專利名稱：一種高抗性淀粉含量水稻的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高抗性淀粉含量水稻的培育方法。
背景技術(shù)：
據(jù)衛(wèi)生部的統(tǒng)計(jì)，2010年我國(guó)糖尿病患者約9200萬(wàn)人，占我國(guó)總?cè)丝诘?. 3%，耐糖量低人群更是高達(dá)1. 42億人。糖尿病等血液系統(tǒng)慢性疾病正在呈現(xiàn)出快速增長(zhǎng)、向農(nóng)村蔓延、低齡化的演變趨勢(shì)，越來(lái)越嚴(yán)重地影響著人類社會(huì)的生存和發(fā)展(第一大生命殺手，嚴(yán)重影響生命質(zhì)量，年醫(yī)療費(fèi)用高達(dá)千億元)，而且目前尚無(wú)根治之法。醫(yī)學(xué)研究表明除遺傳因素外，糖尿病等血液系統(tǒng)慢性疾病主要起因于日常飲食起居等生活習(xí)慣，而高糖、高脂肪、高蛋白的飲食結(jié)構(gòu)則是罪魁禍?zhǔn)?，尤其是高糖這一“元兇”。稻米主食“高糖”的核心在于可消化淀粉的比例過(guò)高(導(dǎo)致貪食、肥胖和高血糖)，而抗性淀粉的比例過(guò)低(目前一般秈稻米的抗性淀粉含量?jī)H為1%，粳稻的含量?jī)H有0. 1%，而達(dá)到現(xiàn)代人健康需求的含量應(yīng)為10%)。因此，依照我國(guó)傳統(tǒng)“藥食同源”、“寓藥于食”的理念，預(yù)防糖尿病等高危慢性病的發(fā)生，改進(jìn)病患者生活質(zhì)量的重要途徑是改善一日三餐的大米營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成，而培育滿足人們健康需求的美味口感與功能性水稻品種則是這一途徑的根本。高抗性淀粉含量專用水稻品種選育與開發(fā)是吃出健康的關(guān)鍵和核心?？剐缘矸鄣男纬?，不僅與水稻本身的直連淀粉含量有關(guān)，且與支鏈淀粉的鏈長(zhǎng)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。淀粉去分支酶基因ISA是調(diào)控淀粉合成的關(guān)鍵酶，可以優(yōu)化支鏈淀粉鏈長(zhǎng)的精細(xì)結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)顯著提高抗性淀粉的含量。正是在上述背景下，本發(fā)明提出一種高抗性淀粉含量水稻的培育方法，旨在選用中等直鏈淀粉含量秈稻為基礎(chǔ)，通過(guò)淀粉去分支酶基因優(yōu)化調(diào)控支鏈淀粉的鏈長(zhǎng)結(jié)構(gòu)，培育獲得高抗性淀粉含量水稻，用于糖尿病專用產(chǎn)品的開發(fā)，這對(duì)糖尿病人群實(shí)施飲食療法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高抗性淀粉含量水稻的培育方法，以獲得高抗性淀粉含量水稻，用于糖尿病專用產(chǎn)品的開發(fā)，實(shí)施飲食療法從源頭預(yù)防和控制糖尿病。本發(fā)明的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，包括以下步驟
1)取直鏈淀粉含量20% 25%水稻品種的成熟胚為外植體，接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在25 士 1°C、光強(qiáng)3000勒克司光條件下誘導(dǎo)形成愈傷組織；
2)將誘導(dǎo)形成2周的愈傷組織，轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)至愈傷組織進(jìn)入成倍增
殖期；
3)將成倍增殖的愈傷組織，在25士1°C避光的黑暗條件下進(jìn)行受體愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)
2天；
4)將經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織，在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡10分鐘，之后棄去菌液，用無(wú)菌濾紙吸干，接種于共培養(yǎng)基上，在25士 1°C避光的黑暗條件下共培養(yǎng)2天；
5)將上述共培養(yǎng)愈傷組織，洗凈、晾干后，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基，在25士1°C避光的黑暗條件下培養(yǎng)6周，收集新長(zhǎng)出的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)移至新的篩選培養(yǎng)基上，再進(jìn)行連續(xù)2輪繼代篩選，每隔3周轉(zhuǎn)繼1次；
6)取3輪篩選后的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基，在25士1°C、光強(qiáng)3000勒克司光條件下誘導(dǎo)分化成苗，對(duì)抗性植株進(jìn)行組織化學(xué)染色和分子檢測(cè)，選留含目的基因插入序列的轉(zhuǎn)基因植株，所說(shuō)的目的基因插入序列是指目的基因淀粉分支酶基因ISA1、標(biāo)記基因葡糖苷酸酶基因GUS和篩選基因抗潮霉素基因HPT的插入序列，目的基因淀粉分支酶基因ISAl 片段長(zhǎng) 570bp ；
