專利名稱：巫山淫羊藿的組培快繁方法和繁育的巫山淫羊藿的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬中藥材栽培技術(shù)領(lǐng)域，涉及巫山淫羊藿繁育方法，特別涉及巫山淫羊藿的組培快繁方法。
背景技術(shù)：
巫山淫羊藿Epimedium wushanense Τ· S. Ying為小檗科淫羊藿屬多年生宿根性草本藥用植物，為《中華人民共和國藥典》2010年版一部所載品種。以其干燥的葉入藥，有補腎陽，強筋骨，祛風(fēng)濕的功效，且具有改善心血管系統(tǒng)，調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和抗骨質(zhì)疏松等生理活性。巫山淫羊藿藥材原料主要依靠野生資源，隨著國內(nèi)外對其需求量的不斷增大，巫山淫羊藿野生資源遭到嚴(yán)重破壞，不能滿足國內(nèi)外市場的需求。目前淫羊藿的繁殖方式主要有通過地下根莖的無性繁殖及種子繁殖(有性繁殖)，淫羊藿種子存在明顯的休眠現(xiàn)象，繁殖發(fā)芽率低，且生長緩慢，生產(chǎn)上大多采用分株繁殖。人們期待有一種能夠以低成本、高繁殖率、和/或繁殖周期短的方法來繁育和栽培巫山淫羊藿，以滿足越來越大的巫山淫羊藿藥用需求，并保護(hù)野生藥用資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能夠以低成本、高繁殖率、和/或繁殖周期短的方法來繁育和栽培巫山淫羊藿。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)以巫山淫羊藿種子為繁育材料，使用特定的培養(yǎng)條件，可以有利地實現(xiàn)上述有關(guān)巫山淫羊藿繁育中的一個或多個方面的要求。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。為此，本發(fā)明第一方面涉及一種巫山淫羊藿的組培快繁方法，包括以下步驟Α.外植體層積處理將巫山淫羊藿種子消毒后于O 10°C低溫沙藏層積處理；B.外植體消毒將層積處理后的種子進(jìn)行消毒處理，再用無菌鑷子將種胚剝出， 備用;C.初代誘導(dǎo)將消毒后的種胚接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使種胚誘導(dǎo)愈傷組織而分化出不定芽，或者使種胚直接誘導(dǎo)出芽；D.繼代增殖將步驟C中所得芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，生成組培叢芽；E.再生植株誘導(dǎo)生根將步驟D誘導(dǎo)分化的I 4cm長的健康的芽叢長成的小植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)以形成白色須根，進(jìn)而形成完整植株。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟A中，所述消毒是如下方式處理將種子用流水沖洗，于酒精中浸泡，再在HgCl2中浸泡,再用無菌水沖洗。在一個實施方案中，步驟 A中，所述消毒是如下方式處理流水沖洗15-30min(例如約30min)，于45-75% (例如約 75% )酒精中浸泡10-60s (例如約30s)，再在O. 1-0. 5% (例如約O. 5%)的HgCl2中浸泡 2-8min (例如約6min),無菌水沖洗2_6次(例如約5次)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟A中，所述低溫沙藏層積處理是如下方式處理使種子與河沙按I : 2 5的比例混合，保持含水量50 70%，經(jīng)3 8°C低溫沙藏層積處理75 120天。由此處理的種子可以打破種子的休眠。在一個實施方案中，所述河沙是經(jīng)高溫滅菌l_5h(例如約2h)后再冷卻至室溫的河沙。在一個實施方案中，所述種子與河沙按I : (1-5)，例如約I : 3的比例混合。在一個實施方案中，所述種子與河沙按
I 3的比例混合，保持含水量40-70% (例如約60%)。在一個實施方案中，所述種子與河沙按I : 3的比例混合，保持含水量60 %，經(jīng)2-5°C低溫沙藏層積處理60-100天(例如約90天)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟B中，所述消毒是先用酒精消毒，接著用 HgCl2消毒。在一個實施方案中，步驟B中，將層積處理結(jié)束后的種子洗去河沙，于45-75% (例如約75% )酒精中浸泡10-60s (例如約30s)，無菌水沖洗2_6次(例如約5次)，再用 O. 1-0. 5% (例如約O. 5% )的HgCl2消毒2-8min(例如約6min)，無菌水沖洗2_6次(例如約5次)。在一個實施方案中，步驟B中，用灼燒冷卻后的鑷子和解剖刀將種胚輕輕剝出， 無菌濾紙吸干水分后，備用于下一處理步驟。