專利名稱：納米粒子穩(wěn)定化的脂質(zhì)體的觸發(fā)活性物釋放的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本教導(dǎo)涉及納米粒子-脂質(zhì)體組合物的觸發(fā)活性物(cargo)釋放以及使用方法。
背景技術(shù)：
使用納米粒子差異地遞送治療劑至作用部位(也稱為靶向性藥物遞送)代表了納米醫(yī)學(xué)研究的核心目標(biāo)，也是納米醫(yī)學(xué)研究的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。用于實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)的常用途徑是使用特異性結(jié)合至被靶標(biāo)細(xì)胞過表達(dá)的受體的靶向配體對納米粒子的表面進(jìn)行官能化。已證實(shí)多種分子可結(jié)合至靶標(biāo)細(xì)胞，包括抗體、抗體片段、適體、肽、小分子等。雖然已在使用配體進(jìn)行活性細(xì)胞靶向方面取得進(jìn)展，但是這些產(chǎn)品均未被批準(zhǔn)上市用于相關(guān)治療。脂質(zhì)體是具有由兩親性脂質(zhì)分子組成的雙層膜結(jié)構(gòu)的球形脂質(zhì)囊泡，并且已被廣泛研究了數(shù)十年。有幾種脂質(zhì)體制劑已被批準(zhǔn)上市用于治療目的，例如兩性霉素B脂質(zhì)體(AmBisome) (NeXstarPharmaceuticals, San Dimas, USA)，其是 FDA 批準(zhǔn)的兩性霉素 B 的脂質(zhì)體制劑，已在臨床上被廣泛地用于治療中性粒細(xì)胞減少、內(nèi)臟利什曼病和甲基丙ニ酸血癥患者的念珠菌屬(Candida spp·)、曲霉菌屬(Aspergillus spp.)、錸刀菌屬(Fusariumspp.)和其它真菌感染。盡管脂質(zhì)體作為遞送媒介物(vehicle)具有這些有利特征，但是脂質(zhì)體的應(yīng)用通常受限于它們的不穩(wěn)定性，因?yàn)橹|(zhì)體間存在不可控制的融合，導(dǎo)致短的儲(chǔ)存壽命、不希望的有效載荷損失，以及意料不到的混合。用于使脂質(zhì)體穩(wěn)定化的廣泛使用的途徑是在脂質(zhì)體表面上涂覆諸如聚こニ醇(PEG)的“隱形”材料。PEG化脂質(zhì)體不僅可以阻止脂質(zhì)體彼此之間融合，而且可以通過抑制血漿蛋白吸附到脂質(zhì)體表面上來增強(qiáng)脂質(zhì)體在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。因此，它們已被廣泛地用于全身藥物遞送。然而，PEG化脂質(zhì)體很少用于局部藥物遞送，尤其很少用于治療細(xì)菌感染。這主要是因?yàn)镻EG化涂層不僅穩(wěn)定化脂質(zhì)體以使其不融合，而且阻止它們與細(xì)菌膜融合或者阻止諸如毒素的成孔蛋白進(jìn)入脂質(zhì)體來釋放藥物或其它活性物有效載荷。因此，希望開發(fā)這樣的新脂質(zhì)體，其在置于作用部位之前(包括制造和儲(chǔ)存期)經(jīng)穩(wěn)定化而不能彼此之間融合，而一旦被施加到靶標(biāo)真皮部位時(shí)，其融合活性就可以立即被激活。也希望開發(fā)這樣的脂質(zhì)體，其經(jīng)過穩(wěn)定化而不能與合成或生物膜融合，但是一旦被施加到靶標(biāo)皮膚部位時(shí)，其就可讓成孔蛋白進(jìn)入用于控制活性物釋放。發(fā)明概述本教導(dǎo)包括刺激響應(yīng)性納米粒子穩(wěn)定化的脂質(zhì)體的觸發(fā)藥物釋放。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了脂質(zhì)體，其包括界定脂質(zhì)體的內(nèi)球面和外表面的脂質(zhì)雙層、利用刺激敏感性鍵連接至脂質(zhì)分子的多個(gè)生物相容性納米粒子，并且進(jìn)一歩包含在內(nèi)球面內(nèi)的活性物(cargo)，其中所述活性物在觸發(fā)刺激敏感性鍵時(shí)釋放。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，提供了脂質(zhì)體，其包括界定脂質(zhì)體的內(nèi)球面和外表面的脂質(zhì)雙層、多個(gè)生物相容性納米粒子，所述生物 相容性納米粒子經(jīng)由靜電相互作用與脂質(zhì)分子接觸，并且進(jìn)一歩包含在內(nèi)球面內(nèi)的活性物，其中所述活性物在觸發(fā)脂質(zhì)體孔形成時(shí)釋放。在根據(jù)上述實(shí)施方案的各個(gè)方面，生物相容性納米粒子可以包括金納米粒子、銀納米粒子、合成納米粒子。在某些方面，生物相容性納米粒子的表面包含陰離子官能團(tuán)。在某些方面，生物相容性納米粒子的表面包含陽離子官能團(tuán)。具體而言，生物相容性納米粒子的表面可以包含羧酸根和殼聚糖。在另ー些其它方面，生物相容性納米粒子的直徑為約Inm至約20nm。在各個(gè)方面，脂質(zhì)體可以包含氫化L-α -磷脂酰膽堿和1，2_ ニ-(9Ζ-十八烯?；?-3-三甲基銨基丙烷。在另ー些其它方面，脂質(zhì)體包含在脂質(zhì)體膜中的50%的膽固醇和在溶液中的lOOmg/mLPEG。在其它方面，活性物選自由抗生素、抗微生物劑、生長因子、化療劑及其組合組成的組。具體而言，活性物包括月桂酸、過氧化苯甲酰、萬古霉素(vancomycin)及其組合。在某些方面，脂質(zhì)體的直徑為約IOnm至約300nm。在其它方面，生物相容性納米粒子占脂質(zhì)體表面的約5%至約25%。在又一方面，觸發(fā)器可以包括真皮pH、天然存在或合成的毒素成孔活性，以及光的施加(light administration)。在各個(gè)方面,刺激敏感性鍵是PH-敏感性鍵。在另ー些其它方面，觸發(fā)器可以是成孔毒素。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，還提供了包含上述脂質(zhì)體的藥劑遞送系統(tǒng)。在各個(gè)方面，該脂質(zhì)體可以在藥學(xué)上可接受的媒介物中遞送。在另ー個(gè)實(shí)施方案中，提供了選擇性地遞送活性物至靶標(biāo)真皮部位的方法，其包括將上述脂質(zhì)體施用至靶標(biāo)真皮部位以及觸發(fā)活性物釋放。在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于治療真皮疾病或病狀的方法，其包括將治療有效量的上述脂質(zhì)體施用至需要其的受試者的靶標(biāo)真皮部位以及觸發(fā)活性物釋放。在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于治療真皮疾病或病狀的方法，該方法包括經(jīng)由上述藥劑遞送系統(tǒng)將治療有效量的上述脂質(zhì)體施用至需要其的受試者。在又一方面，適合于這些方法的病狀可以包括MRSA感染、金黃色葡萄球菌(S. aureus)感染,和痤瘡丙酸桿菌(P. acnes)感染。在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在觸發(fā)釋放之前穩(wěn)定地儲(chǔ)存藥劑的方法，其包括將藥劑封閉在上述脂質(zhì)體中。參考下面的描述、實(shí)施例和所附權(quán)利要求，本教導(dǎo)的這些和其它特征、方面和優(yōu)點(diǎn)將變得更容易理解。附圖簡述本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解下面描述的附圖僅為了說明目的。這些附圖并不g在以任何方式限制本教導(dǎo)的范圍。圖I.羧基修飾的金納米粒子(AuC)-穩(wěn)定化的脂質(zhì)體以及它在酸性pH環(huán)境下的去穩(wěn)定化的示意圖。在中性PH環(huán)境下，去質(zhì)子化AuC(Au-C00_)使脂質(zhì)體穩(wěn)定化。當(dāng)pH下降到羧酸基團(tuán)的PKa值(pKa 5)以下時(shí)，Au-COO—被質(zhì)子化從而形成Au_C00H，Au-COOH隨后與脂質(zhì)體脫離，導(dǎo)致融合活性得到恢復(fù)的裸露脂質(zhì)體的形成。圖2.通過動(dòng)態(tài)光散射對AuC-脂質(zhì)體的表征。(A) 裸露脂質(zhì)體和AuC/脂質(zhì)體摩爾比為200/1的AuC-脂質(zhì)體的粒度(直徑，nm)，及(B)裸露脂質(zhì)體和AuC/脂質(zhì)體摩爾比為200/1的AuC-脂質(zhì)體的ζ電位(mV)。圖3.示出AuC-脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)的代表性掃描透射電子顯微鏡(STEM)圖像。㈧ニ次電子圖像顯示AuC納米粒子吸附在脂質(zhì)體表面上。(B)在(A)中示出的區(qū)域的透射電子圖像進(jìn)一步證實(shí)AuC納米粒子結(jié)合在脂質(zhì)體上。(C)AuC納米粒子的暗視野透射圖像。(D)AuC納米粒子的透射圖像。圖4.具有不同的AuC/脂質(zhì)體摩爾比(MAue/X)的AuC-脂質(zhì)體在不同pH值環(huán)境下的熒光猝滅和恢復(fù)產(chǎn)量。㈧使AuC納米粒子以不同的MAlC/X摩爾比吸附到熒光標(biāo)記的脂質(zhì)體上。以熒光猝滅產(chǎn)量百分比對MAlC/X比率作圖。插圖具有不同的MAlC/X比率(從頂部到底部:0、22、44、66、88、110、132、154、176、200、220、240、260，和 280)的 AuC-脂質(zhì)體的熒光發(fā)射光譜。(B)AuC-脂質(zhì)體(MAue/X = 200)在不同的pH值環(huán)境下的相對熒光恢復(fù)產(chǎn)量。插圖AuC-脂質(zhì)體在一系列pH值(從頂部到底部3,3. 5、4、4· 5、5、7、6· 5、6，和5. 5)環(huán)境下的熒光發(fā)射光譜。圖5.在通過離心除去未結(jié)合AuC之后，AuC-脂質(zhì)體分別在pH = 7(頂部實(shí)線)和pH = 4 (底部虛線)的環(huán)境下的UV-可見吸收光譜。在pH = 7時(shí)，檢測到清晰的AuC的UV吸收光譜，指示去質(zhì)子化AuC強(qiáng)有力地結(jié)合在脂質(zhì)體表面上。在pH = 4時(shí)，檢測到可忽略不計(jì)的AuC的UV吸收，指示質(zhì)子化AuC脫離于脂質(zhì)體表面。