產(chǎn)生單克隆植物細(xì)胞系的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種由植物細(xì)胞的異種群體產(chǎn)生單克隆植物細(xì)胞系的方法，其包含下列步驟：（a）提供植物細(xì)胞的異種群體；（b）由該植物細(xì)胞的異種群體制備原生質(zhì)體；（c）通過(guò)將原生質(zhì)體制備物進(jìn)行流式細(xì)胞分選而分離單一原生質(zhì)體；（d）在飼養(yǎng)細(xì)胞材料存在的情況下，通過(guò)共培養(yǎng)使分離的單一轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體再生直到形成小集落；（e）將小集落從飼養(yǎng)細(xì)胞材料中轉(zhuǎn)移，并培養(yǎng)小集落直到形成單克隆植物細(xì)胞系。
【專(zhuān)利說(shuō)明】產(chǎn)生單克隆植物細(xì)胞系的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】。具體而言，本發(fā)明涉及通過(guò)流式細(xì)胞分選由植物細(xì)胞的異質(zhì)性群體產(chǎn)生天然(野生型)或轉(zhuǎn)基因單克隆植物細(xì)胞系。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言明顯的是，本發(fā)明也包含使用該單克隆植物細(xì)胞系再生整株可育性植株。
【背景技術(shù)】
[0002]在過(guò)去數(shù)十年間，已將許多工作投注于建立并培養(yǎng)以植物為基礎(chǔ)的系統(tǒng)，以用于積聚和獲取天然或異種蛋白質(zhì)與次級(jí)代謝產(chǎn)物。文獻(xiàn)提供了大量的證據(jù)性材料來(lái)證明以植物為基礎(chǔ)的系統(tǒng)的實(shí)用性，即、生產(chǎn)多種所希望的物質(zhì)，該物質(zhì)被分泌至培養(yǎng)基或從生產(chǎn)細(xì)胞、組織、細(xì)胞器或甚至于整株植物或其部分分離。同樣地，存在有廣泛的確保建立穩(wěn)定或暫時(shí)轉(zhuǎn)化的植物材料的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)報(bào)告(transformation protocol)。但是,還需要可靠、相對(duì)低成本并且快速的技術(shù)，以從植物細(xì)胞獲得高產(chǎn)量的所要產(chǎn)物。
[0003]已重復(fù)報(bào)導(dǎo)，植物細(xì)胞群(諸如植物懸浮培養(yǎng)物)的轉(zhuǎn)化通常會(huì)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物顯示細(xì)胞具有高度異質(zhì)性(混合型)與目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)水平不一致，所述目標(biāo)蛋白質(zhì)與初級(jí)異質(zhì)性細(xì)胞群中的表觀(guān)基因不同的細(xì)胞混合物有夫。在重組細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)基因表達(dá)的異質(zhì)性證實(shí)生產(chǎn)率方面的嚴(yán)重問(wèn)題。
[0004]主要問(wèn)題為在轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中通常罕見(jiàn)高產(chǎn)克隆，而且要建立同源性高產(chǎn)細(xì)胞系相當(dāng)耗時(shí)。因此，仍存在著的技術(shù)挑戰(zhàn)為從剛轉(zhuǎn)化或已轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物培養(yǎng)物中生產(chǎn)與回收優(yōu)異的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。
[0005]關(guān)于流式細(xì)胞分選(flow cytometric sorting)(諸如FACS (突光激活細(xì)胞分選)應(yīng)用)，必須通過(guò)細(xì)胞的酶消化而釋放出原生質(zhì)體，從而自通常聚集在一起的植物細(xì)胞群或培養(yǎng)物取得単一球形細(xì)胞。但是，對(duì)于大部分的植物品種來(lái)說(shuō)，単一原生質(zhì)體的再生會(huì)受限于必須維持某一群體密度。
[0006]迄今，并未描述過(guò)ー種用于再生單ー轉(zhuǎn)基因細(xì)胞/原生質(zhì)體或用于自其(特別是在流式細(xì)胞分選之后)再生完整可育性植株的可靠且可再現(xiàn)的エ序。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]因此，本發(fā)明主要是涉及提供ー種以植物為基礎(chǔ)的系統(tǒng)，其利用由植物細(xì)胞的異質(zhì)性(混合型)群體(諸如懸浮培養(yǎng)物)產(chǎn)生的未轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)基因的單克隆植物細(xì)胞系，以產(chǎn)生高水平的所期望的天然或重組產(chǎn)物，并且克服現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題，尤其是關(guān)于快速分離以及接下來(lái)再生単一(轉(zhuǎn)基因)原生質(zhì)體，直到形成可用來(lái)建立單克隆植物細(xì)胞系的小集落(microcolony),所述單克隆植物細(xì)胞系優(yōu)選能夠生產(chǎn)并積聚大量的期望產(chǎn)物。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言清楚的是，本發(fā)明同樣提供由已建立的單克隆植物細(xì)胞系再生而來(lái)的完整可育性植株。
[0008]相對(duì)于許多目前使用及開(kāi)發(fā)的基于使用完整植株或至少完整并已分化的植物組織的系統(tǒng)，使用懸浮 細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)在于，同源性材料在受控、無(wú)菌與所限制的條件下可再現(xiàn)地生產(chǎn)。
[0009]在植物中，目前有兩種主要的生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的策略，即:(i)產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物或懸浮細(xì)胞系；或(ii)在用細(xì)菌(例如土壤桿菌)、病毒(例如煙草鑲嵌病毒、馬鈴薯病毒X/Y、豇豆花葉病毒與許多其他病毒)或兩者組合(例如優(yōu)化的侵染(magnifection))侵染植物表達(dá)宿主(植物、組織或細(xì)胞)，使得宿主能夠表達(dá)異種遺傳信息(DNA或RNA)后，異質(zhì)性基因瞬時(shí)表達(dá)。另外且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，基因信息亦可通過(guò)已建立的機(jī)械方法(例如電穿孔或激光打孔)而引入植物表達(dá)宿主。
[0010]盡管本發(fā)明優(yōu)選涉及被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞材料的應(yīng)用，但是本發(fā)明方法中也可以涉及用于瞬時(shí)表達(dá)的系統(tǒng)，其具有快速優(yōu)勢(shì)(基因產(chǎn)物、上市時(shí)間、緊急反應(yīng))以及達(dá)到比穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物或其部分(諸如細(xì)胞)高得多的積聚水平的可能性。