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟C中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是包含MS+2， 4-D2mg/L+IBA 2mg/L+NAA O. 5mg/L+蔗糖 30g/L+0. 6%瓊脂的培養(yǎng)基，或者是包含 MS+6-BA lmg/L+NAA O. 5mg/L+IBA lmg/L+蔗糖 30g/L+0. 6 % 瓊脂的培養(yǎng)基，或者是包含 MS+IBA 2mg/L+6-BA O. 5mg/L+蔗糖30g/L+0. 6%瓊脂的培養(yǎng)基。在一個實施方案中，步驟C中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是包含 MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA O. 5mg/L+蔗糖 30g/L+0. 6%瓊脂的培養(yǎng)基，以及包含 MS+6-BA lmg/L+NAA O. 5mg/L+IBA lmg/L+ 蔗糖 30g/L+0. 6%瓊脂的培養(yǎng)基；或者是包含MS+IBA 2mg/L+6-BA O. 5mg/L+蔗糖30g/L+0. 6%瓊脂的培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟C的初代誘導(dǎo)是如下處理的將消毒后的種胚接種于包含 MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA O. 5mg/L+蔗糖 30g/L+0. 6 % 瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生愈傷組織，接著在包含MS+6-BA lmg/L+NAA O. 5mg/L+IBAlmg/L+蔗糖30g/L+0. 6%瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分化出不定芽；或者，將消毒后的種胚接種于包含MS+IBA 2mg/L+6-BA O. 5mg/L+蔗糖30g/L+0. 6%瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直接誘導(dǎo)出芽。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟D中，所述增殖培養(yǎng)基是包含 MS+6-BA1. Omg/L+NAA O. 5mg/L+蔗糖30g/L+0. 6%瓊脂的培養(yǎng)基。在一個實施方案中，在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的時間為20 60天，優(yōu)選25 45天，例如約30天。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟E中，所述生根培養(yǎng)基是包含 1/2MS+0. INAAmg/L 的培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中各步驟中使用的培養(yǎng)基的pH值為pH5. O 7. 0， 優(yōu)選ρΗ5· 5 6. 5，更優(yōu)選ρΗ5· 8。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中各步驟中使用的MS培養(yǎng)基中各自獨立地添加 30g/L蔗糖和O. 6%瓊脂。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中各步驟中使用的培養(yǎng)基經(jīng)100-130°C (例如約 121。。),0. 1-0. 5Mpa(例如約 O. IMpa)高溫滅菌 15_25min(例如約 25min)處理。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中各步驟中使用培養(yǎng)基培養(yǎng)的條件是溫度20 30°C，光照強度1500 30001x，光照8 15h/d。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中各步驟中使用培養(yǎng)基培養(yǎng)的條件是溫度25±2°C，光照強度20001x，光照12h/d。