插圖在離心除去游離AuC之后的AuC-脂質(zhì)體溶液。紅色指示在pH = 7時(shí)溶液中存在AuC。圖6.分別在pH = 7和pH = 4時(shí)AuC-介導(dǎo)的脂質(zhì)體融合的FRET測量。將熒光供體(C6NBD)和熒光猝滅劑(DMPE-RhB)，以猝滅劑有效地猝滅來自供體的熒光發(fā)射的適當(dāng)摩爾比同時(shí)摻入到陰離子脂質(zhì)體中。然后將FRET-標(biāo)記的陰離子脂質(zhì)體與AuC-穩(wěn)定化的陽離子脂質(zhì)體混合。(A)在470nm的激發(fā)波長下C6NBD和DMPE-RhB的熒光發(fā)射光譜。從頂線到底線AuC-陽離子脂質(zhì)體與陰離子脂質(zhì)體在pH = 4時(shí)混合(虛線)；不含任何金納米粒子或陽離子脂質(zhì)體的単獨(dú)陰離子脂質(zhì)體的PH = 7的水溶液(實(shí)線)；不含任何金納米粒子或陽離子脂質(zhì)體的単獨(dú)陰離子脂質(zhì)體的PH = 4的水溶液(虛線)；AuB-陽離子脂質(zhì)體與陰離子脂質(zhì)體在PH = 4時(shí)混合(虛線)；AuB-陽離子脂質(zhì)體與陰離子脂質(zhì)體在pH = 7時(shí)混合(實(shí)線)；以及AuC-陽離子脂質(zhì)體與陰離子脂質(zhì)體在pH = 7時(shí)混合(實(shí)線)；(B)來自圖(A)的在不同條件下的C6NBD (供體)的熒光發(fā)射光譜放大圖，其中頂上面兩條線為AuB，中間兩條線為AuC，底部兩條線為水溶液；(C)分別在pH = 7和pH = 4時(shí)與AuB-陽離子脂質(zhì)體相比，AuC-陽離子脂質(zhì)體與陰離子脂質(zhì)體的相對融合活性。圖7.羧基修飾的金納米粒子(AuC)-穩(wěn)定化的LipoLA以及它在酸性pH環(huán)境下的去穩(wěn)定化的示意圖。圖8.在通過離心除去未結(jié)合AuC之后，AuC-Mg-IipoLA分別在pH = 7 (實(shí)線)和pH = 4 (虛線)的環(huán)境下的UV-可見吸收光譜。在pH = 7時(shí)，檢測到清晰的AuC的UV吸收光譜，指示去質(zhì)子化AuC強(qiáng)有力地結(jié)合在脂質(zhì)體表面上。在pH = 4時(shí)，檢測到可忽略不計(jì)的AuC的UV吸收，指示質(zhì)子化AuC脫離于脂質(zhì)體表面。插圖在離心除去游離AuC之后的AuC-Mg-IipoLA溶液。紫色指示在pH = 7時(shí)溶液中存在AuC。圖9.在pH = 4至pH = 7的環(huán)境下AuC-Mg-IipoLA與痤瘡丙酸桿菌之間的相互作用。與RhB標(biāo)記的AuC-Mg-LipoLA (初始脂質(zhì)濃度為140 μ g/mL)在范圍為4至7的PH環(huán)境下培育之后的痤瘡丙酸桿菌(7.93X 108CFU/mL)的發(fā)射光譜，其中除去了過量的RhB-AuC-Mg-LipoLA。


圖10. AuC-Mg-LipoLA對抗痤瘡丙酸桿菌的抗微生物活性。(A)將AuC-Mg-LipoLA與痤瘡丙酸桿菌(5Xl°7CFU/mL)在不同的pH環(huán)境下在厭氧條件下培育lOmin。結(jié)果表明，在pH 4. O環(huán)境下，AuC-Mg-LipoLA完全滅殺痤瘡丙酸桿菌。痤瘡丙酸桿菌與空脂質(zhì)體溶液(不含LA)和pH為4的緩沖液的培育用作陰性對照。(B)在pH = 4吋，分別 將AuC-Mg-LipoLA與痤瘡丙酸桿菌培育0min、5min、7. 5min,和lOmin。數(shù)據(jù)表示為三組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值+SD0 UD:未檢測到。
圖11.細(xì)菌毒素觸發(fā)用于治療毒素分泌細(xì)菌的金納米粒子穩(wěn)定化的脂質(zhì)體釋放出抗生素的示意原理。萬古霉素負(fù)載的脂質(zhì)體受到其表面上的吸收性殼聚糖涂覆的金納米粒子(AuChi)的保護(hù)，該金納米粒子阻止該脂質(zhì)體彼此之間或者與細(xì)菌膜融合。一旦AuChi-穩(wěn)定化的脂質(zhì)體(AuChi-脂質(zhì)體)遇到細(xì)菌毒素，所述毒素就在脂質(zhì)體膜中形成孔并因而釋放包封的抗生素，所述抗生素隨后滅殺分泌該毒素的細(xì)菌或者抑制分泌該毒素的細(xì)菌生長。
圖12. AuChi和AuChi-脂質(zhì)體的合成和表征。(A)殼聚糖和AuChi的1H-NMR譜，其指示殼聚糖涂覆在金納米粒子的表面上。(B)AuChi的UV-可見吸收光譜。插圖AuChi的代表性二次電子圖像(SEI)和AuChi的內(nèi)部金納米粒子的透射電子圖像(TEI)。(C)裸露脂質(zhì)體(不含AuChi)和脂質(zhì)體/AuChi摩爾比為I 300的AuChi-脂質(zhì)體的表面ζ電位(mV)。
圖13.具有不同的脂質(zhì)體/AuChi摩爾比的AuChi-脂質(zhì)體的融合能力。將熒光染料ANTS和DPX以DPX最大限度地猝滅ANTS的熒光的濃度包封在脂質(zhì)體內(nèi)。在與裸露脂質(zhì)體(不含AuChi或染料)融合后，ANTS的熒光由于該染料的稀釋而得到恢復(fù)。(A)在分別將ANTS/DPX負(fù)載的脂質(zhì)體在PBS (用作背景熒光信號(hào))和在O. I % Triton X-100 (用作最大熒光信號(hào))中于室溫下培育Ih后測得的ANTS的熒光發(fā)射光譜。⑶將脂質(zhì)體/AuChi摩爾比為I : 0、1 150或I : 300的AuChi-脂質(zhì)體與裸露脂質(zhì)體(不含AuChi或染料)以I : 4的摩爾比混合。在室溫下培育Ih后，裸露脂質(zhì)體因與離心過濾裝置融合而破裂。測量由此產(chǎn)生的在濾液中的ANTS在510nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度。
圖14.在各種濃度的膽固醇和PEG的存在下毒素誘導(dǎo)的脂質(zhì)體膜中的成孔。(A)將含有 0% (w/w) >10% (w/w) >25% (w/w),和 50% (w/w)膽固醇的脂質(zhì)體與 20 μ g/mL α-毒素在室溫下培育lh。從該孔釋放的染料通過測量ANTS在510nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度來進(jìn)行量化。通過將α-毒素誘導(dǎo)的染料釋放與由1% (VZV)Triton-X-IOO導(dǎo)致的全部染料釋放相比較，獲得成孔百分比。⑶在0-150mg/mL范圍內(nèi)的各種濃度的PEG分子(Mn = 2000Da)的存在下，將含有50% (w/w)膽固醇的脂質(zhì)體與20 μ g/mL α -毒素一起在室溫下培育lh。
圖15.在與MRSA細(xì)菌(I X 108CFU/mL)分別培育O. 5h和24h后的萬古霉素負(fù)載的AuChi-脂質(zhì)體的累積萬古霉素釋放曲線。釋放的萬古霉素通過反相HPLC量化。與PBS (不含MRSA細(xì)菌)培育的相應(yīng)樣品用作陰性對照。插圖通過HPLC測得的各種濃度的萬古霉素的線性校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖16.萬古霉素AuChi-脂質(zhì)體對抗MRSA細(xì)菌的抗微生物活性。在100mg/mLPEG的存在下，將萬古霉素AuChi-脂質(zhì)體與MRSA細(xì)菌(IX 108CFU/mL)在5% TSB中培育24h。該細(xì)菌分泌的毒素在AuChi-脂質(zhì)體中形成孔，并釋放包封的萬古霉素，萬古霉素隨后抑制該細(xì)菌的生長。通過在培育后測量在600nm處的吸光度，確定細(xì)菌生長速率。萬古霉素脂質(zhì)體(不含AuChi)和具有相同藥物濃度(62 μ g/mL)的游離萬古霉素用作陽性對照。AuChi-脂質(zhì)體(不含萬古霉素)和PBS用作陰性對照。數(shù)據(jù)表示為平均值土SD(n = 3)。發(fā)明詳述縮寫和定義 為了便于理解本發(fā)明，本文使用的許多術(shù)語和縮寫定義如下在介紹本發(fā)明的要素及其ー個(gè)(多個(gè))優(yōu)選實(shí)施方案時(shí)，冠詞“ー個(gè)”、“ー種”、“該”和“所述”意在表示存在一個(gè)或多個(gè)這樣的元素。術(shù)語“包含”、“包括”和“具有”是包含性的，并且表示可能存在除所列要素以外的附加要素。在列出兩項(xiàng)或多項(xiàng)時(shí)使用的術(shù)語“和/或”表示所列項(xiàng)中的任一項(xiàng)都可以單獨(dú)或者與所列項(xiàng)中的任一項(xiàng)或多項(xiàng)組合使用。例如，表達(dá)“A和/或B”意在表不A和B中的一者或兩者，即，單獨(dú)的A、單獨(dú)的B，或者組合的A和B。表達(dá)“A、B和/或C”意在表示單獨(dú)的A、單獨(dú)的B、單獨(dú)的C，組合的A和B，組合的A和C，組合的B和C，或者組合的A、B和C。在描述分子和取代基時(shí)，分子描述詞可以組合從而產(chǎn)生描述取代基的詞語或短語。本文中使用了此類描述詞。實(shí)例包括這樣的術(shù)語，如芳烷基(或芳基烷基)、雜芳烷基、雜環(huán)燒基、環(huán)燒基燒基、芳燒氧基燒氧基擬基等。包括最后面的描述詞芳燒氧基燒氧基擬基的化合物的具體實(shí)例為C6H5-CH2-CH2-O-CH2-O-C(O)，其中C6H5為苯基。還應(yīng)注意，取代基在本領(lǐng)域中可以具有ー種以上的描述性詞語或短語，例如，雜芳基氧烷基羰基也可以稱為雜芳基氧烷?；?。此類組合在本文中用于描述本發(fā)明的化合物和方法，并且本文描述了其它實(shí)例。陰離子如本文使用的術(shù)語“陰離子”是指能夠在水性介質(zhì)中形成帶有凈負(fù)電荷的離子的物質(zhì)。陰離子官能團(tuán)如本文使用的術(shù)語“陰離子官能團(tuán)”是指具有凈負(fù)電荷的如本文定義的官能團(tuán)。代表性陰離子官能團(tuán)包括羧酸離子、磺酸離子、膦酸離子、它們的烷基化衍生物等。陽離子如本文使用的術(shù)語“陽離子”是指能夠在水性介質(zhì)中形成帶有凈正電荷的離子的物質(zhì)。羧酸根如本文使用的術(shù)語“羧酸根”是指-C02_。官能團(tuán)如本文使用的術(shù)語“官能團(tuán)”是指化學(xué)基團(tuán)，其賦予帶有該化學(xué)基團(tuán)的制品(例如納米粒子)以特定功能。