7)取入選的轉(zhuǎn)基因植株，田間種植后收獲種子，測(cè)定抗性淀粉含量，選留抗性淀粉含量高于10%的轉(zhuǎn)基因植株；
8)繼續(xù)種植步驟7)篩選的轉(zhuǎn)基因株系，評(píng)價(jià)抗性淀粉含量的表達(dá)穩(wěn)定性，繁殖抗性淀粉含量穩(wěn)定高于10%的優(yōu)良株系，為培育的高抗性淀粉含量水稻。本發(fā)明中，所說(shuō)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D1. 5mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5.8。本發(fā)明中，所說(shuō)的繼代培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D Img蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH 滅菌前 5. 8。本發(fā)明中，所說(shuō)的共培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D 0. 5mg、乙酰丁香酮lmg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g, pH滅菌前5. 8。本發(fā)明中，所說(shuō)的篩選培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D 0. 5mg、潮霉素30mg、羧卞300 mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5. 8。本發(fā)明中，所說(shuō)的分化培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加6-BAlmg、NAA0. 5mg、KT0. 5mg、羧卞200mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH滅菌前5. 8。上述的 N6 基本培養(yǎng)基為 KNO3 2830mg, (NH4)2SO4 463mg、CaCl2 · 2H20 166mg、MgSO4 · 7H20 185mg、KH2PO4 400mg、MnSO4 · 4H20 4. 4mg、ZnSO4 · 7H20 1. 5mg、FeS04 · 7H2027. 8mg、Na2-EDTA · 2H20 37. 3mg、H3B03 1. 6mg、肌醇 lOOmg、煙酸 0. 5mg、維生素 B6 0. 5mg、維生素Bl 0. 5mg和甘氨酸ang。本發(fā)明中，所說(shuō)的農(nóng)桿菌的菌株為EHA105，內(nèi)含質(zhì)粒pCAM1305，pCAM1305的T-DNA區(qū)域攜帶目的基因插入序列，包括目的基因淀粉分支酶基因ISA1、標(biāo)記基因葡糖苷酸酶基因GUS和篩選基因抗潮霉素基因HPT。目的基因淀粉分支酶基因ISAl片段長(zhǎng)570bp，與玉米啟動(dòng)子W^i-I和nos終止子共同構(gòu)成表達(dá)框架。菌株為EHAlO方便購(gòu)買或贈(zèng)送獲得，在一般植物遺傳實(shí)驗(yàn)室均有保存，參見(jiàn)文獻(xiàn)吳關(guān)庭等，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38 (12) :2395-2402.上述的標(biāo)記基因葡糖苷酸酶基因⑶S的組織化學(xué)染色方法參見(jiàn)Rueb和Hensgens.Rice Genetics Newsletters, 1989，(6): 168-169，篩選基因抗潮霉素基因 HPT 的分子檢測(cè)方法參見(jiàn)文獻(xiàn)吳關(guān)庭等，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38 (12) :2395-對(duì)02。本發(fā)明中，所說(shuō)的抗性淀粉含量檢測(cè)方法，參見(jiàn)文獻(xiàn)楊朝柱等，中國(guó)水稻科學(xué)，2005，19 (6): 516-520。上述的穩(wěn)定性是指入選水稻中抗性淀粉含量在不同年份間(2年以上)、季節(jié)間(2季以上)以及地點(diǎn)間(2個(gè)地點(diǎn)以上)的含量變化不顯著。
本發(fā)明的高抗性淀粉含量水稻，具有以下優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明首先利用ISA轉(zhuǎn)基因，優(yōu)化調(diào)控直鏈淀粉含量209Γ25%水稻的支鏈淀粉的鏈長(zhǎng)結(jié)構(gòu)，培育出高抗性淀粉含量水稻。高抗性淀粉含量水稻可用于糖尿病專用產(chǎn)品的開發(fā)，對(duì)糖尿病人群實(shí)施飲食療法具有重要意義。