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根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其包括以下步驟A.外植體層積處理將巫山淫羊藿種子，流水沖洗，消毒后于O 10°C低溫沙藏層積處理；B.外植體消毒將層積處理后的種子，先用酒精浸泡，再用升汞浸泡，無菌水沖洗干凈，用無菌鑷子將種胚剝出，備用；C.初代誘導(dǎo)將消毒后的種胚接種于包含MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/ L+NAAO. 5mg/L+蔗糖30g/L+0. 6 %瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生愈傷組織，接著在包含 MS+6-BA lmg/L+NAA O. 5mg/L+IBA lmg/L+蔗糖 30g/L+0. 6%瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分化出不定芽；或者，將消毒后的種胚接種于包含MS+IBA 2mg/L+6-BA O. 5mg/L+蔗糖30g/ L+0. 6%瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直接誘導(dǎo)出芽；D.繼代增殖將步驟C中所得芽轉(zhuǎn)入包含MS+6-BA I. Omg/L+NAA O. 5mg/L+蔗糖 30g/L+0. 6%瓊脂的增殖培養(yǎng)基中，生成組培叢芽；E.再生植株誘導(dǎo)生根將誘導(dǎo)分化的I 4cm長的健康的芽叢長成的小植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，I個月后形成白色須根，進(jìn)而形成完整植株。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中各步驟中，在進(jìn)行培養(yǎng)時，其培養(yǎng)的時間以及培養(yǎng)的程度可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)經(jīng)驗以及操作的具體條件來確定，而不作特別的限定。例如，在本發(fā)明步驟C中，種胚接種于包含MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA0. 5mg/ L+蔗糖30g/L+0. 6%瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)I個月左右，將會產(chǎn)生愈傷組織；接著在包含 MS+6-BA lmg/L+NAA O. 5mg/L+IBA lmg/L+蔗糖 30g/L+0. 6%瓊脂的培養(yǎng)基中培養(yǎng) I 個月左右會分化出不定芽。本發(fā)明第二方面涉及一種巫山淫羊藿株植，其是由組培快繁方法繁殖得到的。根據(jù)本發(fā)明第二方面的巫山淫羊藿的株植，其是由本發(fā)明第一方面任一實施方案所述組培快繁方法繁殖得到的。在一個實施方案中，所述巫山淫羊藿的株植是由本發(fā)明第一方面任一實施方案所述步驟A、B、C、D和E的處理過程經(jīng)組培快繁方法繁殖得到的。本發(fā)明第三方面涉及一種巫山淫羊藿的芽，其是由組培快繁方法繁殖得到的。根據(jù)本發(fā)明第三方面的巫山淫羊藿的芽，其是由本發(fā)明第一方面任一實施方案所述組培快繁方法繁殖得到的。在一個實施方案中，所述巫山淫羊藿的株植是由本發(fā)明第一方面任一實施方案所述步驟A、B、C和D的處理過程經(jīng)組培快繁方法繁殖得到的。本發(fā)明第四方面涉及一種巫山淫羊藿的愈傷組織，其是由組培快繁方法繁殖得到的。根據(jù)本發(fā)明第四方面的巫山淫羊藿的愈傷組織，其是由本發(fā)明第一方面任一實施方案所述組培快繁方法繁殖得到的。在一個實施方案中，所述巫山淫羊藿的株植是由本發(fā)明第一方面任一實施方案所述步驟A、B和C的處理過程經(jīng)組培快繁方法繁殖得到的。本發(fā)明第一方面任一實施方案中的任一技術(shù)特征同樣適用于任一其它實施方案， 只要這種適用不會出現(xiàn)矛盾。下面對本發(fā)明方法進(jìn)一步詳細(xì)描述將有助于對本發(fā)明的了解。在本發(fā)明中，MS或者M(jìn)S培養(yǎng)基，是Murashige和Skoog于1962年為煙草細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計的(并因此簡稱為MS培養(yǎng)基)，其特點是無機鹽和離子濃度較高，是較穩(wěn)定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養(yǎng)分的數(shù)量和比例合適，能滿足植物細(xì)胞的營養(yǎng)和生理需要，因而適用范圍比較廣，多數(shù)植物組織培養(yǎng)快速繁殖用它作為培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基。本發(fā)明使用的培養(yǎng)基或其中加入的添加劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)已有知識可以獲得的，或者可以直接從市場上購得。例如MS培養(yǎng)基可以直接以商品方式購得。