例如，官能團(tuán)可以包括已知結(jié)合到特定分子上的物質(zhì)如抗體、寡核苷酸、生物素，或鏈酶親和素；或小化學(xué)基團(tuán)如胺、羧酸根等。脂質(zhì)體如本文使用的術(shù)語“脂質(zhì)體”是指封閉流體空間的單層或多層脂質(zhì)囊泡。囊泡的壁，也稱為膜，由具有極性頭和非極性尾的ー種或多種脂質(zhì)組分(例如，多種磷脂加膽固醇)如磷脂的雙分子層形成。在水性(或極性)溶液中，以及在單層脂質(zhì)體中，ー個(gè)層的極性頭朝向向外從而延伸進(jìn)入周圍介質(zhì)，并且該脂質(zhì)的非極性尾部彼此締合，由此在囊泡的壁中提供極性表面和非極性核。在多層脂質(zhì)體中，囊泡的極性表面也延伸到脂質(zhì)體的核中并且囊泡壁是雙層。單層脂質(zhì)體或多層脂質(zhì)體中的囊泡壁可以被其它脂質(zhì)組分如膽固醇、游離脂肪酸和磷脂飽和或者未被它們飽和。在此類情況下，可以將過量的將會(huì)流出的其它脂質(zhì)組分添加到囊泡壁中，直至囊泡壁中的濃度達(dá)到平衡，該平衡可能取決于脂質(zhì)體環(huán)境。脂質(zhì)體還可以包含可能或可能不增加脂質(zhì)體活性的其它試劑。例如，可以將聚こニ醇(PEG)添加到該膜中從而促進(jìn)孔形成。另外，將生物相容性納米粒子添加到該膜中從而使如本文描述的脂質(zhì)體穩(wěn)定化。藥劑如本文使用的術(shù)語“藥劑”是指物質(zhì)、制劑或裝置，其治療或預(yù)防或減輕接受該藥劑的患者或受試者的疾病或病狀的癥狀。納米粒子如本文使用的術(shù)語“納米粒子(nanoparticle) ”是指直徑在約Inm和約IOOOnm之間的粒子。類似地,術(shù)語“多個(gè)納米粒子(nanoparticles) ”是指平均直徑在約 Inm和約IOOOnm之間的多個(gè)粒子。該術(shù)語包括生物相容性納米粒子，生物相容性納米粒子可以是可生物降解的陽離子納米粒子，包括但不限于使根據(jù)下面提供的實(shí)施例的脂質(zhì)體穩(wěn)定化的金、銀，和合成納米粒子。生物相容性合成納米粒子的實(shí)例包括聚苯こ烯等。藥學(xué)上可接受的如本文使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”意指被聯(lián)邦或州政府的監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)，或者除對于在動(dòng)物中的使用，更特別是在人和/或非人哺乳動(dòng)物中的使用安全的其它制劑之外列于美國藥典、其它公認(rèn)的藥典中。藥學(xué)上可接受的鹽如本文使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指本公開中的化合物的酸加成鹽或堿加成鹽。藥學(xué)上可接受的鹽是這樣的任何鹽，其保留了母體化合物的活性并且不會(huì)對接受該鹽的受試者和在該鹽被施用的環(huán)境中產(chǎn)生任何有害或不希望的影響。藥學(xué)上可接受的鹽包括但不限于，無機(jī)酸和羧酸的金屬絡(luò)合物和鹽。藥學(xué)上可接受的鹽還包括諸如鋁、鈣、鐵、鎂、錳和復(fù)合鹽的金屬鹽。另外，藥學(xué)上可接受的鹽包括但不限于酸鹽如こ酸鹽、天冬氨酸鹽、烷基磺酸鹽、芳基磺酸鹽、醋氧こ基鹽(axetil)、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、硫酸氫鹽、酒石酸氫鹽、丁酸鹽、依地酸鈣、樟腦磺酸鹽、碳酸鹽、氯苯甲酸鹽、朽1檬酸鹽、依地酸鹽(edetic)、こニ磺酸鹽(edisylic)、依托酸鹽(estolic)、こ磺酸鹽(esyl)、こ磺酸鹽(esylic)、甲酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡萄糖酸鹽、谷氨酸鹽、こ醇酸鹽、こ醇酰阿散酸鹽(glycolylarsanilic)、環(huán)己磺酸鹽、己基間苯ニ酹酸鹽、hydrabamic、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、羥萘甲酸鹽、羥こ磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、馬來酸鹽、蘋果酸鹽、丙ニ酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、甲基硝酸鹽、甲基硫酸鹽、粘酸鹽、粘康酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽、草酸鹽、對硝基甲磺酸鹽、撲酸鹽、泛酸鹽、磷酸鹽、磷酸ー氫鹽、磷酸ニ氫鹽、鄰苯ニ甲酸鹽、多聚半乳糖酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、氨基磺酸鹽、磺胺酸鹽、磺酸鹽、硫酸鹽、鞣酸鹽、酒石酸、茶氯酸鹽(teoclic)、甲苯磺酸鹽等。藥學(xué)上可接受的鹽可以衍生自氨基酸，包括但不限于半胱氨酸。用于生產(chǎn)諸如鹽的化合物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見，例如，Stahl 等,Handbookof Pharmaceutical Salts !Properties,Selection, and Use, Wiley-VCH ;Veriag Helvetica Chimica Acta, Ziirich, 2002 ;Berge等，J Pharm. Sci. 66 1,1977)。
藥學(xué)上可接受的載體如本文使用的“藥學(xué)上可接受的載體”是指化合物與其一起被使用的賦形劑、稀釋劑、防腐剤、增溶劑、乳化剤、佐劑，和/或媒介物。此類載體可以為無菌液體，如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來源的油如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等，以及聚こニ醇，甘油，丙ニ醇或其它合成溶剤。當(dāng)化合物是靜脈內(nèi)施用藥物時(shí)，水是優(yōu)選的載體。鹽水溶液以及右旋糖和甘油水溶液也可以用作液體載體，特別是對于可注射溶液而言更是如此。合適的賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酷、滑石粉、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、こニ醇、水、こ醇等。如果需要，化合物還可以與少量的潤濕劑或乳化剤，或PH緩沖劑如こ酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽組合?？咕鷦┤绫郊状蓟?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如こニ胺四こ酸；以及用于調(diào)節(jié)緊張度的試劑如氯化鈉 或右旋糖也可以作為載體。用于生產(chǎn)與載體組合的化合物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。磷脂如本文使用的術(shù)語“磷脂”是指含有甘油ニ酷、磷酸基，和簡單有機(jī)分子如膽堿的許多脂質(zhì)中的任ー種。磷脂的實(shí)例包括但不限于磷脂酸(磷脂酸酯(鹽))(PA)、磷脂酰こ醇胺(腦磷脂)(PE)、磷脂酰膽堿(卵磷脂)(PC)、磷脂酰絲氨酸(PS)，和磷酸肌醇，所述磷酸肌醇包括但不限于磷脂酰肌醇(PD、磷酸磷脂酰肌醇(PIP)、ニ磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)和三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)。PC的另外實(shí)例包括如本領(lǐng)域中所定義的DDPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DRPC，和 DEPC?；钚晕锶绫疚氖褂玫男g(shù)語“活性物”是指在真皮環(huán)境中，例如在表皮、表皮傷ロ、痤瘡病灶，和頭皮上有治療活性的試劑。此種活性物包括但不限于抗生素、抗微生物劑、生長因子、過氧化苯甲酰、化療劑，以及影響靶標(biāo)真皮病狀的其它試劑如上述藥劑。例如，當(dāng)施用至表皮或表皮傷ロ時(shí)，萬古霉素可用來治療如下描述的MRSA。成孔毒素如本文使用的術(shù)語“成孔毒素”是指打開靶標(biāo)細(xì)胞的膜中的未調(diào)節(jié)通道的分子。天然存在的成孔分子的實(shí)例包括但不限于α毒素、β毒素、δ毒素、γ毒素,和黃曲霉毒素。合成的成孔毒素的實(shí)例包括表面活性劑,如Triton-X 100 。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到其它天然存在的成孔毒素和合成的成孔毒素。納米粒子穩(wěn)定化的脂質(zhì)體的觸發(fā)活性物釋放本發(fā)明提供了刺激-響應(yīng)性的生物相容性納米粒子-穩(wěn)定化的脂質(zhì)體以及它的觸發(fā)活性物釋放。此類脂質(zhì)體可以選擇性地遞送活性物至真皮靶標(biāo)，所述活性物包括但不限于抗生素、抗微生物劑和其它治療劑?；钚晕镞f送通過激活一種或多種觸發(fā)器來選擇性地執(zhí)行，所述觸發(fā)器包括但不限于真皮pH、天然存在或合成的毒素成孔活性，和光敏觸發(fā)器(例如，經(jīng)由外部UV光源的施加)。當(dāng)此類觸發(fā)器不存在時(shí)，脂質(zhì)體活性物不能被主動(dòng)地釋放。因此，此類脂質(zhì)體還具有在觸發(fā)之前阻止不需要的活性物從脂質(zhì)體中釋放出來的優(yōu)點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了脂質(zhì)體，其包含界定脂質(zhì)體的內(nèi)球面和外表面的脂質(zhì)雙層、利用刺激敏感性鍵連接至脂質(zhì)分子的多個(gè)生物相容性納米粒子，并且進(jìn)一歩包含在內(nèi)球面內(nèi)的藥劑。在某些方面，該多個(gè)生物相容性納米粒子可以結(jié)合至脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)分子的親水頭。在某些方面，該脂質(zhì)分子可以包括磷脂。具體而言，可作為脂質(zhì)膜的一部分的脂質(zhì)分子包括氫化L-α -磷脂酰膽堿和1，2_ ニ-(9Ζ-十八烯?；?-3-三甲基銨基-丙烷。具體而言，脂質(zhì)分子可以包含氫化L-α-磷脂酰膽堿、月桂酸，和硫酸鎂。