[0011]依據(jù)本發(fā)明，提供ー種由植物細(xì)胞的異質(zhì)性群體產(chǎn)生天然(野生型、非轉(zhuǎn)化)或轉(zhuǎn)基因單克隆植物細(xì)胞系的方法。該方法包括:首先提供該植物細(xì)胞群，例如形成源植物細(xì)胞(source plant cell)材料的植物懸浮細(xì)胞,所述源植物細(xì)胞材料可進(jìn)行如本發(fā)明的方法所包括的后續(xù)步驟。通常，此植物細(xì)胞材料可容易地來(lái)源于例如異質(zhì)性植物懸浮培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物優(yōu)選在受控及/或無(wú)菌條件下培養(yǎng)。源細(xì)胞可以是(穩(wěn)定地/瞬時(shí)地)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或野生型(天然、未經(jīng)轉(zhuǎn)化)細(xì)胞，其能夠生產(chǎn)并積聚期望產(chǎn)物。
[0012]由于本發(fā)明方法使用流式細(xì)胞分選(諸如FACS技術(shù))來(lái)分離或離析單ー的、即個(gè)體化的原生質(zhì)體，這些原生質(zhì)體必須使用本領(lǐng)域已知的材料與方法由上面提供的植物細(xì)胞群制備。依據(jù)優(yōu)選實(shí)施例，這些原生質(zhì)體經(jīng)轉(zhuǎn)化且能夠:(i)生產(chǎn)熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)或多肽；(ii)生產(chǎn)期望產(chǎn)物；以及/或者(iii)在篩選劑存在的情況下存活。流式細(xì)胞分選的優(yōu)選分選標(biāo)準(zhǔn)是作為如定性特征(例如細(xì)胞凋亡)的標(biāo)記的細(xì)胞顆粒度與細(xì)胞大小。FACS的優(yōu)選分選標(biāo)準(zhǔn)可以選自 包含遺傳背景(例如倍性、非整倍性)、突變轉(zhuǎn)基因(mutantstransgenics)、基因互換產(chǎn)物(gene exchange products)與突光(例如自發(fā)突光(葉綠體、代謝物)、熒光蛋白質(zhì)或酶介導(dǎo)的熒光)的組。應(yīng)了解，使用篩選劑不是必需的。因此，原生質(zhì)體不是必需地被賦予適當(dāng)抗性的核酸序列轉(zhuǎn)化。
[0013]在利用流式細(xì)胞分選(諸如FACS)分離或離析單(轉(zhuǎn)化)原生質(zhì)體后，通過(guò)在飼養(yǎng)細(xì)胞材料存在情況下進(jìn)行共培養(yǎng)，從而再生各個(gè)單ー的被轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，直到形成小集落(小愈傷組織)。植物源的來(lái)源并未受到限制，但局限于原生質(zhì)體具有再生直到形成小集落或小愈傷組織的潛力的細(xì)胞系、植物品種與物種。因此，本發(fā)明可應(yīng)用于所有再生體系(regeneration protocol)已建立或?qū)⒃谖磥?lái)提供的植物品種與物種。關(guān)于本發(fā)明涉及的將單克隆小集落或植物細(xì)胞系進(jìn)ー步再生為完整可育性植株的特征，應(yīng)了解此特征可在所有再生系統(tǒng)已建立或?qū)⒃谖磥?lái)提供的植物品種與物種中進(jìn)行。
[0014]之后，從飼養(yǎng)細(xì)胞材料中分離或轉(zhuǎn)移小集落，并對(duì)該小集落進(jìn)行培養(yǎng)，直到形成單克隆植物細(xì)胞系。
[0015]依據(jù)優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明方法所包括的下一個(gè)步驟關(guān)于通過(guò)如下步驟產(chǎn)生單克隆愈傷組織:(i )將小集落或小愈傷組織轉(zhuǎn)移至固體培育培養(yǎng)基；以及(ii )在至少ー篩選劑存在情況下培養(yǎng)小集落或小愈傷組織直到形成轉(zhuǎn)基因愈傷組織，通過(guò)將愈傷組織轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基，能夠由該轉(zhuǎn)基因愈傷組織建立轉(zhuǎn)基因單克隆植物細(xì)胞系。如本領(lǐng)域本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，小集落亦可通過(guò)機(jī)械方法(諸如通過(guò)克隆挑取)從飼養(yǎng)細(xì)胞材料轉(zhuǎn)移或分離。在此情況下，不需要篩選劑且由小集落所包含的細(xì)胞不需要顯示出對(duì)任何篩選劑的抗性。
[0016]依據(jù)優(yōu)選實(shí)施例，植物細(xì)胞的異質(zhì)性群體所包含的細(xì)胞是天然(例如野生型)或非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，這些細(xì)胞在進(jìn)行流式細(xì)胞分選之前被至少一種含有至少一個(gè)異種核酸序列(可操作地連接至功能性啟動(dòng)子)的表達(dá)載體穩(wěn)定地或瞬時(shí)地進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中該至少一個(gè)異種核酸序列編碼期望產(chǎn)物。依據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施例，該至少一種表達(dá)載體含有可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)功能性啟動(dòng)子的至少兩個(gè)異種核酸序列，其中該至少兩個(gè)異種核酸序列編碼熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)或多肽以及對(duì)篩選劑的抗性或期望產(chǎn)物。若需要的話(huà)，上述細(xì)胞還可包含編碼如本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)基因單克隆植物細(xì)胞系中積聚的期望產(chǎn)物的異種核酸序列。
[0017]這里使用的術(shù)語(yǔ)“異種”表示，所述的基因/核苷酸序列已通過(guò)使用基因工程(亦即通過(guò)人為干預(yù))引入植物細(xì)胞。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，核苷酸的異種序列可包括由融合伴侶(fusion partner)所組成的融合蛋白的編碼序列，該融合蛋白例如可部分地由可融合至非植物蛋白的植物蛋白形成，所述融合蛋白可以被稱(chēng)為雜交的植物:非植物融合蛋白。可選地，融合蛋白可以是由非植物源的融合伴侶所形成。異種基因可提高內(nèi)源性等效基因(endogenous equivalent gene)對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá),該內(nèi)源性等效基因一般表現(xiàn)相同或類(lèi)似的功能，或者其插入序列是內(nèi)源性基因之外的序列或其他序列。細(xì)胞的核酸異種可以非天然地發(fā)生于所培養(yǎng)的細(xì)胞型、品種或物種中。因此，異種核酸可包括特定類(lèi)型生物體或從其衍生的編碼序列，特定類(lèi)型生物體為諸如植物或哺乳動(dòng)物物種，例如人類(lèi)、綿羊、牛、馬或豬物種，所述異種核酸位于所培養(yǎng)的細(xì)胞(諸如衍生自煙草的BY2細(xì)胞)中。另一可能性為位于所培養(yǎng)的目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)的核酸序列在所培養(yǎng)的目標(biāo)細(xì)胞中，異質(zhì)性核酸或其或其同源物是天然存在，但其中所述核酸序列連接及/或相鄰于在該類(lèi)型、物種或品種的植物的細(xì)胞內(nèi)非天然存在的核酸，該非天然存在的核酸諸如可操作地連接至一或多個(gè)調(diào)控序列(例如啟動(dòng)子序列)以控制表達(dá)。此外，亦可使用合成(人工)核酸序列。
