原因，近十幾年來野生兜蘭的數(shù)量急劇減少，分布區(qū)逐漸萎縮，不少種類已經(jīng)到了滅絕的邊緣。針對野生兜蘭受到掠奪性采挖、交易而導致該類群植物迅速減少甚至滅絕的狀況，《華盛頓公約》(即《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》，(Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora, CITEbノ把所有兜蘭屬植物列入其附錄一名錄。文山5 蘭分布于云南東南部文山縣,生長在海拔1000 1200m的石灰?guī)r并有茂密灌木和草叢的地區(qū)?；ǘ涑嗜榘咨螯S白色，中萼片具與花瓣具有褐紅色粗斑點。由于文山兜蘭生長分布區(qū)域狹窄，且原始生境受損嚴重，野生文山兜蘭種質(zhì)已變得極為稀少；同吋，文山兜蘭的種子與大多數(shù)蘭花種子一祥，沒有胚乳，在自然環(huán)境下極難萌發(fā)。采用傳統(tǒng)分株方式繁殖，繁殖系數(shù)也較低，難以達到保護及開發(fā)的要求。兜蘭屬植物采用傳統(tǒng)蘭花無菌播種技術(shù)進行繁殖，不僅難度大，且增殖困難，對文山兜蘭的有效繁殖產(chǎn)生了較大的瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是采用一種體細胞胚繁育技術(shù)來繁殖文山兜蘭的方法，該方法通過對培養(yǎng)基的篩選、培養(yǎng)方法的選擇，利用文山兜蘭種子進行體細胞胚的誘導，最終得到文山兜蘭苗。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案ー種利用體細胞胚繁育文山兜蘭苗的方法，其特征在于經(jīng)過下列各步驟
(1)把成熟文山兜蘭果實滅菌后，切開果實取出種子，接種于下列誘導萌發(fā)培養(yǎng)基中Ms + 2. 0mg/L 的 6-BA + 100ml/L 的椰子汁 + 80g/L 的香蕉泥+ 50g/L 的土豆泥+ 5g/L的活性炭+ 30g/L的蔗糖+6g/L的瓊脂，pH值為5. 2 5. 4 ;暗培養(yǎng)至種子萌發(fā)后，轉(zhuǎn)入1000 15001X的弱光下，培養(yǎng)25 35天，得到幼胚；
(2)將步驟(I)得到的幼胚轉(zhuǎn)接到下列液體培養(yǎng)基中Ms+2.0mg/L的6-BA+O. 5mg/L的TDZ+100ml/L的椰子汁+80g/L的香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的鹿糖，pH值為5. 2 5. 4 ;在溫度為26 27°C，光照強度為1000 15001x，轉(zhuǎn)速為120 150r/min的條件下，培養(yǎng)40 50天，每15天更換一次上述液體培養(yǎng)基，過濾分離出的培養(yǎng)物即為體細胞胚；(3)把步驟(2)得到的體細胞胚切散后，轉(zhuǎn)接到下列分化培養(yǎng)基上l/2Ms+l.Omg/L的6-BA+100ml/L的椰子汁+80g/L的香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的鹿糖+6g/L的瓊脂，pH值為5. 2 5. 4 ;在溫度為26 27°C，光照強度為2000 25001x條件下，培養(yǎng)90 120天，每45天更換一次上述分化培養(yǎng)基，直至小苗長出2 3片的伸長葉片，且株高2 3cm吋，即得到分化苗；
(4)把步驟(3)得到的分化苗切去小苗基部黃、褐部分，再轉(zhuǎn)接到下列生根培養(yǎng)基上l/2Ms+0. 5mg/L 的 6-BA+1. Omg/L 的NAA+100ml/L 的椰子汁 +100g/L 的香蕉泥+50g/L 的土泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖+6g/L的瓊脂，pH值為5. 2 5. 4 ’在溫度為26 27。?！