在本發(fā)明中，如未另外說明，提及MS培養(yǎng)基是添加了 6g/L瓊脂和30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基，如果以MS+6g/L瓊脂 +30g/L蔗糖等類似方式提及的培養(yǎng)基，亦是指添加了 6g/L瓊脂和30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基。在本發(fā)明中，2，4-D指的是2，4- 二氯苯氧乙酸在本發(fā)明中，6-BA指的是6-芐基腺嘌呤在本發(fā)明中，IBA指的是吲哚丁酸在本發(fā)明中，NAA指的是α -萘乙酸本發(fā)明提供了一種巫山淫羊藿的組培快繁方法。本發(fā)明方法可以縮短培養(yǎng)時間， 擴大繁殖系數(shù)，保證種苗數(shù)量和質(zhì)量，最終解決種苗的生產(chǎn)及供應(yīng)問題，對實現(xiàn)巫山淫羊藿的可持續(xù)利用具有重要意義。本發(fā)明的目的在于提供一種巫山淫羊藿的組培快繁方法，使巫山淫羊藿成熟種子的種胚在MS培養(yǎng)基上I個月后誘導(dǎo)出愈傷組織，兩個月后分化出芽，4個月后生根長成完整植株。本發(fā)明所提供的巫山淫羊藿的組培快繁方法，包括Α.外植體選擇及處理將采集到的巫山淫羊藿種子，去除雜質(zhì)和不飽滿顆粒，流水沖洗30min，于75%酒精中浸泡30s，再在O. I % HgCl2中浸泡6min，無菌水沖洗5次后與經(jīng)高溫滅菌2h冷卻至室溫的河沙按I : 3的比例混合，保持含水量60%，經(jīng)5°C低溫層積處理90天打破種子休眠。B.外植體消毒將層積處理結(jié)束后的種子洗去河沙，于75%酒精中浸泡30s，無菌水沖洗5次，再用O. I % HgCl2消毒6min，無菌水沖洗5次，用灼燒冷卻后的鑷子和解剖刀將種胚輕輕剝出，無菌濾紙吸干水分后，備用。C.初代誘導(dǎo)將經(jīng)步驟B處理所得種胚接入初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為MS分別附加 6g/L 瓊脂，30g/L 蔗糖，pH5.8，溫度(25±2) °C，光強 20001x，光照 12h/d。在 MS+2， 4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA O. 5mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)I個月后愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)63. 3% ; 在MS+6-BA lmg/L+NAA O. 5mg/L+IBA lmg/L的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)I月后愈傷組織分化率可達(dá)73. 8 %?；蛘?，將經(jīng)步驟B處理所得種胚接入到MS+IBA 2mg/L+6-BA0. 5mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)I 2月后芽誘導(dǎo)率可達(dá)77.8%。D.繼代增殖將步驟C中愈傷組織分化的不定芽或直接誘導(dǎo)的芽叢分瓶，轉(zhuǎn)接到繼代增殖培養(yǎng)基中，I個月后在MS+6-BA I. Omg/L+NAA O. 5mg/L的增殖培養(yǎng)基上芽的增殖系數(shù)可達(dá)2. 17。E.再生植株誘導(dǎo)生根將誘導(dǎo)分化的I 4cm長的健康的芽叢長成的小植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基1/2MS+0. INAAmg/L中，I個月后形成白色須根，根系數(shù)一般在2 5條。本申請還請求保護(hù)根據(jù)上述巫山淫羊藿的組培快繁方法獲得的巫山淫羊藿愈傷組織、芽及植株，其特征是選擇巫山淫羊藿成熟種子的種胚為外植體，在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng) I個月后誘導(dǎo)出愈傷組織，再過I個月分化出不定芽，也可不經(jīng)過愈傷組織途徑直接誘導(dǎo)出芽，然后轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)生根形成完整植株。本申請還請求保護(hù)一種巫山淫羊藿的組培快繁方法得到的巫山淫羊藿植株,其特征是先誘導(dǎo)出白色或綠色致密、堅實且生長旺盛的愈傷組織再分化成芽，或直接誘導(dǎo)出芽，然后誘導(dǎo)生根形成完整植株。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明誘導(dǎo)種胚產(chǎn)生愈傷組織分化出不定芽，愈傷組織分化不定芽的過程，不需要更換培養(yǎng)基配方，分化率達(dá)73.8%，且種胚可以直接誘導(dǎo)出不定芽， 大大縮短了不定芽的誘導(dǎo)過程。本發(fā)明可以提高巫山淫羊藿的繁殖系數(shù)，縮短繁殖周期，且方法簡單，成本較低，適宜于生產(chǎn)應(yīng)用。