[0018]“載體”定義為，除了其他以外，特別包括任意的雙鏈或單鏈、線(xiàn)形或環(huán)狀形式的質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒載體，其可以是或不是可自身傳遞(transmissible)或移動(dòng)，且其可轉(zhuǎn)化原核生物或真核生物宿主并存在于染色體以外(例如具有復(fù)制原點(diǎn)的自發(fā)復(fù)制質(zhì)粒)。特別包括穿梭載體，其表示一種能夠天然地或通過(guò)設(shè)計(jì)在兩種不同宿主生物中復(fù)制的DNA媒介物，其可選自于放線(xiàn)菌及相關(guān)物種、細(xì)菌以及真核生物(例如高等植物、蘚、哺乳動(dòng)物、酵母菌或真菌)細(xì)胞。
[0019]“表達(dá)載體”是指一種載體，在其中，核酸受控于并可操作地連接至適當(dāng)啟動(dòng)子或其他調(diào)控要素以供在宿主細(xì)胞(諸如微生物或植物細(xì)胞)中的轉(zhuǎn)錄。載體可以是雙功能性表達(dá)載體，其在多種宿主中發(fā)揮作用。在基因組或亞基因組DNA的情況下，可含有其自身的啟動(dòng)子或其他調(diào)控要素，而在cDNA的情況下，可受控于適當(dāng)啟動(dòng)子或其他調(diào)控要素以供在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。
[0020]“啟動(dòng)子”是一種核苷酸序列，可以從其開(kāi)始可操作地連接于下游的DNA (亦即在雙鏈DNA的有義鏈的3’方向)的轉(zhuǎn)錄。
[0021]“可操作地連接”是指作為同一核酸分子的一部分被連接，適當(dāng)定位，并確定從啟動(dòng)子開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的方向。
[0022]術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)型”當(dāng)應(yīng)用于啟動(dòng)子時(shí)應(yīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所充分了解。實(shí)質(zhì)上，在誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子控制下的表達(dá)是響應(yīng)于施加的刺激而“開(kāi)始”或增加。刺激的性質(zhì)會(huì)隨著啟動(dòng)子而不同。在不存在適當(dāng)刺激的情況下，一些誘導(dǎo)型啟動(dòng)子產(chǎn)生微小或無(wú)法檢測(cè)到的表達(dá)水平(或無(wú)表達(dá))。在不存在刺激的情況下，其他誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子會(huì)產(chǎn)生可檢測(cè)到的基本表達(dá)。在不存在刺激的情況下不論表達(dá)水平如何，任何誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的表達(dá)在存在正確刺激的情況下都會(huì)増加。
[0023]本發(fā)明亦包含任何此等序列的變異體的用途。變異體蛋白質(zhì)與上述序列的全部或部分具有同源性、或相同。
[0024]為了重組蛋白質(zhì)的表達(dá)，將含有感興趣蛋白質(zhì)的基因信息的重組土壤桿菌或病毒(載體)的懸浮物以本領(lǐng)域公知的方式施用于上述植物懸浮細(xì)胞。載體侵染植物細(xì)胞并且傳遞基因信息。優(yōu)選地，待轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞材料是以高密度并僅有少量培養(yǎng)基存在的方式提供，使得載體懸浮物可以?xún)H通過(guò)滴落或噴灑而施用。這個(gè)轉(zhuǎn)化的優(yōu)選實(shí)施例在操作、自動(dòng)化、控制(containment)、倍增以及廢料和轉(zhuǎn)移方面有多個(gè)實(shí)用性?xún)?yōu)勢(shì)?？蛇x地,可使用本領(lǐng)域中公知的已知技術(shù)，諸如粒子轟擊、電穿孔等類(lèi)似技木。
[0025]適當(dāng)?shù)膯?dòng)子包括花椰菜花葉病毒35S(CaMV 35S)。啟動(dòng)子可選定具有賦予發(fā)育表達(dá)以及/或者組織特異性調(diào)控表達(dá)的ー個(gè)或多個(gè)序列基元(sequence motif)或要素。
[0026]如已提及的，該至少ー個(gè)可選擇的基因標(biāo)記物(可以是期望要制造的)可包括在構(gòu)建體中或在第二構(gòu)建體中被提供，諸如賦予可選擇的顯型基因標(biāo)記物(諸如對(duì)抗生素或除草劑(包括但不限于例如卡那霉素、潮霉素、草丁膦(phosphinotricin)、氯磺隆、氨甲葉酸、慶大霉素、奇霉素、咪唑啉酮與草甘膦)的抗性)。
[0027]另外，用于制備原生質(zhì)體的植物懸浮細(xì)胞亦可由已轉(zhuǎn)基因的異質(zhì)性植物懸浮培養(yǎng)物(含有轉(zhuǎn)基因細(xì)胞)所提供。
[0028]依據(jù)本發(fā)明所建立的(轉(zhuǎn)基因)單克隆植物細(xì)胞系可在下述條件下進(jìn)行處理或培養(yǎng)以生產(chǎn)重組蛋白或代謝物，所述條件為，除了載體懸浮物以外或取代載體懸浮物，還存在前體、誘導(dǎo)物、激素、穩(wěn)定劑(例如相容性溶質(zhì))、抑制劑、RNAi/siRNA分子、信號(hào)傳導(dǎo)化合物(signaling compound)、酶(例如果膠酶)、及/或激發(fā)子。
[0029]依據(jù)優(yōu)選實(shí)施例，期望產(chǎn)物是選自由異種蛋白質(zhì)或多肽(例如，血液產(chǎn)物、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)激素、治療性/診斷性/エ業(yè)用酶、疫苗、完整抗體(full-size antibody)或各種抗體衍生物)、次級(jí)代謝產(chǎn)物(例如苯丙素、生物堿、萜類(lèi)、醌類(lèi)或類(lèi)固醇)及用于氣體、固體或液體(化學(xué))化合物與物質(zhì)的診斷或分析的標(biāo)記物所組成的組。
[0030]感興趣基因包括編碼本身是天然藥品的蛋白質(zhì)的基因，所述天然藥品諸如為藥物或獸醫(yī)用產(chǎn)品。此外，感興趣基因亦包括任何其他重組蛋白質(zhì)，諸如エ藝酶(technicalenzyme)、毒素或賦予新的農(nóng)藝投入產(chǎn)出性狀(agronomic input and output trait)的重組蛋白質(zhì)。
[0031]異種核酸特別可以使細(xì)菌、真菌、植物或非植物源(諸如上文略有提到的融合蛋白)或動(dòng)物源的基因編碼。所生產(chǎn)的多肽可用于生產(chǎn)可自其中純化以供其他用途的多肽?？稍诒景l(fā)明方法中生產(chǎn)的蛋白質(zhì)包括異源二聚體，諸如FSH、免疫球蛋白、融合抗體與單鏈抗體。此外，可改變上面的基因以生產(chǎn)具有特性發(fā)生改變的蛋白質(zhì)，諸如被改變的glycane結(jié)構(gòu)。但是，本發(fā)明還允許使用合成基因，諸如自然界中不存在的人工序列。
[0032]此等蛋白質(zhì)包括但不限于:視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白質(zhì)、P53、血管生成抑制素(angiostatin)及瘦素(leptin)。同樣地,本發(fā)明方法可用于生產(chǎn)哺乳動(dòng)物調(diào)節(jié)性蛋白質(zhì)。其他感興趣的序列包括蛋白質(zhì)、激素(諸如促卵泡激素)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、血清白蛋白、血紅素、股原蛋白、奇甜蛋白(thaumatin)、奇甜蛋白樣蛋白質(zhì)、表皮生長(zhǎng)因子(諸如VEGF) 等。[0033]如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，本發(fā)明能夠生產(chǎn)多樣化蛋白質(zhì)及多肽，包括與藥劑相關(guān)的(重組)蛋白質(zhì)(諸如疫苗、抗體、治療性酶、過(guò)敏原與低過(guò)敏原、抗微生物肽、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(諸如作為生物相容性涂覆材料的彈力蛋白與膠原蛋白)、病毒樣顆粒、蛋白粒等)、具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的(重組)蛋白質(zhì)(食品與飼料添加物)、用于診斷用途的(重組)蛋白質(zhì)(諸如酶、抗體與工程抗體、其他酶或熒光融合蛋白、用作為陽(yáng)性對(duì)照的抗原、用于蛋白質(zhì)陣列的結(jié)合配體)、與工藝相關(guān)的(重組)蛋白質(zhì)(諸如用于親和吸附劑的結(jié)合配體、高價(jià)值酶、生物催化劑)、以及增進(jìn)農(nóng)藝投入產(chǎn)出性狀的重組蛋白質(zhì)。