庹諒姸葹?000 25001x的條件下，培養(yǎng)至苗高為4 5cm，根長3cm以上，即得種苗； (5)將步驟(4)所得種苗在30%遮明度的自然光下放置7 10天后，用稀釋1000倍的多菌靈溶液浸泡種苗10分鐘后，移栽至下列質(zhì)量比的混合基質(zhì)中蕨根蘭石細樹皮=1:4:1，保持基質(zhì)水分為70 85%，并適當通風，即得到可移栽的文山兜蘭苗。所述步驟(I)的成熟文山兜蘭果實是指在文山兜蘭開花的季節(jié)，待開花后5 7天，選取健康無病植株于無雨的上午10 12點進行授粉自交，自交前I天及自交后I天，停止對植株進行水噴淋，授粉后140 150天，即得飽滿的成熟文山兜蘭果實。所述步驟(I)的滅菌是先用體積濃度為70%的酒精擦拭果實表面，然后用無菌水洗滌3次，再用質(zhì)量濃度為0. 1%的升汞滅菌lOmin，用無菌水洗滌3次，用質(zhì)量濃度為10%的次氯酸鈉浸泡lOmin，最后用無菌水洗滌3次，得滅菌的成熟文山兜蘭果實。所述步驟(2)得到的培養(yǎng)物在解剖鏡下觀察，呈現(xiàn)類似于圓球莖的體細胞胚集合體，并且有芽尖在體細胞胚頂端出現(xiàn)。所述步驟(5)的30%遮明度的自然光是指在自然光下，采用30%遮明度的遮陰網(wǎng)進行遮明，以防光線過強造成葉面灼燒。本發(fā)明優(yōu)點和效果在于通過使用文山兜蘭成熟果實無菌萌發(fā)后獲得的幼胚，采用TDZ促進植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眠，促進種子萌發(fā)，促進愈傷組織生長，對其它的植物激素和生理活性物質(zhì)進行調(diào)節(jié)；并利用液體培養(yǎng)增值速度快的特點，對植物體細胞胚進行快速培養(yǎng)，打破文山兜蘭的增值休眠，提高增值效率及增值時間，使得文山兜蘭組培的增值系數(shù)由原來I倍提高到5倍以上，大大提高了文山兜蘭的繁殖效率，成苗存活率達95%，移栽后成活率達90%以上，對野生文山兜蘭的保護及其他珍稀兜蘭的保護和繁殖提供了科學依據(jù)。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進ー步說明。實施例I
(I)種子萌發(fā)在文山兜蘭開花的5月，待開花后5天，選取健康無病植株于無雨的上午11點進行授粉自交，自交前I天及自交后I天停止對植株進行水噴淋；授粉后150天果子成熟，選擇飽滿的果實作為成熟文山兜蘭果實，把成熟文山兜蘭果實進行下列滅菌用體積比濃度為70%的酒精擦拭果實表面，然后用無菌水洗滌3次，用質(zhì)量濃度為0. 1%的升汞滅菌lOmin，用無菌水洗滌3次,再用質(zhì)量濃度為10%的次氯酸鈉浸泡lOmin，最后用無菌水洗滌3次，切開果實取出種子，接種于下列誘導萌發(fā)培養(yǎng)基中Ms + 2. Omg/L的6_BA + 100ml/L的椰子汁+ 80g/L的新鮮香蕉泥+ 50g/L的土豆泥+ 5g/L的活性炭+ 30g/L的鹿糖+6g/L的瓊脂，PH值為5. 2 ;暗培養(yǎng)至種子萌發(fā)后，轉(zhuǎn)入12001x的弱光下，培養(yǎng)30天，得到幼胚；
(2)體細胞胚的誘導將步驟(I)所得的剛開始膨大萌發(fā)的幼胚轉(zhuǎn)接到下列液體培養(yǎng)基中Ms+2. Omg/L 的 6-BA+O. 5mg/L 的 TDZ+100ml/L 的椰子汁 +80g/L 的新鮮香蕉泥 +50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖，pH值為5. 2，在溫度為27°C，光照強度為12001x，轉(zhuǎn)速為120r/min的條件下培養(yǎng)45天，每15天更換I次液體培養(yǎng)基，然后用無菌篩網(wǎng)過濾出培養(yǎng)物，即得到誘導后的體細胞胚，該培養(yǎng)物在解剖鏡下觀察，呈現(xiàn)類似于圓球莖的體細胞胚集合體，有芽尖在體細胞胚頂端出現(xiàn)；