在某些方面，生物相容性納米粒子可以利用PH敏感性鍵連接至脂質(zhì)分子。在某些方面，生物相容性納米粒子的外表面可以包含陰離子官能團(tuán)。具體而言，該陰離子官能團(tuán)可以是羧酸根。在某些方面，生物相容性納米粒子的直徑為約lnm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、llnm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm 或約 20nm。具體而言，生物相容性納米粒子是金，并且直徑為約4nm。在某些方面，該脂質(zhì)體的外表面包含陽離子官能團(tuán)。在另ー些其它方面，該脂質(zhì)體的直徑可以為約lOnm、Ilnm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm、25nm、26nm、27nm、28nm、29nm、30nm、31nm、32nm、33nm、34nm、35nm、36nm、37nm、38nm、39nm、40nm、41nm、42nm、43nm、44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm、50nm、51nm、52nm、53nm、54nm、55nm、56nm、57nm、58nm、59nm、60nm、61nm、62nm、63nm、64nm、65nm、66nm、67nm、68nm、69nm、70nm、71nm、72nm、73nm、74nm、75nm、76nm、77nm、78nm、79nm、80nm、81nm、82nm、83nm、84nm、85nm、86nm、87nm、88nm、89nm、90nm、91nm、92nm、93nm、94nm、95nm、96nm、97nm、98nm、99nm、lOOnm、lOlnm、102nm、103nm、104nm、105nm、106nm、107nm、108nm、109nm、IIOnm、IIlnm、112nm、113nm、114nm、115nm、116nm、117nm、118nm、119nm、120nm、I2lnm、122nm、123nm、124nm、125nm、126nm、127nm、128nm、129nm、130nm、I3lnm、132nm、133nm、134nm、135nm、136nm、137nm、138nm 、139nm、140nm、14lnm、142nm、143nm、144nm、145nm、146nm、147nm、148nm、149nm、150nm、I5lnm、152nm、153nm、154nm、155nm、156nm、157nm、158nm、159nm、160nm、161nm、162nm、163nm、164nm、165nm、166nm、167nm、168nm、169nm、170nm、I7lnm、172nm、173nm、174nm、175nm、176nm、177nm、178nm、179nm、180nm、18lnm、182nm、183nm、184nm、185nm、186nm、187nm、188nm、189nm、190nm、19lnm、192nm、193nm、194nm、195nm、196nm、197nm、198nm、199nm、200nm、201nm、202nm、203nm、204nm、205nm、206nm、207nm、208nm、209nm、210nm、211nm、212nm、213nm、214nm、215nm、216nm、217nm、21S nm、219nm、220nm、221nm、222nm、223nm、224nm、225nm、226nm、227nm、228nm、229nm、230nm、231nm、232nm、233nm、234nm、235nm、236nm、237nm、238nm、239nm、240nm、241nm、242nm、243nm、244nm、245nm、246nm、247nm、248nm、249nm、250nm、251nm、252nm、253nm、254nm、255nm、256nm、257nm、258nm、259nm、260nm、261nm、262nm、263nm、264nm、265nm、266nm、267nm、268nm、269nm、270nm、271nm、272nm、273nm、274nm、275nm、276nm、277nm、278nm、279nm、280nm、281nm、282nm、283nm、284nm、285nm、286nm、287nm、288nm、289nm、290nm、291nm、292nm、293nm、294nm、295nm、296nm、297nm、298nm、299nm、300nm、400nm，或500nm。具體而言，脂質(zhì)體的直徑為約88nm。在某些方面，生物相容性納米粒子是構(gòu)成脂質(zhì)體表面的約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24% 或 25% 的不可或缺部分(如根據(jù)表面積測得的)。具體而言，生物相容性納米粒子結(jié)合至脂質(zhì)體外表面的約14%。例如，提供了脂質(zhì)體，其中生物相容性納米粒子在中性pH環(huán)境下結(jié)合至脂質(zhì)體表面，其使脂質(zhì)體穩(wěn)定化或者阻止一個(gè)脂質(zhì)體與另ー個(gè)脂質(zhì)體融合。此類生物相容性納米粒子(例如，直徑為 4nm)可以是可生物降解的陽離子納米粒子，包含但不限于使根據(jù)下面提供的實(shí)施例的脂質(zhì)體(例如，直徑為 IOOnm)穩(wěn)定化的金、銀，和合成納米粒子。當(dāng)環(huán)境酸性增加至約pH < 5時(shí)，結(jié)合的生物相容性納米粒子可以從脂質(zhì)體上脫離，導(dǎo)致可以主動(dòng)地與各種生物膜融合的裸露脂質(zhì)體的形成。已充分證明，人皮膚通常是酸性(PH =
3.9 6. O)，尤其皮膚上的感染病灶。例如，該pH值在痤瘡病灶中為約4. O，而在粉刺中為
4.5-6. 3。因此，提供具有可調(diào)融合能力的酸響應(yīng)性脂質(zhì)體用于真皮活性物遞送。
在另ー個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了脂質(zhì)體，其包含界定脂質(zhì)體的內(nèi)球面和外表面的脂質(zhì)雙層、經(jīng)由靜電相互作用與脂質(zhì)分子接觸的多個(gè)生物相容性納米粒子，并且進(jìn)一步包含在內(nèi)球面內(nèi)的藥劑。在某些方面，該 脂質(zhì)分子可以包括磷脂。具體而言，可作為脂質(zhì)膜的一部分的脂質(zhì)分子包括氫化L- α -磷脂酰膽堿和1，2- ニ-(9Ζ-十八烯?；?-3-三甲基銨基-丙烷。具體而言，脂質(zhì)分子可以包含氫化L- α -磷脂酰膽堿、膽固醇和聚乙ニ醇。在某些方面，生物相容性納米粒子的外表面包含陽離子官能團(tuán)。具體而言，該陽離子官能團(tuán)可以是殼聚糖。在某些方面，生物相容性納米粒子的直徑為約lnm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、lOnm、llnm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm或約 20nmo 具體而言，生物相容性納米粒子是金，并且直徑為約4nm。在某些方面，該脂質(zhì)體的外表面包含陰離子官能團(tuán)。在另ー些其它方面，該脂質(zhì)體的直徑可以為約10nm、llnm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm、25nm、26nm、27nm、28nm、29nm、30nm、31nm、32nm、33nm、34nm、35nm、36nm、37nm、38nm、39nm、40nm、41nm、42nm、43nm、44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm、50nm、51nm、52nm、53nm、54nm、55nm、56nm、57nm、58nm、59nm、60nm、61nm、62nm、63nm、64nm、65nm、66nm、67nm、68nm、69nm、70nm、71nm、72nm、73nm、74nm、75nm、76nm、77nm、78nm、79nm、80nm、81nm、82nm、83nm、84nm、85nm、86nm、87nm、88nm、89nm、90nm、91nm、92nm、93nm、94nm、95nm、96nm、97nm、98nm、99nm、lOOnm、10lnm、102nm、103nm、104nm、105nm、106nm、107nm、108nm、109nm、IIOnm、IIlnm、I12nm、I13nm、I14nm、I15nm、I16nm、I17nm、I18nm、I19nm、120nm、I2lnm、122nm、123nm、124nm、125nm、126nm、127nm、128nm、129nm、130nm、I3lnm、132nm、133nm、134nm、135nm、136nm、137nm、138nm、139nm、140nm、141nm、142nm、143nm、144nm、145nm、146nm、147nm、148nm、149nm、150nm、151nm、152nm、153nm、154nm、155nm、156nm、157nm、158nm、159nm、160nm、161nm、162nm、163nm、164nm、165nm、166nm、167nm、168nm、169nm、170nm、I7lnm、172nm、173nm、174nm、175nm、176nm、177nm、178nm、179nm、180nm、18lnm、182nm、183nm、184nm、185nm、186nm、187nm、188nm、189nm、190nm、191nm、192nm、193nm、194nm、195nm、196nm、197nm、198nm、199nm、200nm、201nm、202nm、203nm、204nm、205nm、206nm、207nm、208nm、209nm、210nm、211nm、212nm、213nm、214nm、215nm、216nm、217nm、218nm、219nm、220nm、221nm、222nm、223nm、224nm、225nm、226nm、227nm、228nm、229nm、230nm、231nm、232nm、233nm、234nm、235nm、236nm、237nm、238nm、239nm、240nm、241nm、242nm、243nm、244nm、245nm、246nm、247nm、248nm、249nm、250nm、251nm、252nm、253nm、254nm、255nm、256nm、257nm、258nm、259nm、260nm、261nm、262nm、263nm、264nm、265nm、266nm、267nm、268nm、269nm、270nm、271nm、272nm、273nm、274nm、275nm、276nm、277nm、278nm、279nm、280nm、281nm、282nm、283nm、284nm、285nm、286nm、287nm、288nm、289nm、290nm、291nm、292nm、293nm、294nm、295nm、296nm、297nm、298nm、299nm、300nm、400 或 500nm。