[0034]一般而言，異種核酸可以通過(guò)本領(lǐng)域中所用的任何適當(dāng)方法被表達(dá)，或它們可如下轉(zhuǎn)錄或表達(dá):
[0035](i)例如含有可操作地連接至感興趣異種序列的啟動(dòng)子的“裸”DNA的瞬時(shí)表達(dá)，
[0036](ii)表達(dá)載體(諸如復(fù)制載體)的表達(dá)。一般而言,本領(lǐng)域本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠妥善構(gòu)建載體并設(shè)計(jì)用于瞬時(shí)重組基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)?？蛇x擇或構(gòu)建含有適當(dāng)調(diào)控序列的適當(dāng)載體，所述調(diào)控序列包括啟動(dòng)子序列、終止子片段、聚腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因與合適的其他序列。關(guān)于更多細(xì)節(jié)參見(jiàn)，例如Molecular Cloning:a LaboratoryManual: 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press 或Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al, eds., Johnffiley&Sons, 1992。
[0037](iii)非整合載體的表達(dá)。
[0038]應(yīng)了解的是，上述各類(lèi)別并不互不包含，例如因?yàn)榉钦陷d體亦可以是表達(dá)載體
坐寸ο
[0039]如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，編碼熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)或多肽或編碼生產(chǎn)熒光分子的酶和編碼感興趣的異質(zhì)性蛋白質(zhì)(期望產(chǎn)物)的至少兩個(gè)異種核酸序列可以下列形式提供:(i)由同一載體上的單一表達(dá)盒所構(gòu)成的多順?lè)醋訕?gòu)型；(ii)具有同一載體上的至少兩個(gè)不同表達(dá)盒的串接構(gòu)型(tandem configuration);或(:[;[；0不同載體上的至少兩個(gè)不同表達(dá)盒，其中串接構(gòu)型為優(yōu)選。
[0040]因此，依據(jù)又一個(gè)方面，本發(fā)明亦提供一種生產(chǎn)至少一種期望產(chǎn)物的方法，該至少一種期望產(chǎn)物優(yōu)選地是選自由異種蛋白質(zhì)或多肽、次級(jí)代謝產(chǎn)物與標(biāo)記物所組成的組。該方法包含使用如依據(jù)本發(fā)明建立的(轉(zhuǎn)基因)單克隆植物細(xì)胞系來(lái)生產(chǎn)并積聚至少一種期望產(chǎn)物，然后從生產(chǎn)細(xì)胞或從培養(yǎng)基獲得或分離該期望產(chǎn)物。
[0041]因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面中，公開(kāi)了能夠產(chǎn)生編碼期望產(chǎn)物的mRNA的優(yōu)選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的單克隆植物細(xì)胞系的用途，所述期望產(chǎn)物諸如是通過(guò)由引入的核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生的異種目標(biāo)蛋白質(zhì)，該核酸構(gòu)建體包括可操作地連接至啟動(dòng)子的目標(biāo)核苷酸序列。
[0042]因此，“引入的核酸”包括以構(gòu)建體形式提供的異種核酸序列作為DNA序列，所述異種核酸序列能夠產(chǎn)生并累積期望產(chǎn)物。
[0043]因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面中，公開(kāi)一種在單克隆植物細(xì)胞系中異種核苷酸序列達(dá)到穩(wěn)定表達(dá)的方法，該方法包括將至少一種第一核酸序列穩(wěn)定地引入目標(biāo)細(xì)胞的步驟，該第一核酸序列含有編碼期望產(chǎn)物的異種核苷酸序列。[0044]在一個(gè)實(shí)施例中，提供一種產(chǎn)生至少ー種細(xì)胞外異種蛋白質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟:[0045](i)將包括編碼異種蛋白質(zhì)或期望產(chǎn)物的核苷酸序列的第一核酸穩(wěn)定引入至由起始的植物細(xì)胞群體所組成的目標(biāo)細(xì)胞中；[0046](ii)由該植物懸浮培養(yǎng)提供的植物懸浮細(xì)胞制備原生質(zhì)體，其中該原生質(zhì)體被轉(zhuǎn)化且能夠:(a)生產(chǎn)熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)或多肽；以及(b)在篩選劑存在的情況下存活；[0047](iii)通過(guò)將原生質(zhì)體制備物進(jìn)行FACS而分離單ー轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體；[0048](iv)在飼養(yǎng)細(xì)胞材料存在的情況下，通過(guò)共培養(yǎng)而再生分離的單ー轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，直到形成小集落或小愈傷組織；[0049](V)通過(guò)(a)將小集落或小愈傷組織轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基、與(b)在至少ー種篩選劑存在的情況下培養(yǎng)小集落或小愈傷組織直到形成轉(zhuǎn)基因愈傷組織，從而產(chǎn)生單克隆愈傷組織；[0050](vi)通過(guò)將愈傷組織轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基而建立轉(zhuǎn)基因單克隆植物細(xì)胞系；以及[0051](Vii)通過(guò)提供適當(dāng)培養(yǎng)條件而引起或容許由異種蛋白質(zhì)或期望產(chǎn)物的核酸進(jìn)行表達(dá)，以及[0052](viii)自生產(chǎn)細(xì)胞收取積聚的異種蛋白質(zhì)或期望產(chǎn)物。[0053]可通過(guò)完全傳統(tǒng)的方法進(jìn)行分離，并且可以部分或完全純化，或者可以不必部分或完全純化。[0054]當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)知到，在所述構(gòu)建體或各構(gòu)建體中可使用ー個(gè)以上基因?？梢詫⒍鄠€(gè)載體(各載體包括一個(gè)或多個(gè)編碼所選異種蛋白質(zhì)的核苷酸序列)引入如這里或他處所述的目標(biāo)細(xì)胞中。例如,這對(duì)于生產(chǎn)例如酶的多個(gè)亞單元是有益的。[0055]熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)或多肽可以是任何可通過(guò)熒光檢測(cè)到的蛋白質(zhì)，諸如GUS、熒光蛋白質(zhì)(諸如GFP或DsRed)、熒光素酶等。