(3)分化培養(yǎng)把步驟(2)誘導出的體細胞胚切散后轉(zhuǎn)接到下列分化培養(yǎng)基上l/2Ms+l. Omg/L的6-BA+100ml/L的椰子汁+80g/L的新鮮香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖+6g/L的瓊脂，pH值為5. 3，在溫度為26°C，光照強度為20001x條件下，培養(yǎng)100天，每45天更換一次分化培養(yǎng)基，直至小苗長有2片伸長葉片、株高2cm吋，即得到分化苗； (4)生根培養(yǎng)把步驟(3)得到的分化苗切去小苗基部黃、褐部分，轉(zhuǎn)接到下列生根培養(yǎng)基上l/2Ms+0. 5mg/L的6-BA+l. Omg/L的NAA+100ml/L的椰子汁+100g/L的新鮮香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖+6g/L的瓊脂，pH值為5. 4，在溫度為27°C，光照強度為20001x的條件下，培養(yǎng)至苗高為4cm，根長3cm以上，即得種苗；
(5)煉苗毎年3月后，將步驟(4)所得種苗置于自然光下10天，并采用30%遮明度的遮陰網(wǎng)進行遮明，以防治光線過強造成葉面灼燒，然后使用稀釋1000倍的多菌靈溶液浸泡種苗10分鐘，以洗凈種苗后，移栽至下列質(zhì)量比的混合基質(zhì)中蕨根蘭石細樹皮=1:4:1，保持基質(zhì)的水分為80%，并適當通風，即得到可移栽的文山兜蘭苗，移栽后成活率達90%。實施例2
(1)種子萌發(fā)在文山兜蘭開花的5月，待開花后6天，選取健康無病植株于無雨的上午10點進行授粉自交，自交前I天及自交后I天不對植株進行水噴淋；授粉后150天果子成熟，選擇飽滿的果實作為成熟文山兜蘭果實，把成熟文山兜蘭果實進行滅菌，用體積比濃度為70%的酒精擦拭果實表面，然后依次用無菌水洗滌3次、質(zhì)量比濃度為0. 1%的升汞滅菌lOmin、無菌水洗滌3次,再用質(zhì)量比濃度為10%的次氯酸鈉浸泡lOmin，最后用無菌水洗滌3次，切開果實取出種子，接種于下列誘導萌發(fā)培養(yǎng)基中Ms + 2. 0mg/L的6_BA + 100ml/L的椰子汁+ 80g/L的新鮮香蕉泥+ 50g/L的土豆泥+ 5g/L的活性炭+ 30g/L的鹿糖+6g/L的瓊脂，PH值為5. 4 ;暗培養(yǎng)至種子萌發(fā)后，轉(zhuǎn)入IOOOIx的弱光下，培養(yǎng)35天，得到幼胚；
(2)體細胞胚的誘導將步驟(I)所得的剛開始膨大萌發(fā)的幼胚轉(zhuǎn)接到下列液體培養(yǎng)基中Ms+2. 0mg/L 的 6-BA+O. 5mg/L 的 TDZ+100ml/L 的椰子汁 +80g/L 的新鮮香蕉泥 +50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖，pH值為5. 3，在溫度為26°C，光照強度為lOOOlx，轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床下培養(yǎng)40天,姆15天更換I次液體培養(yǎng)基，然后用無菌篩網(wǎng)過濾出培養(yǎng)物，即得到誘導后的體細胞胚，該培養(yǎng)物在解剖鏡下觀察，呈現(xiàn)類似于圓球莖的體細胞胚集合體，有芽尖在體細胞胚頂端出現(xiàn)；
(3)分化培養(yǎng)把步驟(2)誘導出的體細胞胚切散后轉(zhuǎn)接到下列分化培養(yǎng)基上l/2Ms+l. 0mg/L的6-BA+100ml/L的椰子汁+80g/L的新鮮香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖+6g/L的瓊脂，pH值為5. 2，在溫度為27°C，光照強度為25001x條件下，培養(yǎng)90天，每45天更換一次分化培養(yǎng)基，直至小苗長有2片以上伸長葉片、株高2cm以上時，即得到分化苗；
(4)生根培養(yǎng)把步驟(3)得到的分化苗切去小苗基部黃、褐部分，轉(zhuǎn)接到下列生根培養(yǎng)基上l/2Ms+0. 5mg/L的6-BA+l. Omg/L的NAA+100ml/L的椰子汁+100g/L的新鮮香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖+6g/L的瓊脂，pH值為5. 2，在溫度為26°C，光照強度為25001x的條件下，培養(yǎng)至苗高為4. 5cm，根長3cm以上，即得種苗；