圖I顯示了成熟種子縱切后的種胚外植體的照片，圖中標(biāo)尺表示O. 5mm。圖2顯示了培養(yǎng)10天后外植體邊緣長出綠色、白色的瘤狀組織的照片，圖中標(biāo)尺表不1 mm η圖3顯示了培養(yǎng)I個月后外植體形成的白色光滑，致密的愈傷組織的照片，圖中標(biāo)尺表不Imm0圖4顯示了培養(yǎng)2個月后愈傷組織分化出不定芽的照片，圖中標(biāo)尺表示5_。圖5顯示了芽增殖后形成的叢生芽的照片。圖6顯示了生根形成完整植株的照片。
具體實施例方式實施例I :巫山淫羊藿種子處理及種胚的誘導(dǎo)試驗一、外植體選擇及處理將采集到的巫山淫羊藿種子，去除雜質(zhì)和不飽滿顆粒，流水沖洗30min，于75%酒精中浸泡30s，再在O. 1% HgCl2中浸泡6min，無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸干水分后與經(jīng)121°C、0. IMpa高溫滅菌2h后冷卻至室溫的河沙按I : 3的比例混合均勻，保持含水量60%，經(jīng)5°C低溫層積處理90天打破種子休眠。二、外植體消毒將層積處理結(jié)束后的種子洗去河沙，于75%酒精中浸泡30s，無菌水沖洗5次,再用O. I % HgCl2消毒6min,無菌水沖洗5 6次,無菌濾紙吸干水分后,用灼燒冷卻后的鑷子和解剖刀將種胚輕輕剝出，無菌濾紙吸干水分后，備用。三、初代誘導(dǎo)I.愈傷組織的誘導(dǎo)及分化將步驟二所得種胚接種于添加6g/L瓊脂和30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中還任選地添加了 2，4-D、6-BA、NAA、IBA四者之一或者任意兩種或更多種的組合以及它們的不同濃度的添加劑。各培養(yǎng)基PH5. 8，并且經(jīng)121°C、0. IMpa高溫滅菌25min處理。培養(yǎng)溫度(25±2) °C，光照強度20001x，光照12h/d。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)巫山淫羊藿愈傷組織產(chǎn)生的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA O. 5mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)63. 3% ;愈傷組織分化的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA lmg/L+NAA O. 5mg/L+IBA lmg/L，分化率達(dá)73. 8%。其它組成的培養(yǎng)基在愈傷組織誘導(dǎo)率和愈傷組織分化率均在40%以下。2.芽的誘導(dǎo)將步驟二所得種胚接種于不同濃度2，4-D(l、2、4、6mg/L)、IBA(O. 5、l、2、4mg/L) 分別與6-BA (O. 5、lmg/L)自由組合的MS培養(yǎng)基上。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在MS+IBA2mg/L+6_BA O. 5mg/L培養(yǎng)基上芽的誘導(dǎo)率最高，為77. 8%，而其它組合的培養(yǎng)基上芽的誘導(dǎo)率均在
845%以下。四.繼代增殖將步驟三所得叢生芽長至2cm左右再分割成2 3個芽的芽叢接種到MS添加不同濃度的6-BA(0. l、l、10mg/L)和NAA(O. 5mg/L)組合的培養(yǎng)基中進(jìn)行芽的增殖，以不加激素處理作為對照，結(jié)果表明，MS+6-BA I. Omg/L+NAA O. 5mg/L為芽的增殖培養(yǎng)基，既可以使芽生長健壯，增殖速度適當(dāng)，并保持較高增殖倍數(shù)，增殖系數(shù)達(dá)2. 17。其它組合的培養(yǎng)基在增殖系數(shù)方面遠(yuǎn)低于以上包含MS+6-BA I. Omg/L+NAA O. 5mg/L的增殖培養(yǎng)基所得的結(jié)果。五·再生植株誘導(dǎo)生根將誘導(dǎo)分化的I 4cm長的健康的芽叢長成的無根苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基 1/2MS+0. INAAmg/L中進(jìn)行生根培養(yǎng)，I個月后芽的基部逐漸長出白色的須根，根數(shù)一般在 2 5條。以上結(jié)果表明，巫山淫羊藿種胚愈傷組織誘導(dǎo)和分化的最適培養(yǎng)基分別為MS+2， 4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA O. 5mg/L、MS+6-BA lmg/L+NAA 0. 