優(yōu)選地，報(bào)導(dǎo)子(reporter)為非侵入性標(biāo)記，諸如DsRed 或 GFP。[0056]依據(jù)另ー個(gè)方面，本發(fā)明提供一種通過(guò)細(xì)胞分選鑒別高表達(dá)插入位點(diǎn)的方法，其包括以下步驟:利用含有熒光蛋白質(zhì)I的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞的步驟(例如，如下面實(shí)施例1B中所迷);以及通過(guò)FACS鑒別并分離單一高熒光蛋白質(zhì)I生產(chǎn)細(xì)胞的步驟，該步驟包括再生直至形成小集落和懸浮培養(yǎng)以及例如與熒光蛋白質(zhì)2基因互換，鑒別與分開(kāi)罕見(jiàn)基因互換產(chǎn)物的步驟。[0057]現(xiàn)將參考下列非限制性的附圖與實(shí)施例來(lái)進(jìn)ー步說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明的其他具體例會(huì)因?yàn)檫@些實(shí)施例而被本領(lǐng)域技術(shù)人員所想到。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0058]圖1為示意圖，其說(shuō)明用于制備如本文所述的轉(zhuǎn)基因MTED BY-2系的表達(dá)盒(expression cassette)的結(jié)構(gòu)。具體而言，圖1說(shuō)明用于轉(zhuǎn)化BY-2懸浮細(xì)胞的pTRAkc::MTED植物表達(dá)載體的T-DNA。[0059]LB與RB =T-DNA的左邊界與右邊界；Pnos與pAnos:胭脂堿合成酶基因(nopalinesynthase gene)的啟動(dòng)子與終止子；nptll:新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的編碼序列；SAR:核骨架附著區(qū)；P35SS與pA35S:花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S基因的具有兩個(gè)增強(qiáng)子的啟動(dòng)子與終止子；CHS:香芹的查爾酮合酶的5’-UTR ；SP:信號(hào)肽；HC與LC:M12抗體的重鏈與輕鏈的編碼序列:TL:煙草蝕紋病毒(TEV)的5，-UTR ；TP:轉(zhuǎn)運(yùn)肽；DsRed:珊瑚(Discosoma spec)的紅色突光蛋白質(zhì)的編碼序列。
【具體實(shí)施方式】
[0060]實(shí)施例1
[0061]在轉(zhuǎn)化后快速產(chǎn)生生產(chǎn)良好的單克隆細(xì)胞系[0062]A.煙草細(xì)胞培養(yǎng)
[0063]在100ml玻璃維形瓶中加入50ml試樣、即煙草BY2 (Nicotiana tabacumcv.Bright Yellow2)的野生型懸浮培養(yǎng)物,將其維持在26°C的黑暗、無(wú)菌條件下，以180rpm進(jìn)行恒定軌道攪拌。培養(yǎng)基含有基礎(chǔ)MSMO培養(yǎng)基(pH5.8)，并補(bǔ)充有蔗糖(3%，w/v)以及l(fā)mg/12, 4- 二氯苯氧こ酸。以7天為間隔通過(guò)將5% (v/v)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50ml新鮮培養(yǎng)基而完成繼代培養(yǎng)。
[0064]關(guān)于原生質(zhì)體制備,通過(guò)將2% (v/v)轉(zhuǎn)移至50ml新鮮培養(yǎng)基來(lái)對(duì)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
[0065]B.加速產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因結(jié)果(event)以供后續(xù)分選
[0066]如A部分中所述培養(yǎng)BY-2野生型懸浮細(xì)胞。同時(shí)，在軌道振動(dòng)器(orbitalshaker)上以160rpm與27°C的條件，將帶有在同一載體上含數(shù)個(gè)表達(dá)盒(參見(jiàn)圖1)的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因根癌土壤桿菌(agrobacterium tumefaciens)在含有適當(dāng)抗生素的YEB培養(yǎng)基(0.5%營(yíng)養(yǎng)肉湯、0.1%酵母菌萃取物、0.5%蛋白胨、0.5%蔗糖、2mM MgS04,pH7.4)中培養(yǎng)，直至OD6tltol為I。繼代培養(yǎng)后3天，在黑暗中將3ml BY-2野生型細(xì)胞、200nMこ酰丁香酮以及150 ill 土壤桿菌(OD6tltlnm=I洪培養(yǎng)于皮氏培養(yǎng)皿中。在室溫下共培養(yǎng)3天后，將BY-2細(xì)胞再懸浮于補(bǔ)充有200mg/l頭孢霉素的IOml的BY-2培養(yǎng)基中。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50ml無(wú)菌試管中并通過(guò)離心法洗滌2次(850g，5分鐘)，以除去土壌桿菌。再懸浮細(xì)胞團(tuán)后，使用補(bǔ)充有頭孢霉素與適當(dāng)篩選劑的20-50ml BY-2培養(yǎng)基，在100ml搖瓶中進(jìn)行被轉(zhuǎn)化的BY-2細(xì)胞的培養(yǎng)(180rpm，26°C)。在適當(dāng)懸浮物(細(xì)胞壓積約為50-60%)再生后，將細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)以供制備原生質(zhì)體(參見(jiàn)C部分)。本方法需要14至21天以建立轉(zhuǎn)基因懸浮培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物可用于隨后產(chǎn)生原生質(zhì)體(C)以及流式細(xì)胞分選(D)。
[0067]C.原牛質(zhì)體制各以及細(xì)朐壁再牛
[0068]在繼代培養(yǎng)3天后，使用活躍生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物，通過(guò)在無(wú)菌錐形塑料離心管中以850g離心5分鐘來(lái)沉淀細(xì)胞。除去上清液并將細(xì)胞再懸浮于含有1% (w/v)纖維素酶與
0.3% (w/v)離析酶的 IOml PNT 消化溶液(3.6g/1Kao Michayluk 基礎(chǔ)鹽(Duchefa)、0.4M蔗糖、0.5mg/l NAAUmg/1 BAP)中。將細(xì)胞-酶懸浮物置于6cm皮式培養(yǎng)皿中，以膠帶密封。在26°C下于黑暗中以輕柔攪拌進(jìn)行徹夜消化(16-18小時(shí))。將原生質(zhì)體濾過(guò)100-1im尼龍網(wǎng)井隨后在離心(104g持續(xù)8分鐘)過(guò)程中漂浮至表面。除去團(tuán)塊與培養(yǎng)基的界面并以PNT溶液洗滌原生質(zhì)體2次。將原生質(zhì)體再懸浮于W5溶液(154mM NaCl、125mM CaCl2,5mM KCl、5mM葡萄糖，pH5.6)中，通過(guò)以76g離心2分鐘沉淀原生質(zhì)體。輕柔地使其再懸浮后，將原生質(zhì)體培養(yǎng)在經(jīng)改良的再生培養(yǎng)基8p2c (參見(jiàn)下表1 ;從8p培養(yǎng)基優(yōu)化而來(lái))中。所述步驟的結(jié)果通常為每毫升7xl05個(gè)原生質(zhì)體，平均74%的比例為有活力的原生質(zhì)體。
[0069]在26°C下于黑暗中使原生質(zhì)體再生3天，開(kāi)始再生細(xì)胞壁。將所得的原生質(zhì)體再次通過(guò)100-μπι尼龍網(wǎng)，然后轉(zhuǎn)移至無(wú)菌樣品導(dǎo)引試管，進(jìn)行FAC分選。單一原生質(zhì)體被分選至含有非轉(zhuǎn)基因野生型飼養(yǎng)原生質(zhì)體或細(xì)胞的96孔微量滴定板的各孔中(參見(jiàn)D部分)。