圖1是本發(fā)明所用的目的基因ISA插入序列的載體構(gòu)建示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)具體實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1
以取直鏈淀粉含量24. 5%水稻品種“浙恢7%4”的成熟胚為外植體，接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在25士 1°C、光強(qiáng)3000勒克斯光條件下誘導(dǎo)形成愈傷組織；
取誘導(dǎo)形成2周的愈傷組織，轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)至愈傷組織進(jìn)入成倍增殖
期；
取成倍增殖的愈傷組織，在25士 1°C、避光的黑暗條件下進(jìn)行受體愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)2
天；
取經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織(約300個(gè)培養(yǎng)皿，含1500塊以上的愈傷組織)，在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡10分鐘，之后棄去菌液，用無(wú)菌濾紙吸干，接種于共培養(yǎng)基上，在25士 1 °C、避光的黑暗條件下共培養(yǎng)2天；
取上述共培養(yǎng)愈傷組織，洗凈、晾干后，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基，在25士 1°C、避光的黑暗條件下培養(yǎng)6周，收集新長(zhǎng)出的抗性愈傷組織(約160塊愈傷組織)，轉(zhuǎn)移至新的篩選培養(yǎng)基上，再進(jìn)行連續(xù)2輪繼代篩選，每隔3周轉(zhuǎn)繼1次；
取3輪篩選后的抗性愈傷組織(約40塊愈傷組織)，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基，在25士 1°C、光強(qiáng)3000勒克斯光條件下誘導(dǎo)分化成苗69株，對(duì)抗性植株進(jìn)行標(biāo)記基因GUS組織化學(xué)染色和篩選基因HPT分子檢測(cè)，選留含目的基因ISAl插入序列的轉(zhuǎn)基因植株69株，目的基因插入序列的載體構(gòu)建如圖1所示。取入選的轉(zhuǎn)基因植株，田間種植后收獲種子，進(jìn)行抗性淀粉含量檢測(cè)，選留抗性淀粉含量高于10%的轉(zhuǎn)基因植株16株；繼續(xù)種植轉(zhuǎn)基因株系；
2008-2010連續(xù)3年，分別在浙江杭州(春季)、浙江富陽(yáng)(夏季)、海南陵水(冬季)三地三季評(píng)價(jià)抗性淀粉含量的表達(dá)穩(wěn)定性，繁殖抗性淀粉含量穩(wěn)定高于10%的優(yōu)良株系，最終培育高抗性淀粉含量水稻5個(gè)，T-RS-U T-RS-2、T-RS-3、T-RS-4、T-RS-5，其抗性淀粉含量分別為10. 5%、11· 2%、12· 7%、14· 1%、19· 5%，而原中等直鏈淀粉含量水稻品種“浙恢7954”的抗性淀粉含量分別為0. 9%。
權(quán)利要求
1.一種高抗性淀粉含量水稻的培育方法，包括以下步驟1)取直鏈淀粉含量20% 25%水稻品種的成熟胚為外植體，接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在25 士 1°C、光強(qiáng)3000勒克司光條件下誘導(dǎo)形成愈傷組織；2)將誘導(dǎo)形成2周的愈傷組織，轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)至愈傷組織進(jìn)入成倍增殖期；3)將成倍增殖的愈傷組織，在25士1°C避光的黑暗條件下進(jìn)行受體愈傷組織的預(yù)培養(yǎng)2天；4)將經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織，在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡10分鐘，之后棄去菌液，用無(wú)菌濾紙吸干，接種于共培養(yǎng)基上，在25士 1°C避光的黑暗條件下共培養(yǎng)2天；5)將上述共培養(yǎng)愈傷組織，洗凈、晾干后，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基，在25士1°C避光的黑暗條件下培養(yǎng)6周，收集新長(zhǎng)出的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)移至新的篩選培養(yǎng)基上，再進(jìn)行連續(xù)2輪繼代篩選，每隔3周轉(zhuǎn)繼1次；6)取3輪篩選后的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基，在25士1°C、光強(qiáng)3000勒克司光條件下誘導(dǎo)分化成苗，對(duì)抗性植株進(jìn)行組織化學(xué)染色和分子檢測(cè)，選留含目的基因插入序列的轉(zhuǎn)基因植株，所說(shuō)的目的基因插入序列是指目的基因淀粉分支酶基因ISA1、標(biāo)記基因葡糖苷酸酶基因GUS和篩選基因抗潮霉素基因HPT的插入序列，目的基因淀粉分支酶基因ISAl 片段長(zhǎng) 570bp ；7)取入選的轉(zhuǎn)基因植株，田間種植后收獲種子，測(cè)定抗性淀粉含量，選留抗性淀粉含量高于10%的轉(zhuǎn)基因植株；8)繼續(xù)種植步驟7)篩選的轉(zhuǎn)基因株系，評(píng)價(jià)抗性淀粉含量的表達(dá)穩(wěn)定性，繁殖抗性淀粉含量穩(wěn)定高于10%的優(yōu)良株系，為培育的高抗性淀粉含量水稻。