5mg/L+IBAlmg/L，誘導(dǎo)率和分化率分別達(dá)63. 3%,73. 8%;芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+IBA2mg/L+6-BA O. 5mg/L，誘導(dǎo)率達(dá) 77.8% ;芽增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA I. 0mg/L+NAA0. 5mg/L，增殖系數(shù)為2. 17 ;生根培養(yǎng)基為 1/2MS+0. INAAmg/Lο實施例2 :組培快繁方法培育巫山淫羊藿A.外植體選擇及處理將采集到的巫山淫羊藿種子，去除雜質(zhì)和不飽滿顆粒，流水沖洗30min，于75%酒精中浸泡30s，再在O. 1% HgCl2中浸泡6min，無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸干水分后與經(jīng)121 °C，O. IMpa高溫滅菌2h冷卻至室溫的河沙按I : 3的比例混合均勻，保持含水量60%，經(jīng)5°C低溫層積處理90天打破種子休眠。B.外植體消毒將層積處理結(jié)束后的種子洗去河沙，于75%酒精中浸泡30s，無菌水沖洗5次,再用O. I % HgCl2消毒6min,無菌水沖洗5 6次,無菌濾紙吸干水分后,用灼燒冷卻后的鑷子和解剖刀將種胚輕輕剝出，無菌濾紙吸干水分后，備用。C.初代誘導(dǎo)將經(jīng)步驟B處理所得種胚接入初代培養(yǎng)基，I個月后MS+2，4_D2mg/ L+IBA 2mg/L+NAA O. 5mg/L 培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá) 63. 3% ;MS+6_BAlmg/L+NAA O. 5mg/ L+IBA lmg/L培養(yǎng)基上愈傷組織分化率達(dá)73. 8% ；MS+IBA2mg/L+6-BA O. 5mg/L培養(yǎng)基上芽誘導(dǎo)率達(dá)77.8%。D.繼代增殖將步驟C中愈傷組織分化的不定芽及直接誘導(dǎo)的芽叢分瓶，轉(zhuǎn)接到繼代增殖培養(yǎng)基中，I個月后增殖系數(shù)為2. 17。E.再生植株誘導(dǎo)生根將誘導(dǎo)分化的I 4cm長的健康的芽叢長成的小植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，I個月后形成白色須根，根系數(shù)一般在2 5條。
權(quán)利要求
1.巫山淫羊藿的組培快繁方法，包括以下步驟A.外植體層積處理將巫山淫羊藿種子消毒后于O 10°C低溫沙藏層積處理；B.外植體消毒將層積處理后的種子進(jìn)行消毒處理，再用無菌鑷子將種胚剝出，備用；C.初代誘導(dǎo)將消毒后的種胚接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使種胚誘導(dǎo)愈傷組織而分化出不定芽，或者使種胚直接誘導(dǎo)出芽；D.繼代增殖將步驟C中所得芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，生成組培叢芽；E.再生植株誘導(dǎo)生根將步驟D誘導(dǎo)分化的I 4cm長的健康的芽叢長成的小植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)以形成白色須根，進(jìn)而形成完整植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟A中，所述消毒是如下方式處理流水沖洗 15-30min，于45-75%酒精中浸泡30s，再在O. 1% -O. 5% HgCl2中浸泡2_8min，無菌水沖洗2-6 次。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟A中，所述低溫沙藏層積處理是如下方式處理使種子與河沙按I : 2 5的比例混合，保持含水量50 70%，經(jīng)3 8°C低溫沙藏層積處理75 120天。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟B中，所述消毒是先用酒精消毒，接著用HgCl2消毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其特征在于步驟C中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是包含MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA O. 5mg/L+蔗糖 30g/L+0.6%瓊脂的培養(yǎng)基，或者是包含 MS+6-BA lmg/L+NAA O. 5mg/L+IBA lmg/L+蔗糖 30g/L+0. 