(5)煉苗毎年3月后，將步驟(4)所得種苗置于自然光下10天，并采用30%遮明度的遮陰網(wǎng)進行遮明，以防治光線過強造成葉面灼燒，然后使用稀釋1000倍的多菌靈溶液浸泡種苗10分鐘，以洗凈種苗后，移栽至下列質(zhì)量比的混合基質(zhì)中蕨根蘭石細樹皮=1:4:1，保持基質(zhì)的水分為80%，并適當通風，即得到可移栽的 文山兜蘭苗，移栽后成活率達90%。實施例3
(1)種子萌發(fā)在5月文山兜蘭開花的季節(jié)，待開花后7天，選取健康無病植株于無雨的上午2點進行授粉自交，自交前I天及自交后I天不對植株進行水噴淋；授粉后150天果子成熟，選擇飽滿的果實作為成熟文山兜蘭果實，把成熟文山兜蘭果實進行滅菌，用體積比濃度為70%的酒精擦拭果實表面，然后依次用無菌水洗滌3次、質(zhì)量比濃度為0. 1%的升汞滅菌lOmin、無菌水洗滌3次,再用質(zhì)量比濃度為10%的次氯酸鈉浸泡lOmin，最后用無菌水洗滌3次，切開果實取出種子，接種于下列誘導萌發(fā)培養(yǎng)基中Ms + 2. 0mg/L的6-BA +100ml/L的椰子汁+ 80g/L的新鮮香蕉泥+ 50g/L的土豆泥+ 5g/L的活性炭+ 30g/L的鹿糖+6g/L的瓊脂，pH值為5. 3 ;暗培養(yǎng)至種子萌發(fā)后，轉(zhuǎn)入15001x的弱光下，培養(yǎng)25天，得到幼胚；
(2)體細胞胚的誘導將步驟(I)所得的剛開始膨大萌發(fā)的幼胚轉(zhuǎn)接到下列液體培養(yǎng)基中Ms+2. 0mg/L 的 6-BA+O. 5mg/L 的 TDZ+100ml/L 的椰子汁 +80g/L 的新鮮香蕉泥 +50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖，pH值為5. 4，在溫度為26°C，光照強度為15001x，轉(zhuǎn)速為120r/min的搖床下培養(yǎng)50天,姆15天更換I次液體培養(yǎng)基，然后用無菌篩網(wǎng)過濾出培養(yǎng)物，即得到誘導后的體細胞胚，該培養(yǎng)物在解剖鏡下觀察，呈現(xiàn)類似于圓球莖的體細胞胚集合體，有芽尖在體細胞胚頂端出現(xiàn)；
(3)分化培養(yǎng)把步驟(2)誘導出的體細胞胚切散后轉(zhuǎn)接到下列分化培養(yǎng)基上l/2Ms+l. 0mg/L的6-BA+100ml/L的椰子汁+80g/L的新鮮香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖+6g/L的瓊脂，pH值為5. 4，在溫度為27°C，光照強度為22001x條件下，培養(yǎng)100天，每45天更換一次分化培養(yǎng)基，直至小苗長有2片以上伸長葉片、株高2cm以上時，即得到分化苗；
(4)生根培養(yǎng)把步驟(3)得到的分化苗切去小苗基部黃、褐部分，再轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為l/2Ms+0. 5mg/L的6-BA+l. 0mg/L的NAA+100ml/L的椰子汁+100g/L的新鮮香蕉+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的鹿糖+6g/L的瓊脂，pH值為5. 3，在溫度為27°C，光照強度為22001x的條件下，培養(yǎng)至苗高為5cm，根長3cm以上，即得種苗；
(5)煉苗毎年3月后，將步驟(4)所得種苗置于自然光下10天，并采用30%遮明度的遮陰網(wǎng)進行遮明，以防治光線過強造成葉面灼燒，然后使用稀釋1000倍的多菌靈溶液浸泡種苗10分鐘，以洗凈種苗后，移栽至下列質(zhì)量比的混合基質(zhì)中蕨根蘭石細樹皮=1:4:1，保持基質(zhì)的水分為80%，并適當通風，即得到可移栽的文山 兜蘭苗，移栽后成活率達90%。
權(quán)利要求