[0070]使用菲斯-羅森塔兒(Fuchs-Rosenthal)型計(jì)數(shù)板將用作飼養(yǎng)原生質(zhì)體的ΒΥ-2野生型原生質(zhì)體調(diào)整至約2χ103細(xì)胞/ml8p2c培養(yǎng)基。將50微升上述原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移至96孔微量滴定板的各孔中，以使得約100個(gè)野生型飼養(yǎng)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移至各孔中。
[0071]表1:8p2c培養(yǎng)基的組分(ρΗ5.6)
[0072]-Kao&Michayluk 基礎(chǔ)鹽混合物(Duchefa)
[0073]-Kao&Michayluk 維生素溶液(Sigma)
[0074]0.02mg/l對(duì)氨基苯酸
[0075]2mg/l L-抗壞血酸
[0076]0.0 Img/1 生物素
[0077]lmg/1 D-泛酸鈣
[0078]lmg/1氯化膽堿
[0079]0.4mg/l 葉酸
[0080]IOOmg/1 肌醇
[0081]lmg/1 煙酰胺
[0082]lmg/1鹽酸維生素B6
[0083]0.2mg/l 核黃素
[0084]lmg/1鹽酸硫胺素
[0085]0.0 lmg/1 維生素 A
[0086]0.02mg/l 維生素 B12
[0087]0.0 lmg/1 維生素 D
[0088]-有機(jī)酸(使用NH4OH, ρΗ5.5 )
[0089]20mg/l丙酮酸鈉
[0090]40mg/l 蘋(píng)果酸
[0091]40mg/l 檸檬酸
[0092]40mg/l延胡索酸
[0093]-糖與糖醇
[0094]0.25g/l 蔗糖
[0095] 250mg/l 甘露糖
[0096]68.4g/l 葡萄糖
[0097]250mg/l 鼠李糖
[0098]250mg/l 果糖
[0099]250mg/l 纖維二糖
[0100]250mg/l 核糖
[0101]250mg/l 山梨糖醇
[0102]250mg/l 木糖[0103]250mg/l 甘露醇
[0104]-激素
[0105]0.2mg/12.4_D
[0106]0.5mg/l 玉米素
[0107]1.0mg/1 NAA
[0108]-2% (v/v)椰子汁
[0109]_500mg/l酪蛋白氨基酸
[0110]D.流式細(xì)胞分析與分選
[0111]使用具有488nm/635nm 気離子激光的 FACS Vantage (DIVA option, BDBioscience)儀器分選轉(zhuǎn)基因植物原生質(zhì)體。鞘液，即磷酸鹽緩沖溶液(PBS pH7.4)經(jīng)高壓蒸氣滅菌，并通過(guò)0.22 y m過(guò)濾器，從而進(jìn)行滅菌。在分選之前，通過(guò)無(wú)菌鞘液的傳代(passage)來(lái)清除樣品管的殘余こ醇。細(xì)胞計(jì)數(shù)系統(tǒng)/分選設(shè)定是使用商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的自發(fā)熒光校正粒子來(lái)校準(zhǔn)。流式細(xì)胞分選儀在488nm下操作，并且具有175mW的激光輸出。在分選之前，為了定義強(qiáng)烈熒光的群體，電子分選窗基于所收集的原生質(zhì)體培養(yǎng)物樣品的前向散射光、側(cè)向散射光與熒光信號(hào)來(lái)定位。使用DIVA軟件(BD Bioscience)將信號(hào)顯示為點(diǎn)狀圖。分選區(qū)是通過(guò)建立門(mén)(gate)來(lái)進(jìn)行限定，第一個(gè)門(mén)圍繞有活力的原生質(zhì)體的群體，第二個(gè)門(mén)依據(jù)第一個(gè)門(mén)而圍繞強(qiáng)烈熒光的原生質(zhì)體。分選是使用4-6psi的系統(tǒng)鞘壓(systemsheath pressure)、約7kHz的降頻以及約1.000事件數(shù)/秒(events/sec)的樣品流量,通過(guò)200 ii m的流動(dòng)尖端(flow tip)來(lái)進(jìn)行。
[0112]使用所描述的分選參數(shù)，可達(dá)到約20%的平板效率(plating efficientcy)(即，20%的孔含有完整及有活力的單一分選的原生質(zhì)體)。
[0113]E.通過(guò)與看護(hù)/飼養(yǎng)原生質(zhì)體共培養(yǎng)再生單一分選的原生質(zhì)體
[0114]在分選高熒光単一原生質(zhì)體之前，將96孔微量滴定板的各孔填充含有約100個(gè)煙草BY-2野生型原生質(zhì)體作為飼養(yǎng)細(xì)胞的50 Ul無(wú)菌8p2c再生培養(yǎng)基。通過(guò)倒立式熒光顯微鏡在不同時(shí)間點(diǎn)分析單一分選的轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體，以在分選步驟之后確認(rèn)單ー細(xì)胞沉積以及監(jiān)控轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體的増殖與小集落形成(分選14至20天后)。分選的原生質(zhì)體在96孔板中以26°C至27°C在黑暗中培養(yǎng)，將96孔板以無(wú)菌蓋闔上并使用膠帶密封。
[0115]接著，將轉(zhuǎn)基因小集落轉(zhuǎn)移至含有抗生素篩選標(biāo)記(例如卡那霉素)的固體再生培養(yǎng)基(0.8% (w/v)瓊脂)。因此，通過(guò)吸移來(lái)輕柔地再懸浮存在于孔中的含有飼養(yǎng)細(xì)胞的小愈傷組織，并且使用具有寬吸管端的吸管轉(zhuǎn)移。其后，通過(guò)倒立式熒光顯微鏡分析孔以及固體再生培養(yǎng)基上的經(jīng)轉(zhuǎn)移的小愈傷組織，以確認(rèn)成功轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)基因與熒光小集落。在轉(zhuǎn)移之后，使轉(zhuǎn)基因小愈傷組織生長(zhǎng)14至20天，并轉(zhuǎn)移至含有固體再生培養(yǎng)基(具有篩選標(biāo)記)的新鮮板。具有直徑大小約2cm的愈傷組織通過(guò)將細(xì)胞材料轉(zhuǎn)移至50ml塑料組織培養(yǎng)燒瓶中的5ml培養(yǎng)基而被用于建立懸浮培養(yǎng)物(A部分中所述)。如A部分中所述對(duì)這些燒瓶進(jìn)行培養(yǎng)，直到細(xì)胞懸浮物生長(zhǎng)至細(xì)胞壓積約為50至60%，以供轉(zhuǎn)移至100ml錐形瓶?jī)?nèi)。如A部分中所述進(jìn)行轉(zhuǎn)基因單克隆懸浮培養(yǎng)物的培養(yǎng)。
[0116]所述飼養(yǎng)細(xì)胞策略容許約50%最初分選的完整且有活力的單一原生質(zhì)體再生(即，約10%被分選至96孔微量滴定板的孔中的単一原生質(zhì)體發(fā)育成小愈傷組織)。
[0117]F.確認(rèn)在經(jīng)分選的単一原生質(zhì)體再生期間成功排除飼養(yǎng)細(xì)胞存活[0118]已開(kāi)一種發(fā)能夠?qū)我坏腇ACS選擇的原生質(zhì)體可靠地再生成單克隆懸浮培養(yǎng)物的工序。因?yàn)閱我辉|(zhì)體必須在分選之后進(jìn)行再生，所以，需要飼養(yǎng)細(xì)胞支持經(jīng)篩選的單一原生質(zhì)體的再生與增殖。由于飼養(yǎng)原生質(zhì)體暫時(shí)與經(jīng)分選的突光目標(biāo)原生質(zhì)體共培養(yǎng)，故在單克隆培養(yǎng)物再生期間強(qiáng)制排除飼養(yǎng)原生質(zhì)體的存活。