具體而言，脂質(zhì)體的直徑為約 88nm。在某些方面，生物相容性納米粒子是構(gòu)成脂質(zhì)體表面的約5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24% 或 25% 的不可或缺部分(如根據(jù)表面積測得的)。具體而言，生物相容性納米粒子結(jié)合至脂質(zhì)體外表面的約 14%。在另ー個(gè)實(shí)施例中，提供了可選擇性地遞送活性物至靶向的真皮部位、由成孔毒素觸發(fā)的脂質(zhì)體。在各個(gè)方面，成孔毒素在靶向的真皮部位處打開脂質(zhì)體中的孔從而釋放活性物。在此種情況下，生物相容性納米粒子不必從脂質(zhì)體膜上脫離來釋放它的活性物。一旦脂質(zhì)體與分泌毒素的細(xì)菌接觸，它們就為讓毒素插入到脂質(zhì)體膜中作準(zhǔn)備并且形成孔，納米粒子穩(wěn)定化的脂質(zhì)體通過該孔釋放治療劑。被釋放的藥物隨后對毒素分泌細(xì)菌施加抗微生物作用。使用耐甲氧西林(Methicillin)的金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) (MRSA)作為模型細(xì)菌以及使用萬古霉素作為模型抗-MRSA抗生素，本文的實(shí)施例證明合成的納米粒子穩(wěn)定化的脂質(zhì)體可以在MRSA細(xì)菌的存在下在24h內(nèi)完全釋放包封的萬古霉素，并且與等量的萬古霉素負(fù)載的脂質(zhì)體(不含納米粒子穩(wěn)定劑)和游離萬古霉素一樣有效地抑制MRSA生長。在各個(gè)方面，本發(fā)明包括包含上述脂質(zhì)體的藥劑遞送系統(tǒng)。在某些方面，該藥劑可以與藥物學(xué)上可接受的媒介物一起配制。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了用于治療疾病的方法，該方法包括經(jīng)由上述藥劑遞送系統(tǒng)將治療有效量的活性物施用至需要其的患者。在某些方面，該藥物可以是過氧化苯甲?；蛟鹿鹚?。在某些方面，該疾病可以是皮膚疾病。具體而言，該皮膚疾病可以是痤瘡丙酸桿菌感染或金黃色葡萄球菌感染。
在各個(gè)方面，本發(fā)明包括用于制備上述脂質(zhì)體的方法。該方法涉及將生物相容性納米粒子與脂質(zhì)體組合在一起。在某些方面，生物相容性納米粒子的表面可以包含陰離子官能團(tuán)或陽離子官能團(tuán)。具體而言，生物相容性納米粒子的表面可以包含包括羧酸根的殼聚糖。在某些方面，生物相容性納米粒子是金，并且直徑為約Inm至約20nm。具體而言，生物相容性納米粒子的直徑可以為約4nm。在某些方面，脂質(zhì)體可以包含磷脂。具體而言，月旨質(zhì)體可以包含氫化L- α -磷脂酰膽堿和I，2- ニ - (9Ζ-十八烯酰基)-3-三甲基銨基-丙烷。具體而言，脂質(zhì)體可以包含氫化L-α-磷脂酰膽堿、月桂酸，和硫酸鎂。具體而言，月旨質(zhì)分子可以包含氫化L-α -磷脂酰膽堿、膽固醇和聚こニ醇。在某些方面，生物相容性納米粒ナ的直徑為約 lnm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、lOnm、llnm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm或約20nm。具體而言，生物相容性納米粒子是金，并且直徑為約4nm。在某些方面，脂質(zhì)體的外表面包含陰離子官能團(tuán)。在另ー些其它方面，脂質(zhì)體的直徑可以為約 lOnm、llnm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm、25nm、26nm、27nm、28nm、29nm、30nm、3lnm、32nm、33nm、34nm、35nm、36nm、37nm、38nm、39nm、40nm、41nm、42nm、43nm、44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm、50nm、51nm、52nm、53nm、54nm、55nm、56nm、57nm、58nm、59nm、60nm、61nm、62nm、63nm、64nm、65nm、66nm、67nm、68nm、69nm、70nm、71nm、72nm、73nm、74nm、75nm、76nm、77nm、78nm、79nm、80nm、81nm、82nm、83nm、84nm、85nm、86nm、87nm、88nm、89nm、90nm、91nm、92nm、93nm、94nm、95nm、96nm、97nm、98nm、99nm、lOOnm、lOlnm、102nm、103nm、104nm、105nm、106nm、107nm、108nm、109nm、IlOnm、11lnm、112nm、113nm、114nm、115nm、116nm、117nm、118nm、119nm、120nm、12lnm、122nm、123nm、124nm、125nm、126nm、127nm、128nm、129nm、130nm、I3lnm、132nm、133nm、134nm、135nm、136nm、137nm、138nm、139nm、140nm、141nm、142nm、143nm、144nm、145nm、146nm、147nm、148nm、149nm、150nm、151nm、152nm、153nm、154nm、155nm、156nm、157nm、158nm、159nm、160nm、161nm、162nm、163nm、164nm、165nm、166nm、167nm、168nm、169nm、170nm、17lnm、172nm、173nm、174nm、175nm、176nm、177nm、178nm、179nm、180nm、18lnm、182nm、183nm、184nm、185nm、186nm、187nm、188nm、189nm>190nm、191nm、192nm、193nm、194nm、195nm、196nm、197nm、198nm、199nm、200nm、201nm、202nm、203nm、204nm、205nm、206nm、207nm、208nm、209nm、210nm、211nm、212nm、213nm、214nm、215nm、216nm、217nm、218nm、219nm、220nm、221nm、222nm、223nm、224nm、225nm、226nm、227nm、228nm、229nm、230nm、231nm、232nm、233nm、234nm、235nm、236nm、237nm、238nm、239nm、240nm、241nm、242nm、243nm、244nm、245nm、246nm、247nm、248nm、249nm、250nm、251nm、252nm、253nm、254nm、255nm、256nm、257nm、258nm、259nm、260nm、261nm、262nm、263nm、264nm、265nm、266nm、267nm、268nm、269nm、270nm、271nm、272nm、27 3nm、274nm、275nm、276nm、277nm、278nm、279nm、280nm、281nm、282nm、283nm、284nm、285nm、286nm、287nm、288nm、289nm、290nm、29lnm、292nm、293nm、294nm、295nm、296nm、297nm、298nm、299nm、300nm、400nm，或 500nm。具體而言，脂質(zhì)體的直徑為約88nm。在某些方面，生物相容性納米粒子是構(gòu)成脂質(zhì)體表面的約 5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%>12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20%,21 %、22 %、23 %、24%或25%的不可或缺部分(如根據(jù)表面積測得的)。具體而言，生物相容性納米粒子結(jié)合至脂質(zhì)體外表面的約14%。提供了穩(wěn)定地儲(chǔ)存藥劑和活性物的方法。如上所述，在觸發(fā)的活性物釋放之前，活性物可以被穩(wěn)定地儲(chǔ)存。經(jīng)由納米粒子脫離的觸發(fā)活性物釋放本發(fā)明提供了刺激響應(yīng)性生物相容性納米粒子穩(wěn)定化的脂質(zhì)體，其中生物相容性納米粒子在中性pH環(huán)境下結(jié)合至脂質(zhì)體表面并因而使脂質(zhì)體穩(wěn)定化。當(dāng)環(huán)境酸性増加至約pH < 5時(shí)，結(jié)合的生物相容性納米粒子與脂質(zhì)體脫離，導(dǎo)致可以主動(dòng)地與各種生物膜融合的裸露脂質(zhì)體的形成。人皮膚通常是酸性(pH = 3. 9 6. O)，尤其皮膚上的感染病灶。例如，該pH值在痤瘡病灶中為約4. 0，而在粉刺中為4. 5-6. 3。因此，具有可調(diào)融合能力的酸性響應(yīng)性脂質(zhì)體對于真皮活性物遞送有效。參見，例如，Pornpattananangkul,D.等,ACSNano 2010，4，1935-1942，其以引用的方式完整地并入本文。羧基修飾的生物相容性納米粒子在介導(dǎo)磷脂脂質(zhì)體的融合活性方面的應(yīng)用在圖I中示出，其中使用的是金納米粒子。羧基的pKa ^ 5,它在pH = 7時(shí)去質(zhì)子化,導(dǎo)致產(chǎn)生帶負(fù)電荷的Au-COO-納米粒子,帶負(fù)電荷的Au-COO-納米粒子通過靜電引力結(jié)合至陽離子脂質(zhì)體并因而使脂質(zhì)體穩(wěn)定化。當(dāng)環(huán)境PH下降至5以下時(shí)，羧酸基團(tuán)被質(zhì)子化。由此產(chǎn)生的中性Au-COOH納米粒子由于缺少結(jié)合力而與脂質(zhì)體表面脫離，由此使脂質(zhì)體游離。選擇金納米粒子用于這個(gè)實(shí)例以及下面的實(shí)施例，因?yàn)楫?dāng)將一小部分熒光染料摻雜在脂質(zhì)體膜中時(shí)，金納米粒子的熒光猝滅特性可用來指示它們的結(jié)合和脫離過程和程度。