6%瓊脂的培養(yǎng)基，或者是包含 MS+IBA 2mg/L+6-BA O. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+0. 6%瓊脂的培養(yǎng)基；步驟D中，所述增殖培養(yǎng)基是包含MS+6-BA I. Omg/L+NAA O. 5mg/L+蔗糖30g/L+0. 6% 瓊脂的培養(yǎng)基；和/或步驟E中，所述生根培養(yǎng)基是包含1/2MS+0. INAAmg/L的培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中步驟C中，初代誘導(dǎo)是如下處理的將消毒后的種胚接種于包含 MS+2，4-D 2mg/L+IBA 2mg/L+NAA O. 5mg/L+蔗糖 30g/L+0. 6 %瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生愈傷組織，接著在包含MS+6-BA lmg/L+NAA O. 5mg/L+IBAlmg/L+蔗糖 30g/L+0. 6%瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分化出不定芽；或者，將消毒后的種胚接種于包含 MS+IBA 2mg/L+6-BA O. 5mg/L+蔗糖30g/L+0. 6 %瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直接誘導(dǎo)出芽。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6任一項所述的方法，其包括以下步驟A.外植體層積處理將巫山淫羊藿種子，流水沖洗，消毒后于O 10°C低溫沙藏層積處理；B.外植體消毒將層積處理后的種子，先用酒精浸泡，再用升汞浸泡，無菌水沖洗干凈，用無菌鑷子將種胚剝出，備用；C.初代誘導(dǎo)將消毒后的種胚接種于包含MS+2，4-D2mg/L+IBA 2mg/L+NAA0. 5mg/ L+蔗糖30g/L+0. 6%瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生愈傷組織，接著在包含MS+6-BA Img/ L+NAA O. 5mg/L+IBA lmg/L+蔗糖30g/L+0. 6%瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分化出不定芽； 或者，將消毒后的種胚接種于包含MS+IBA 2mg/L+6-BA O. 5mg/L+蔗糖30g/L+0. 6%瓊脂的2誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直接誘導(dǎo)出芽；D.繼代增殖將步驟C中所得芽轉(zhuǎn)入包含MS+6-BAI. Omg/L+NAA O. 5mg/L+蔗糖30g/ L+0. 6%瓊脂的增殖培養(yǎng)基中，生成組培叢芽；E.再生植株誘導(dǎo)生根將誘導(dǎo)分化的I 4cm長的健康的芽叢長成的小植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，I個月后形成白色須根，進(jìn)而形成完整植株。
8.—種巫山淫羊藿株植，其是由權(quán)利要求I至7任一項所述的方法繁殖得到的。
9.一種巫山淫羊藿的芽，其是由權(quán)利要求I至7任一項所述的方法繁殖得到的。
10.一種巫山淫羊藿的愈傷組織，其是由權(quán)利要求I至7任一項所述的方法繁殖得到的。
全文摘要
本發(fā)明涉及巫山淫羊藿的組培快繁方法和繁育的巫山淫羊藿。該方法包括以下步驟A.將巫山淫羊藿種子消毒后于0～10℃低溫沙藏層積處理；B.將層積處理后的種子進(jìn)行消毒處理，再用無菌鑷子將種胚剝出，備用；C.將消毒后的種胚接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使種胚誘導(dǎo)愈傷組織而分化出不定芽，或者使種胚直接誘導(dǎo)出芽；D.將步驟C中所得芽轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基中，生成組培叢芽；E.將步驟D誘導(dǎo)分化的芽叢長成的小植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)以形成白色須根，進(jìn)而形成完整植株。該方法可以提高巫山淫羊藿的繁殖系數(shù)，縮短繁殖周期，對于保護(hù)野生巫山淫羊藿資源，促進(jìn)其可持續(xù)利用及產(chǎn)業(yè)化具有重要價值。
文檔編號A01H4/00GK102577959SQ20121004545
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月27日
發(fā)明者劉作易, 周寧, 周海琴, 朱國勝, 楊相波, 賀勇, 郭巧生 申請人:貴州同濟(jì)堂制藥有限公司