[0119]已研究過(guò)單一經(jīng)分選的轉(zhuǎn)基因BY-2細(xì)胞及熒光BY-2細(xì)胞因?yàn)轱曫B(yǎng)原生質(zhì)體的潛在污染。已使用含有GFP-KDEL表達(dá)盒以及AHAS篩選標(biāo)記(賦予咪唑乙煙酸抗性)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。經(jīng)此構(gòu)建體轉(zhuǎn)化并生產(chǎn)GFP的單一 BY-2原生質(zhì)體被分選至含有轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的原生質(zhì)體的96孔板，其中，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系含有DsRed表達(dá)盒與nptll篩選標(biāo)記(賦予卡那霉素抗性)。在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)DsRed表達(dá)盒與nptll篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)化的單一 BY-2原生質(zhì)體被分選至含有生產(chǎn)GFP的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的原生質(zhì)體的96孔板中。再生后，針對(duì)對(duì)抗咪唑乙煙酸或卡那霉素的抗性及其熒光(綠色對(duì)紅色)，分析所得到的GFP及DsRed熒光培養(yǎng)物。由兩種方法而來(lái)的愈傷組織在含有1.5 μ m咪唑乙煙酸或100mg/L卡那霉素的篩選培養(yǎng)基上平板接種。培養(yǎng)14天后以視覺(jué)評(píng)價(jià)細(xì)胞生長(zhǎng)。所有的被測(cè)試的愈傷組織(總計(jì)20個(gè))特定生長(zhǎng)在含有其特定篩選劑的培養(yǎng)盤(pán)上。簡(jiǎn)言之，經(jīng)GFP/AHAS轉(zhuǎn)化的愈傷組織生長(zhǎng)在含咪唑乙煙酸而非含卡那霉素的板上，而經(jīng)DsRed/卡那霉素轉(zhuǎn)化的愈傷組織僅生長(zhǎng)在卡那霉素板上。這個(gè)觀(guān)察結(jié)果清楚地證明再生的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系未受到個(gè)別飼養(yǎng)細(xì)胞系污染。飼養(yǎng)細(xì)胞的潛在污染另外由流式細(xì)胞分析來(lái)評(píng)價(jià)。針對(duì)分別由熒光蛋白質(zhì)GFP或DsRed所產(chǎn)生的光學(xué)特性，分析再生的GFP及DsRed懸浮培養(yǎng)物。這個(gè)觀(guān)察結(jié)果清楚地證明再生的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系未因?yàn)閭€(gè)別飼養(yǎng)細(xì)胞系而污染。所有測(cè)試的BY-2培養(yǎng)物顯示特定的預(yù)期熒光形態(tài)(pattern)。分選GFP轉(zhuǎn)化的細(xì)胞后所建立的培養(yǎng)物僅顯示綠色熒光，而生產(chǎn)DsRed的培養(yǎng)物僅檢測(cè)到紅色熒光波段。在飼養(yǎng)細(xì)胞污染的情況下，預(yù)期在兩個(gè)波段中有熒光信號(hào)。細(xì)胞分析結(jié)果確認(rèn)如先前抗性試驗(yàn)所證實(shí)的有效率地移除篩選板上的飼養(yǎng)細(xì)胞。
[0120]G.分析單克隆轉(zhuǎn)基因懸浮培養(yǎng)物
[0121]首先分析單克隆懸浮培養(yǎng)物的高度熒光細(xì)胞的百分比。因此，如C部分中所述制備原生質(zhì)體。關(guān)于熒光原生質(zhì)體部分的流式細(xì)胞測(cè)定，使用FACSCalibur儀器(BDBioscience)。依據(jù)BY_2 野生型原生質(zhì)體，調(diào)整設(shè)定參數(shù)(例如光線(xiàn)與熒光散射放大器的放大倍率)并測(cè)量樣品。在圈選有活力群體后，使用此群體在熒光波段中的分布來(lái)設(shè)定閾值，其排除所有由野生型自發(fā)熒光所造成的背景信號(hào)。根據(jù)這個(gè)閾值，計(jì)算出來(lái)源于單一原生質(zhì)體的改良原生質(zhì)體培養(yǎng)物中熒光原生質(zhì)體的百分比。生產(chǎn)重組DsRed蛋白質(zhì)的單克隆懸浮培養(yǎng)物的流式細(xì)胞分析顯示出具有類(lèi)似且強(qiáng)烈的熒光強(qiáng)度(窄熒光峰)的同源分布的細(xì)胞。DsRed熒光細(xì)胞部分的計(jì)算結(jié)果為百分比介于78-88%的強(qiáng)熒光細(xì)胞。
[0122]重組蛋白質(zhì)的積聚水平可通過(guò)不同方法(例如酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA))來(lái)測(cè)定。因此，將細(xì)胞離心(850g，5分鐘)、再懸浮于3倍體積萃取緩沖液(PBS pH6，5mM2_巰基乙醇、5mM EDTA、IOmM抗壞血酸)并由超音波破壞。透過(guò)另一個(gè)離心步驟(20分鐘，16000g)由細(xì)胞碎片分離萃取物并用于分析。對(duì)在5dpi由pTRAkc:MTED轉(zhuǎn)化的懸浮培養(yǎng)物的細(xì)胞萃取物中積聚的M12抗體進(jìn)行免疫學(xué)分析，顯示積聚至118±20μ g/g鮮重(高出使用傳統(tǒng)產(chǎn)生方法(即愈傷組織產(chǎn)生與篩選)1.5倍)。
[0123]實(shí)施例2
[0124]從異質(zhì)性轉(zhuǎn)基因懸浮培養(yǎng)物產(chǎn)生單克隆細(xì)胞系[0125]A.煙草細(xì)胞培養(yǎng)物
[0126]在100ml玻璃錐形瓶中加入50ml生產(chǎn)ER延遲人類(lèi)完全I(xiàn)gGl(ER_retarded humanfull-size IgGl)抗體M12及指向熒光蛋白質(zhì)DsRed的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因煙草BY-2懸浮培養(yǎng)物MTED#18，維持在無(wú)菌、26°C下的黑暗條件下，并使用180rpm的恒定軌道攪拌。在控制的相同條件下培養(yǎng)BY-2野生型細(xì)胞。培養(yǎng)基含有pH5.8的基礎(chǔ)MSMO培養(yǎng)基，并補(bǔ)充有蔗糖(3%,w/v)以及l(fā)mg/12, 4- 二氯苯氧こ酸。以7天間為_(kāi)通過(guò)將5% (v/v)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50ml新鮮培養(yǎng)基而完成繼代培養(yǎng)。
[0127]通過(guò)由土壤桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的煙草BY-2細(xì)胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因懸浮培養(yǎng)物，接著進(jìn)行基于抗生素的篩選以及隨后分離轉(zhuǎn)化的愈傷組織。通過(guò)免疫學(xué)分析(DotblotlELISA)依據(jù)愈傷組織的抗體生產(chǎn)來(lái)篩選愈傷組織，而最佳候選者用于懸浮培養(yǎng)物的建立(=細(xì)胞系MTED#18)。MTED#18母培養(yǎng)物的特定M12抗體生產(chǎn)為13 μg/g細(xì)胞鮮重(10mg/L)。流式細(xì)胞分析掲示，轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)物由兩個(gè)亞群體所組成，所述兩個(gè)亞群體僅有24%用于生產(chǎn)熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)DsRed的有活力的群體。
[0128]關(guān)于原生質(zhì)體制備,通過(guò)將2% (v/v)轉(zhuǎn)移至50ml新鮮培養(yǎng)基來(lái)對(duì)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
[0129]B.原牛質(zhì)體制各及細(xì)朐壁再牛
[0130]參見(jiàn)實(shí)施例1，C部分。
[0131]通常，所述エ序的結(jié)果為每毫升產(chǎn)生5x10s個(gè)原生質(zhì)體，平均具有62.2%的有活力的轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體。