1.一種利用體細胞胚繁育文山兜蘭苗的方法，其特征在于經(jīng)過下列各步驟 (1)把成熟文山兜蘭果實滅菌后，切開果實取出種子，接種于下列誘導萌發(fā)培養(yǎng)基中Ms + 2. Omg/L 的 6-BA + 100ml/L 的椰子汁 + 80g/L 的香蕉泥+ 50g/L 的土豆泥+ 5g/L的活性炭+ 30g/L的蔗糖+6g/L的瓊脂，pH值為5. 2 5. 4 ;暗培養(yǎng)至種子萌發(fā)后，轉(zhuǎn)入1000 15001X的弱光下，培養(yǎng)30天，得到幼胚； (2)將步驟(I)得到的幼胚轉(zhuǎn)接到下列液體培養(yǎng)基中Ms+2.Omg/L的6-BA+O. 5mg/L的TDZ+100ml/L的椰子汁+80g/L的香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的鹿糖，pH值為5. 2 5. 4 ;在溫度為26 27°C，光照強度為1000 15001x，轉(zhuǎn)速為120 150r/min的條件下，培養(yǎng)45天，每15天更換一次上述液體培養(yǎng)基，過濾分離出的培養(yǎng)物即為體細胞胚； (3)把步驟(2)得到的體細胞胚切散后，轉(zhuǎn)接到下列分化培養(yǎng)基上l/2Ms+l.0mg/L的6-BA+100ml/L的椰子汁+80g/L的香蕉泥+50g/L的土豆泥+5g/L的活性炭+30g/L的鹿糖+6g/L的瓊脂，pH值為5. 2 5. 4 ;在溫度為26 27°C，光照強度為2000 25001x條件下，培養(yǎng)90 120天，每45天更換一次上述分化培養(yǎng)基，直至小苗長出2 3片的伸長葉片，且株高2 3cm時，即得到分化苗； (4)把步驟(3)得到的分化苗切去小苗基部黃、褐部分，再轉(zhuǎn)接到下列生根培養(yǎng)基上l/2Ms+0. 5mg/L 的 6-BA+1. 0mg/L 的 NAA+100ml/L 的椰子汁 +100g/L 的香蕉泥+50g/L 的土泥+5g/L的活性炭+30g/L的蔗糖+6g/L的瓊脂，pH值為5. 2 5. 4 ’在溫度為26 27°C，光照強度為2000 25001x的條件下，培養(yǎng)至苗高為4 5cm，根長3cm以上，即得種苗； (5)將步驟(4)所得種苗在30%遮陰度的自然光下放置7 10天后，用稀釋1000倍的多菌靈溶液浸泡種苗10分鐘后，移栽至下列質(zhì)量比的混合基質(zhì)中蕨根蘭石細樹皮=1:4:1，保持基質(zhì)的水分為70 85%，并適當通風，即得到可移栽的文山兜蘭苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用體細胞胚繁育文山兜蘭苗的方法，其特征在于所述步驟(I)的滅菌是先用體積濃度為70%的酒精擦拭果實表面，然后用無菌水洗滌3次，再用質(zhì)量濃度為0. 1%的升汞滅菌lOmin，用無菌水洗滌3次,用質(zhì)量濃度為10%的次氯酸鈉浸泡IOmin,最后用無菌水洗漆3次,得滅菌的成熟文山5 蘭果實。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用體細胞胚繁育文山兜蘭苗的方法，經(jīng)過把成熟文山兜蘭果實滅菌后，切開果實取出種子，接種于誘導萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到幼胚，再轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中得到體細胞胚；然后分化培養(yǎng)得到分化苗；再轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，最后煉苗移栽，即得到文山兜蘭苗。本發(fā)明通過使用文山兜蘭成熟果實無菌萌發(fā)后獲得的幼胚，打破芽的休眠，促進種子萌發(fā)，促進愈傷組織生長，對植物體細胞胚進行快速培養(yǎng)，使得文山兜蘭組培增值系數(shù)由原來1倍提高到5倍以上，大大提高了文山兜蘭的繁殖效率，移栽后成活率達90%以上。
文檔編號A01H4/00GK102763598SQ201210291999
公開日2012年11月7日 申請日期2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月16日
發(fā)明者唐路瑤, 張顥, 李涵, 王繼華, 瞿素萍, 蔣亞蓮, 蔡艷飛, 陳敏 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所