而且，金是具有對抗廣泛類型的細(xì)菌的抗微生物活性的生物相容性貴金屬。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到具有類似性質(zhì)的替代納米粒子，包括如上所定義的那些如銀和合成的生物相容性納米粒子如聚苯こ烯。通過熟知的擠出方法(Mayer,L. D.等，Vesicles of Variable SizesProducedby a Rapid Extrusion Procedure. Biochim. Biophys. Acta 1986,858,161-168),制備由90重量％氫化L- α -憐脂酸膽喊(蛋PC)和10重量％ I, 2_ ニ -(9Z-十八烯酸基)_3_ ニ甲基銨基-丙烷(DOTAP)組成的陽離子磷脂脂質(zhì)體。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測量顯示，所形成的脂質(zhì)體的粒度和表面ζ電位分別為88.0±1.0nm和24.9±2. 3mV(圖2)。該正的ζ電位值指示DOTAP摻入到脂質(zhì)體膜中。在単獨(dú)的反應(yīng)中，按照此前公布的方案(Aryal，S.等，Spectroscopic Identification of S-AuInteraction in Cysteine Capped GoldNanoparticles. Spectrochim. Acta A2006,63,160-163 ;Patil, V.等，Role of ParticleSize in Individual anticompetitive Diffusion of Carboxylic Acid DerivatizedColloidal GoldParticles in Thermally Evaporated Fatty Amine Films. Langmuir1999，15,8197-8206)合成AuC納米粒子，產(chǎn)生的AuC具有通過掃描透射電子顯微鏡(STEM)測得的 4nm的幾乎均勻的粒度(圖3)，和通過DLS測定的-25. 6±4. 2mV的負(fù)表面ζ電位。將合成的陽離子脂質(zhì)體和AuC納米粒子以I : 200的摩爾比在溫和的浴超聲處理(bathsonication)下混合lOmin,從而形成AuC-脂質(zhì)體。通過以1.3X104rpm離心IOmin來除去溶液中的過量AuC，從而確保隨后的粒度和表面ζ電位測量結(jié)果完全來自AuC-脂質(zhì)體，而不來自未結(jié)合AuC粒子。DLS數(shù)據(jù)顯示，AuC-脂質(zhì)體的粒度為92.9± I. 3nm并且表面ζ電位為-25. 3±0. 7mV(圖2)。所測得的AuC-脂質(zhì)體粒度稍大于裸露脂質(zhì)體的粒度，這是由4nmAuC納米粒子的吸附造成的，同時(shí)從24.9mV到-25. 3的ζ電位變化清楚地掲示帶負(fù)電荷的AuC與帶正電荷的脂質(zhì)體的結(jié)合。通過STEM對AuC-脂質(zhì)體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)進(jìn)一歩成像。如圖3AB所示，在將脂質(zhì)體放置在TEM載網(wǎng)上后，在脂質(zhì)體表面上可見各個(gè)AuC粒子。在STEM上使用能量色散X射線型(EDX)光譜儀，我們可以基本上鑒定出圖3AB中的某些區(qū) 域含有Au，而其它區(qū)域僅含有在脂質(zhì)體中發(fā)現(xiàn)的元素如碳和磷。通過DLS測得脫水脂質(zhì)體的粒度大于水化脂質(zhì)體的粒度，這是由于脂質(zhì)體從三維球體塌陷成ニ維薄層。為了進(jìn)一步證實(shí)AuC納米粒子與脂質(zhì)體表面的結(jié)合，將一部分熒光標(biāo)記的脂質(zhì)，1,2- ニ豆蘧酰-sn-甘油-3-磷酸こ醇胺-N-麗絲胺若丹明B磺酰基(DMPE-RhB，激發(fā)/發(fā)射=550nm/590nm)摻雜到脂質(zhì)體膜中。預(yù)計(jì)，因?yàn)闊晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移(FRET)機(jī)制，AuC結(jié)合將會(huì)猝滅在AuC粒子的下方或附近的熒光染料。將AuC納米粒子與熒光標(biāo)記的脂質(zhì)體以在從O至280的范圍內(nèi)的摩爾比(MAuC/ML)混合。記錄在590nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度，并且如下計(jì)算猝滅產(chǎn)量猝滅產(chǎn)量) = (1-1^。-し/1し)\100，其中Iaic-L和IL分別表示RhB-標(biāo)記的脂質(zhì)體在存在和不存在AuC納米粒子的情況下的熒光強(qiáng)度。如圖4A所示，當(dāng)MAue/X比率增加時(shí)，猝滅產(chǎn)量增高并且在MAue/X = 280時(shí)達(dá)到100%。因?yàn)橹|(zhì)體和AuC納米粒子的直徑分別為約88nm和4nm，所以如果假定所有AuC都附連在脂質(zhì)體表面上，那么AuC在脂質(zhì)體表面上的表面覆蓋率在MaucZMl比等于280 I時(shí)為約14%。根據(jù)FRET機(jī)制，吸附的AuC粒子不僅可以有效地猝滅AuC下方的DMPE-RhB探針，而且可以有效地猝滅在AuC粒子周圍的2 5nm區(qū)域內(nèi)的DMPE-RhB探針。這將會(huì)導(dǎo)致接近100%的理論猝滅產(chǎn)量，這與已在圖4A中觀察到的結(jié)果一致。雖然較多的AuC粒子可能可以吸附到 86%的未被占用(unoccupied)的脂質(zhì)體表面上,但是進(jìn)ー步的研究證明當(dāng)將較多的AuC添加到該溶液中至超= 280的完全猝滅點(diǎn)吋，猝滅產(chǎn)量仍然為100%的穩(wěn)定水平。圖4A插圖示出在470nm的激發(fā)波長下，具有不同MAlC/X比率的AuC-脂質(zhì)體在500_650nm范圍內(nèi)的代表性熒光發(fā)射光譜。這個(gè)激發(fā)波長可以有效地激發(fā)摻雜在脂質(zhì)體膜中的DMPE-RhB探針，同時(shí)將熒光發(fā)射光譜受到的干擾減至減小。不受特定理論的束縛，本發(fā)明提出當(dāng)環(huán)境pH值降低至羧酸的pKa值以下時(shí)，帶負(fù)電荷的Au-COCT將被質(zhì)子化從而形成中性Au-COOH，中性Au-COOH由于靜電引力的消除而可從陽離子脂質(zhì)體表面上脫離。隨后，AuC的脫離將會(huì)誘導(dǎo)摻雜在脂質(zhì)體中的DMPE-RhB探針的熒光恢復(fù)。為了測試這一點(diǎn)，使用MAue/X比率為200的AuC-脂質(zhì)體溶液來研究在各種pH值環(huán)境下DMPE-RhB的相對熒光恢復(fù)產(chǎn)量。使用由鄰苯ニ甲酸氫鉀或磷酸ニ氫鉀組成的、最終鹽濃度為5mM的緩沖溶液，將AuC-脂質(zhì)體溶液的pH調(diào)節(jié)至在從pH = 7至pH = 3的范圍內(nèi)的期望值。記錄在各種PH值環(huán)境下的AuC-脂質(zhì)體溶液在590nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度?？紤]到懸浮在熒光標(biāo)記的脂質(zhì)體溶液中的脫離的AuC納米粒子也可能會(huì)通過無規(guī)碰撞猝滅DMPE-RhB染料，因此使用相對恢復(fù)產(chǎn)量描述在pH變化后的熒光恢復(fù)。將在每個(gè)pH點(diǎn)處的AuC-脂質(zhì)體的熒光強(qiáng)度用與相同量的裸露金納米粒子(AuB)混合的脂質(zhì)體的熒光強(qiáng)度進(jìn)行歸一化，裸露金納米粒子(AuB)是不含羧基修飾和Au-COOH特性的中性粒子。相對恢復(fù)產(chǎn)量定義如下相對恢復(fù)產(chǎn)量) = IAlC-L/IAuB-LX100，其中Iaic-L和Iaub-L表示AuC穩(wěn)定化的脂質(zhì)體，以及與AuC-脂質(zhì)體具有相同濃度的脂質(zhì)體和AuB的混合物在各種pH值環(huán)境下的熒光強(qiáng)度。如圖4B所示，當(dāng)pH值從7降低至5. 5時(shí)，DMPE-RhB標(biāo)記的AuC-脂質(zhì)體的相對恢復(fù)產(chǎn)量從23%輕微降低至18%。然后，當(dāng)使pH值進(jìn)ー步從5. 5降低至3時(shí)，它從18%顯著增大至約55%。從pH = 7到pH = 5. 5的相對恢復(fù)產(chǎn)量的輕微降低指示與在pH = 7時(shí)的情況相比，在pH = 5. 5時(shí)較多的AuC粒子吸附在脂質(zhì)體上或者在AuC與脂質(zhì)體之間發(fā)生較強(qiáng)的結(jié)合。這可能是因?yàn)殛栯x子脂質(zhì)DOTAP在較低的 pH環(huán)境下變得帶有更多的正電荷，導(dǎo)致在AuC與脂質(zhì)體之間產(chǎn)生較強(qiáng)的電荷-電荷引力。而當(dāng)pH值低于5. 5在5. 5 3范圍內(nèi)吋，AuC的質(zhì)子化影響比任何其它影響都占優(yōu)勢，它顯著弱化靜電引力。因此，從脂質(zhì)體表面脫離的AuC導(dǎo)致高熒光恢復(fù)。圖4B插圖示出在470nm的激發(fā)波長下，在從7至3范圍內(nèi)的不同pH值環(huán)境下的AuC-脂質(zhì)體在500-650nm范圍內(nèi)的代表性熒光發(fā)射光譜。這些熒光恢復(fù)結(jié)果與在不同PH值環(huán)境下的AuC-脂質(zhì)體的表面ζ電位測量結(jié)果一致。AuC-脂質(zhì)體的表面ζ電位從在pH = 7時(shí)的-25. 3±0. 7mV增大至在pH = 4時(shí)的+30. 1 + 2. ImV,指示在酸性pH環(huán)境下AuC從脂質(zhì)體表面脫離。AuC-脂質(zhì)體在pH = 4時(shí)的表面ζ電位略高于裸露脂質(zhì)體在pH = 7時(shí)的表面ζ電位，24.9±2.311^(圖28)，這可能是因?yàn)殛栯x子脂質(zhì)DOTAP在酸性pH環(huán)境下帶有更多的正電荷。通過在經(jīng)由適當(dāng)?shù)碾x心除去未結(jié)合AuC之后分別測量AuC-脂質(zhì)體在pH = 7和pH=4的環(huán)境下的UV可見吸收，進(jìn)ー步檢查AuC與脂質(zhì)體表面在中性pH環(huán)境下的結(jié)合和在酸性pH環(huán)境下的脫離。