[0132]C.流式細(xì)胞分析與分選
[0133]如實(shí)施例1，D部分中所述完成儀器設(shè)定以及預(yù)先安排。
[0134]以單細(xì)胞模式將單ー強(qiáng)烈熒光的植物原生質(zhì)體(全部所分選的原生質(zhì)體的1-2%)分選至細(xì)胞沉積裝置(亦即微量滴定板)中。每孔I個(gè)原生質(zhì)體，與第二次圈選標(biāo)準(zhǔn)相同，分選至96孔微量滴定板中，其中填充含有約100個(gè)野生型原生質(zhì)體作為飼養(yǎng)細(xì)胞的50 ill無(wú)菌8p2c再生培養(yǎng)基。將96孔板以無(wú)菌蓋闔上并使用膠帶密封?；厥赵|(zhì)體的確切數(shù)目由倒立式熒光顯微鏡測(cè)定。單細(xì)胞模式下的原生質(zhì)體的流式細(xì)胞分選結(jié)果是，平板效率為約20%的孔每孔含有I個(gè)完整且有活力的原生質(zhì)體。
[0135]D.以低密度再生經(jīng)分選的原生質(zhì)體
[0136]單一分選原生質(zhì)體的再生按照如實(shí)施例1，E部分中所述進(jìn)行。
[0137]單細(xì)胞模式下的高熒光原生質(zhì)體的流式細(xì)胞分選結(jié)果是，約20%的孔含有僅I個(gè)分選的原生質(zhì)體。這些單一原生質(zhì)體的50%開(kāi)始增殖且可用于建立懸浮培養(yǎng)物。
[0138]E.分析單克隆轉(zhuǎn)基因懸浮培養(yǎng)物
[0139]為測(cè)定衍生自単一原生質(zhì)體的改良懸浮培養(yǎng)物中熒光原生質(zhì)體的百分比，如先前所述進(jìn)行流式細(xì)胞分析(實(shí)施例1，D部分)。M12抗體積聚水平是通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)來(lái)測(cè)定。因此，將懸浮細(xì)胞離心(850g，5分鐘)、再懸浮于3倍體積的萃取緩沖液(PBS pH6，5mM2-巰基こ醇、5mM EDTA、IOmM抗壞血酸)并通過(guò)超音波破壞。通過(guò)離心步驟(20分鐘，16000g)由細(xì)胞碎片分離萃取物并用于分析。由于所選的設(shè)定(Fe捕獲及LC檢測(cè))的原因，僅能檢測(cè)到完全組裝的抗體。
[0140]在1輪FACS后，單克隆懸浮培養(yǎng)物顯示兩個(gè)重組蛋白質(zhì)的積聚水平明顯提高，所述兩個(gè)重組蛋白質(zhì)為:與母懸浮培養(yǎng)物相比具有3.7倍富集百分比的DsRed熒光細(xì)胞(90%);與母懸浮培養(yǎng)物相比增加11倍的M12抗體(145 μ g/g鮮重或以mg/L水平為9.3倍(93mg/L))。
[0141]F.重復(fù)懸浮培養(yǎng)物改良
[0142]為了進(jìn)一步增進(jìn)并穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因單克隆懸浮培養(yǎng)物的重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)率，可重復(fù)步驟B至E。應(yīng)用先前所述的相同條件產(chǎn)生、分選以及再生原生質(zhì)體。
[0143]第2輪分選使得抗體積聚更為增加:182 μ g/g鮮重或113mg/L，相較于母培養(yǎng)物增加14倍與11.3倍。
[0144]最佳生產(chǎn)第2代單克隆的第三輪分選得到第三代單克隆培養(yǎng)物，其產(chǎn)生類(lèi)似的積聚水平，這顯示達(dá)到最大水平。[0145]G.優(yōu)異生產(chǎn)單克隆培養(yǎng)物就目標(biāo)蛋白質(zhì)生產(chǎn)率方面的穩(wěn)定性
[0146]由FACS得到的單克隆細(xì)胞系的穩(wěn)定性例如針對(duì)3個(gè)單株來(lái)進(jìn)行研究。以7天為周期繼代培養(yǎng)單克隆細(xì)胞系(參見(jiàn)實(shí)施例1，A部分)，同時(shí)以2個(gè)月為間隔在每當(dāng)繼代培養(yǎng)后的第5天測(cè)定兩種重組目標(biāo)蛋白質(zhì)。就第I代單克隆培養(yǎng)物而言，已證明在12個(gè)月期間這些培養(yǎng)物仍然生產(chǎn)高且穩(wěn)定數(shù)量的M12抗體/g鮮重。僅在雙月取樣間隔觀(guān)察到抗體水平略有變化(由細(xì)胞培養(yǎng)改變所致)。
[0147]第2代單克隆的分析顯示，與其所來(lái)源的第一代單株培養(yǎng)物相比，兩種重組蛋白質(zhì)M12抗體有類(lèi)似或略為增加的積聚水平，由此證明細(xì)胞系穩(wěn)定性。在所有被分析的第2代單克隆培養(yǎng)物中顯示，相較于第一代單克隆培養(yǎng)物，目標(biāo)蛋白質(zhì)生產(chǎn)更為穩(wěn)定(在雙月取樣間隔的變異較少)。在12個(gè)月期間，3個(gè)被分析的單株培養(yǎng)物中的兩者被發(fā)現(xiàn)，DsRed熒光細(xì)胞在總?cè)后w中的百分比以及M12抗體積聚皆為高度穩(wěn)定。
【權(quán)利要求】
1.ー種由植物細(xì)胞的異種群體產(chǎn)生單克隆植物細(xì)胞系的方法，其包含下列步驟: (a)提供植物細(xì)胞的異種群體； (b)由該植物細(xì)胞的異種群體制備原生質(zhì)體； (c)通過(guò)將原生質(zhì)體制備物進(jìn)行流式細(xì)胞分選而分離單一原生質(zhì)體； (d)在飼養(yǎng)細(xì)胞材料存在的情況下，通過(guò)共培養(yǎng)對(duì)被分離的單ー轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體進(jìn)行再生，直到形成小集落；以及 (e)將小集落從飼養(yǎng)細(xì)胞材料中轉(zhuǎn)移，并培養(yǎng)小集落直到形成單克隆植物細(xì)胞系。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)ー步包含使步驟(e)中所得到的單克隆植物細(xì)胞系再生，直至形成完整可育性植株。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，步驟(b)中所制備的原生質(zhì)體被轉(zhuǎn)化，并且能夠:(i )生產(chǎn)熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)或多肽；(i i )生產(chǎn)期望產(chǎn)物；以及/或者(i i i )在選擇劑存在的情況下存活。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述期望產(chǎn)物選自由異種蛋白質(zhì)或多肽、次級(jí)代謝產(chǎn)物及用于診斷或分析的標(biāo)記物所構(gòu)成的組。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(c)中的單一原生質(zhì)體的分離通過(guò)將原生質(zhì)體進(jìn)行FACS。
6.ー種單克隆植物細(xì)胞系，其由執(zhí)行如權(quán)利要求1至5項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法而可獲得或獲得?！?br> 7.一種完整可育性植株，其由執(zhí)行如權(quán)利要求2至5項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的方法而可獲得或獲得。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK103596423SQ201180071503
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2011年6月7日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月7日
【發(fā)明者】珍娜·基爾霍夫, 史蒂芬·雪勒伯格, 安德烈斯·席爾邁爾, 海爾格·辛克爾, 萊納·費(fèi)希爾 申請(qǐng)人:弗勞恩霍夫應(yīng)用研究促進(jìn)協(xié)會(huì)