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所說(shuō)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D1. 5mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g, pH滅菌前5. 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所說(shuō)的繼代培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D lmg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g, pH滅菌前5. 8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所說(shuō)的共培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D 0. 5mg、乙酰丁香酮lmg、蔗糖30g、和瓊脂粉6. 8g, pH滅菌前5. 8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所說(shuō)的篩選培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加2，4-D 0. 5mg、潮霉素30mg、羧卞300 mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g，pH 滅菌前 5. 8。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所說(shuō)的分化培養(yǎng)基為N6基本培養(yǎng)基添加6-BAlmg、NAAO. 5mg、KTO. 5mg、羧卞200mg、蔗糖30g和瓊脂粉6. 8g, pH 滅菌前 5. 8。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6所述的高抗性淀粉含量水稻的培育方法，其特征在于所說(shuō)的N6 基本培養(yǎng)基為 KNO3 2830mg, (NH4)2SO4 463mg、CaCl2 · 2H20 166mg、MgSO4 · 7H20 185mg、KH2PO4 400mg、MnSO4 · 4H20 4. 4mg、ZnSO4 · 7H20 1. 5mg、FeSO4 · 7H20 27. 8mg, Na2-EDTA · 2H2037. 3mg,H3BO3 1. 6mg、肌醇 lOOmg、煙酸 0. 5mg、維生素 B6 0. 5mg、維生素 Bl 0. 5mg 和甘氨酸2mg。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高抗性淀粉含量水稻的培育方法，步驟包括取直鏈淀粉含量20%～25%水稻品種的成熟胚為外植體，誘導(dǎo)愈傷組織，繼代培養(yǎng)至成倍增殖期，暗條件預(yù)培養(yǎng)，進(jìn)行農(nóng)桿菌共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基進(jìn)行3輪篩選，取抗性愈傷組織誘導(dǎo)分化成苗，對(duì)抗性植株進(jìn)行標(biāo)記基因組織化學(xué)染色和篩選基因分子檢測(cè)，鑒定含目的基因ISA1插入序列的分化小苗，對(duì)入選的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗性淀粉含量檢測(cè)，選留抗性淀粉含量高于10%的轉(zhuǎn)基因植株，繼續(xù)種植評(píng)價(jià)抗性淀粉含量的表達(dá)穩(wěn)定性，繁殖抗性淀粉含量穩(wěn)定高于10%的優(yōu)良株系，最終培育出高抗性淀粉含量水稻。本發(fā)明的高抗性淀粉水稻，可用于糖尿病專用產(chǎn)品的開發(fā)，對(duì)糖尿病人群實(shí)施飲食療法具有重要意義。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102550415SQ20121000510
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者吳殿星, 張寧, 徐開盛, 舒小麗 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)