這里，使用HCl而不使用緩沖溶液調(diào)節(jié)AuC-脂質(zhì)體溶液的pH，因?yàn)榫彌_劑的某些UV吸收能被檢測到。在將AuC-穩(wěn)定化的陽離子脂質(zhì)體(未用熒光標(biāo)記)與HCl分別在pH = 7和pH = 4的環(huán)境下培育IOmin后，對AuC-脂質(zhì)體溶液離心從而使未結(jié)合AuC納米粒子沉淀析出。然后,記錄由此產(chǎn)生的上清液在300nm至700nm范圍內(nèi)的UV可見吸收光譜，如圖5所示。在pH = 7時(shí)，清晰地檢測到AuC的UV吸收光譜，但在pH = 4時(shí)卻不能。觀察到的UV吸收光譜與如圖5插圖中所示的上清液的色差一致。在pH = 7吋，觀察到少量的粒子沉淀物，而上清液的顏色仍然為紅色，其為金納米粒子的特征。相比之下，在pH = 4吋，出現(xiàn)大量粒子沉淀物，并且上清液的顏色變得透明。然后，使用DLS對這種透明上清液測量粒度和表面ζ電位，得到的結(jié)果與裸露脂質(zhì)體的結(jié)果類似。這些數(shù)據(jù)掲示，當(dāng)pH值(例如,pH = 7)高于羧酸的pKa ( 5)時(shí),AuC為去質(zhì)子化形式(Au_C00_)并因而強(qiáng)有力地結(jié)合至陽離子脂質(zhì)體。因此離心力不能使它們與脂質(zhì)體分離。然而，當(dāng)PH值(例如，pH = 4)低于pKa值時(shí)，AuC被質(zhì)子化為不再吸附在脂質(zhì)體上的Au-COOH形式。通過離心很容易將未結(jié)合Au-COOH粒子從該溶液中分離出來。在證明AuC納米粒子在環(huán)境酸性變化后可以結(jié)合至以及脫離于陽離子脂質(zhì)體之后，檢查AuC納米粒子介導(dǎo)的脂質(zhì)體的可控融合活性。為此，制備由蛋PC和月桂酸(LA)組成的陰離子脂質(zhì)體，將該陰離子脂質(zhì)體與AuC-穩(wěn)定化的陽離子脂質(zhì)體在不同pH值環(huán)境下混合。預(yù)計(jì)，在AuC被質(zhì)子化并且與陽離子脂質(zhì)體脫離后，裸露的陽離子脂質(zhì)體將緊密地結(jié)合至陰離子脂質(zhì)體并與陰離子脂質(zhì)體緊密地融合。為了監(jiān)測融合過程和融合程度，用發(fā)色團(tuán)的FRET對預(yù)先標(biāo)記陰離子脂質(zhì)體，并在將FRET-標(biāo)記的陰離子脂質(zhì)體與AuC-穩(wěn)定化的陽離子脂質(zhì)體分別在PH = 7和pH = 4的環(huán)境下混合后，測量FRET信號(hào)的變化。FRET是基于兩個(gè)發(fā)色團(tuán)的能量轉(zhuǎn)移機(jī)制在分子水平上精確地測量兩個(gè)對象的距離的廣泛使用的技木。當(dāng)該兩個(gè)發(fā)色團(tuán)極為接近(く IOnm)時(shí)，被激發(fā)的供體可以通過非輻射性長程偶扱-偶極耦合機(jī)制將能量轉(zhuǎn)移至接受體。這里，我們將熒光供體(C6NBD :激發(fā)/發(fā)射=470nm/520nm)和熒光接受體(DMPE-RhB :激發(fā)/發(fā)射=550nm/590nm)摻入到陰離子脂質(zhì)體的脂質(zhì)膜中。通過控制供體與接受體的摩爾比，使得在熒光陰離子脂質(zhì)體中，來自供體的熒光發(fā)射完全被接受體猝滅。如果陰離子脂質(zhì)體與陽離子脂質(zhì)體融合，那么供體和接受體發(fā)色團(tuán)在陽離子脂質(zhì)體內(nèi)的散布將會(huì)降低或消除FRET效率，導(dǎo)致供體的熒光恢復(fù)。對于這種融合實(shí)例，首先使用緩沖溶液分別將AuC-穩(wěn)定化的陽離子脂質(zhì)體(MAuC/ML = 200)調(diào)節(jié)至pH = 7和pH = 4。由此產(chǎn)生的未結(jié)合AuC納米粒子通過以
I.3X104rpm離心IOmin來除去，以便消除溶液中的游離AuC通過無規(guī)碰撞產(chǎn)生的熒光猝滅影響。隨后，將該陽離子脂質(zhì)體與FRET-標(biāo)記的陰離子脂質(zhì)體以7 I的摩爾比混合。然后在470nm的波長處激發(fā)該混合物，并記錄在500-650的范圍中的熒光發(fā)射光譜，如圖4A所示。因?yàn)闊晒饨邮荏wDMPE-RhB也在470nm處被激發(fā)，由此在590nm處產(chǎn)生主發(fā)射峰，所以我們放大至主要來自C6NBD的500-540nm發(fā)射窗ロ(圖6B)。我們發(fā)現(xiàn)與在pH = 7時(shí)的情況相比，在PH = 4時(shí)發(fā)生顯著的C6NBD熒光恢復(fù)。最佳的解釋是在pH = 7時(shí)Au-COO-納米粒子強(qiáng)有力結(jié)合至陽離子脂質(zhì)體并且阻止陽離子脂質(zhì)體與陰離子脂質(zhì)體融合。然而，在PH=4時(shí)質(zhì)子化的Au-COOH納米粒子與陽離子脂質(zhì)體脫離，導(dǎo)致產(chǎn)生與陰離子脂質(zhì)體有效融合的裸露陽離子脂質(zhì)體。為了排除PH調(diào)節(jié)影響陰離子脂質(zhì)體內(nèi)的FRET效率的可能性，將調(diào)節(jié)至相應(yīng)PH值和濃度并且沒有與陽離子脂質(zhì)體混合的FRET-標(biāo)記的陰離子脂質(zhì)體用作陰性對照。當(dāng)在470nm處激發(fā)對照樣品時(shí)，在pH = 7和pH = 4時(shí)在530nm處沒有檢測到比較大的熒光發(fā)射差異。另外，將AuB納米粒子(中性并且沒有羧基修飾)用作陽性對照。在pH = 7和pH = 4時(shí)都出現(xiàn)C6NBD在530nm處的強(qiáng)熒光發(fā)射，指示AuB在中性和酸性pH值環(huán)境下都沒有緊密地結(jié)合至陽離子脂質(zhì)體以致于未能阻止它們與陰離子脂質(zhì)體融合。圖6C強(qiáng)調(diào)AuC-陽離子脂質(zhì)體和陰離子脂質(zhì)體與AuB-陰離子脂質(zhì)體和陰離子脂質(zhì)體相比的相對融合效率，以具有相應(yīng)PH值和濃度的単獨(dú)陰離子脂質(zhì)體作為背景。在不同pH值環(huán)境下
的相對融合日を力計(jì)算如下相對融合(% )=(エ53(1, AuC_l53(l, H2。)/ (し。，AuB_l53(l, H2。)X 100,其中
I53O, Auc表示與陰離子脂質(zhì)體混合的AuC-陽離子脂質(zhì)體在530nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度，I53tl, AuB表示與陰離子脂質(zhì)體混合的AuB-陽離子脂質(zhì)體在530nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度；I53(I,H2。表示單獨(dú)的陰離子脂質(zhì)體在530nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度。如圖6C所示，AuC-陽離子脂質(zhì)體的相對融合產(chǎn)量在pH = 7時(shí)為24. 4± I. 6，在pH = 4時(shí)為81. I ± I. 2，指示使用AuC介導(dǎo)脂質(zhì)體的融合活性的可行性。已成功地合成羧基修飾的AuNP (表示AuC，直徑為 4nm)并且已證明它們在不同的pH值環(huán)境下可以結(jié)合至以及脫離于陽離子磷脂脂質(zhì)體，因此使用AuC來控制脂質(zhì)體月桂酸(LipoLA)的融合活性和執(zhí)行皮膚敏感性的月桂酸藥物遞送。羧基的pKa 5，它在pH =7時(shí)去質(zhì)子化，導(dǎo)致產(chǎn)生帶負(fù)電的Au-C00_，Au-C00_可以在ニ價(jià)離子如鎂(Mg2+)的存在下通過靜電引力結(jié)合至LipoLA并因而使該脂質(zhì)體穩(wěn)定化。當(dāng)環(huán)境pH下降至5以下時(shí)，該羧基被質(zhì)子化。由此產(chǎn)生的中性Au-COOH由于缺少結(jié)合力而從LipoLA表面上脫離，由此使脂質(zhì)體游尚。為了制備AuC-Mg-lipoLA，通過熟知的擠出方法(參見上文)制備由蛋PC和LA (3 2重量比)構(gòu)成的lipoLA。在S印hadex G75柱上將未包封的LA從該脂質(zhì)體中分離出來。在単獨(dú)的反應(yīng)中，按照此前公布的方案(參見上文)合成AuC納米粒子。通過將AuB與MPA(4X 10_4M) —起培育過夜來對AuB進(jìn)行羧基官能化。將由此產(chǎn)生的AuC經(jīng)由截留分子量為 IOkDa 的 Amicon Ultra-4 離心過濾器(Mi I lipore, Bi I lerica, MA)洗漆 3 次。將所得的lipoLA、MgSO4和AuC在溫和的浴超聲處理下混合(I 2000 200摩爾比)IOmin以便產(chǎn)生 AuC-Mg-LipoLA。針對痤瘡丙酸桿菌測試在AuC脫離后LipoLA的融合能力的重新激活。將 RhB-AuC-Mg-LipoLA (初始脂質(zhì)濃度為140 μ g/mL)與7. 93 X 108CFU/mL的痤瘡丙酸桿菌混合，并用緩沖溶液將該溶液的PH從4調(diào)節(jié)至7。在室溫下培育15min后，將樣品以13, 200rpm離心5min從而除去過量的RhB-AuC-Mg-LipoLA,并重懸在PBS中。為了確定AuC-Mg-LipoLA對抗痤瘡丙酸桿菌的抗微生物活性，將具有利用緩沖溶液調(diào)節(jié)的4. O至7. O的pH的AuC-Mg-LipoLA與痤瘡丙酸桿菌(5 X 107CFU/mL) —起在37 °C下在厭氧條件下培育期望的培育時(shí)間。(圖9)結(jié)果顯示，在pH 4. O環(huán)境下，AuC-Mg-LipoLA完全滅殺痤瘡丙酸桿菌。痤瘡丙酸桿菌與空脂質(zhì)體溶液(不含LA)和pH為4的緩沖液的培育用作陰性對照。經(jīng)由脂質(zhì)體孔形成的觸發(fā)活性物釋放本發(fā)明還提供了被動(dòng)的靶向活性物遞送平臺(tái)，其中利用成孔毒素等其它觸發(fā)器在靶標(biāo)真皮部位觸發(fā)生物相容性納米粒子穩(wěn)定化的脂質(zhì)體釋放活性物。具體地，提供了被動(dòng)的靶向抗微生物藥物遞送平臺(tái)，其中利用細(xì)菌毒素觸發(fā)用于抑制毒素分泌細(xì)菌生長的金納米粒子穩(wěn)定化的脂質(zhì)體釋放抗生素。在一個(gè)實(shí)例中，對脂質(zhì)體組成和殼聚糖修飾的金納米粒子在脂質(zhì)體表面上的覆蓋進(jìn)行優(yōu)化，使得脂質(zhì)體融合活性和不期望的藥物泄漏在正常儲(chǔ)存條件下受到阻止，同時(shí)該脂質(zhì)體仍然易感于成孔毒素。一旦與毒素培育，該脂質(zhì)體就會(huì)出現(xiàn)漏泄并且活性物，在這種情況下的包封抗生素有效載荷就會(huì)通過毒素形成的孔迅速釋放。進(jìn)ー步證明，在毒素分泌細(xì)菌的存在下，在24h內(nèi)100%的活性物，在這種情況下的包封抗生素從金納米粒子穩(wěn)定化的脂質(zhì)體中釋放出來并且釋放的抗生素有效地抑制細(xì)菌生長。這種抗微生物藥物遞送途徑提供了通過在感染部位特異性地釋放藥物，同時(shí)將脫靶效應(yīng)減至最小來治療細(xì)菌感染的新范式。雖然萬古霉素在這項(xiàng)研究中用作抗耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)抗生素，但是這種技術(shù)可以被推廣為選擇性地遞送用于治療由分泌成孔毒素的細(xì)菌和其它生物引起的各種病狀的活性物。另外，這種技術(shù)可以被推廣為選擇性地遞送用于治療其它病狀的活性物至靶標(biāo)真皮部位。在又一個(gè)實(shí)例中，這種系統(tǒng)可以經(jīng)修改用于遞送化療劑至癌性真皮病灶如黑素瘤。多柔比星(Doxorubicin)是可被選擇性地遞送至黑素瘤病灶的活性物的實(shí)例，可通過經(jīng)由在癌性病灶部位施加合成的成孔毒素如Tdton-X 100 觸發(fā)多柔比星的釋放。
如下面實(shí)施例中提供的，使用MRSA作為模型細(xì)菌以及使用萬古霉素作為模型抗-MRSA抗生素，證明合成的金納米粒子穩(wěn)定化的脂質(zhì)體在MRSA細(xì)菌的存在下在24h內(nèi)完全釋放包封的萬古霉素，并且與等量的萬古霉素負(fù)載的脂質(zhì)體(不含納米粒子穩(wěn)定劑)和游離萬古霉素ー樣有效地抑制MRSA生長。這種細(xì)菌毒素啟動(dòng)(enabled)的納米粒子穩(wěn)定化的脂質(zhì)體的藥物釋放提供了用于治療細(xì)菌感染的新的安全有效途徑。這種技術(shù)可以廣泛地應(yīng)用于治療由分泌成孔毒素的細(xì)菌引起的多種感染。本領(lǐng)域技術(shù)人員將很容易意識(shí)到此類化合物，包括如上定義的那些。本發(fā)明提出納米粒子穩(wěn)定化的脂質(zhì)體與等量的萬古霉素負(fù)載的脂質(zhì)體(不含納米粒子穩(wěn)定劑)和游離萬古霉素ー樣有效，這證明納米粒子穩(wěn)定化的 脂質(zhì)體制劑在提高藥物效カ和克服藥物抗性方面的潛能。其次，基于脂質(zhì)體的制劑的受控藥物釋放一直被認(rèn)為是具有挑戰(zhàn)性的。本文的實(shí)施例利用毒素的成孔特性并且開發(fā)出以受控方式釋放包封的藥物的仿生策略。在各個(gè)方面，釋放的藥物量被自我調(diào)節(jié)并且與細(xì)菌活力相關(guān)。這種相關(guān)性具有重要意義，因?yàn)樗梢杂行У貙⑺幬锶肀┞逗兔摪羞f送減至最低，并且可以提高所遞送藥物的效力。代替使用靶向配體將藥物載體主動(dòng)地靶向至目標(biāo)細(xì)菌，本發(fā)明利用成孔分子如靶標(biāo)細(xì)菌分泌的毒素，并且利用它們觸發(fā)活性物到靶標(biāo)真皮部位的釋放。在各個(gè)方面，此類納米粒子穩(wěn)定化的脂質(zhì)體的使用可以滅殺靶標(biāo)細(xì)菌。使用這種途徑，藥物在與靶標(biāo)細(xì)菌接觸前被保護(hù)在脂質(zhì)體內(nèi)并且不被釋放，由此消除由于過早的藥物泄漏或非特異性藥物釋放引起的不利副作用。作為概念驗(yàn)證，實(shí)施例中證明了細(xì)菌毒素可以用來觸發(fā)金納米粒子穩(wěn)定化的磷脂脂質(zhì)體釋放抗生素，并且釋放的抗生素隨后可以抑制，在非限制性實(shí)例中的分泌該毒素的金黃色葡萄球菌細(xì)菌的生長。如上所述，存在具有成孔活性的多種分子，包括細(xì)菌毒素、動(dòng)物毒素、免疫蛋白，以及合成化合物如Triton Χ-100 。α -溶血素，也稱為α -毒素是由金黃色葡萄球菌細(xì)菌分泌的作為分子量為34kDa的水溶性蛋白単體的常見毒素之一。這種蛋白質(zhì)可以自發(fā)地?fù)饺氲街|(zhì)膜中并且自我寡聚化從而形成具有中央孔的七聚結(jié)構(gòu)。該孔尺寸為約2nm，其允許最高約3KDa的小分子被動(dòng)地?cái)U(kuò)散通過該膜。在性質(zhì)上，金黃色葡萄球菌細(xì)菌分泌可結(jié)合至易感細(xì)胞外膜的α-毒素。在結(jié)合時(shí)，迅速的成孔促進(jìn)水、離子和小分子的不受控制的滲透，諸如ATP的重要分子的迅速排放，膜電位和離子梯度的耗散，以及導(dǎo)致細(xì)胞裂解的不可逆的滲透性溶脹。考慮到在細(xì)菌感染部位處的成孔毒素以及它們的成孔活性的極大可用性，本發(fā)明提出可以利用這些侵入性分子從脂質(zhì)體選擇性地釋放包括抗微生物劑在內(nèi)的活性物，所述脂質(zhì)體被小生物相容性的包括金在內(nèi)的納米粒子穩(wěn)定化從而避免不期望的膜-膜融合和藥物泄漏。這種策略允許藥物在感染部位選擇性地釋放從而滅殺毒素分泌細(xì)菌，同時(shí)不對健康組織產(chǎn)生任何有毒副作用。本發(fā)明進(jìn)一歩提供了用于局部治療皮膚細(xì)菌感染的新型脂質(zhì)體制劑的合成，所述制劑被殼聚糖修飾的金納米粒子(AuChi)穩(wěn)定化從而差異地釋放活性物，以及在非限制性實(shí)例中的萬古霉素，從而抑制在又一個(gè)非限制性實(shí)例中的金黃色葡萄球菌細(xì)菌的生長。
圖11示出毒素觸發(fā)用于治療分泌該毒素的細(xì)菌的金納米粒子穩(wěn)定化的脂質(zhì)體釋放抗生素的工作原理。陽離子AuChi通過靜電引力結(jié)合至帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體表面，因而穩(wěn)定化脂質(zhì)體以使其不彼此融合并且避免不期望的抗生素泄漏。當(dāng)穩(wěn)定化的脂質(zhì)體在金黃色葡萄球菌細(xì)菌附近吋，該細(xì)菌分泌的毒素將會(huì)插入到脂質(zhì)體膜中并創(chuàng)建孔，包封的抗生素通過該孔釋放。釋放的萬古霉素因?yàn)榭拷?xì)菌，所以然后將會(huì)迅速地局部地發(fā)揮它的抗微生物活性。局部施用通過本發(fā)明方法制備的脂質(zhì)體可以充當(dāng)用于治療真皮病狀的藥劑的遞送媒介物，或者充當(dāng)用于合成作為用來治療真皮病狀的藥學(xué)上可接受的活性劑的組合物的中間體，所述真皮病狀包括但不限于MRSA感染和痤瘡丙酸桿菌感染。真皮施用的非限制性實(shí)例包括美國專利第5，830，877號(hào)、第6，245，347號(hào)、第7，754，240號(hào)，因此將與真皮制劑和真皮施用途徑相關(guān)的部分以引用的方式并入本文。通過本發(fā)明方法遞送的藥劑以及在適當(dāng)?shù)那闆r下的它們的藥學(xué)上可接受的鹽可以經(jīng)皮膚和透皮局部施用。被遞送的藥劑量與激活藥劑釋放的觸發(fā)器相關(guān)。這可以包括每天施用約O. Olmg直到約1500mg的劑量，但是可以發(fā)生變化，這取決于受治療人的狀況及他們對所述藥劑的個(gè)體反應(yīng)，以及選定的藥物制劑類型和進(jìn)行此類施用的時(shí)間和間隔期。在一些情況中，低于前述范圍下限的劑量水平可能已足夠有余，而在其它情況下，在不引起任何有害副作用的情況下可以施用更大的劑量。 通過本發(fā)明方法遞送的藥劑以及在適當(dāng)情況下的它們的藥學(xué)上可接受的鹽可以単獨(dú)地或者與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑組合通過此前指出的途徑中的任一種施用。更具體而言，該化合物可以以各種各樣的不同劑型施用，例如它們可以與各種藥學(xué)上可接受的惰性載體組合，以透皮貼劑、粉劑、噴霧劑、霜?jiǎng)?、油膏劑、凝膠劑、凝膠、糊劑、洗剤、膏劑、水懸浮液等形式施用。此類載體包括固體稀釋劑或填充劑、無菌水性介質(zhì)和各種無毒有機(jī)溶剤。因?yàn)樵诓黄x本發(fā)明范圍的情況下可以在上述化合物、產(chǎn)品和方法中作出各種改變，所以意圖包含在上面的描述和下面給出的實(shí)施例中的所有主題都應(yīng)解釋為說明性的而非限制性的。
實(shí)施例本教導(dǎo)的方面可以進(jìn)ー步根據(jù)下列實(shí)施例理解，所述實(shí)施例不應(yīng)被解讀為以任何方式限制本教導(dǎo)的范圍。實(shí)施例I-羧基修飾的金納米粒子的制備羧基修飾的金納米粒子(AuC)的制備根據(jù)完整詳細(xì)地描述在其它文獻(xiàn)(Aryal，b.等，Spectroscopic Identification οι S-Au Interaction inしysteine Capped GoldNanoparticles. Spectrochim. ActaA2006,63, 160-163 ；Patil, V.等，Role of ParticleSize in Individual and CompetitiveDiffusion of Carboxylic Acid DerivatizedColloidal Gold Particles inThermally Evaporated Fatty Amine Films. Langmuir1999，15,8197-8206)中的硼氫化鈉還原方法制備AuC。簡言之，在冰冷的溫度下用O. 005gNaBH4還原HAuCl4水溶液(10-4M，50mL)，由此形成裸露金納米粒子(AuB)。通過將AuB與MPA(巰基丙酸，4X 10_4M)培育過夜來對AuB進(jìn)行羧基官能化。將由此產(chǎn)生的AuC經(jīng)由截留分子量為 IOkDa 的 Amicon Ultra-4 離心過濾器(Millipore, Billerica, MA)洗漆 3 次，并懸浮在pH = 6. 8的水溶液中。脂質(zhì)體和AuC-脂質(zhì)體的制備和表征通過熟知的擠出方法(Mayer，L. D.等，Vesicles of Variable Sizes Produced by a RapidExtrusion Procedure. Biochim.Biophys. Acta 1986，858，161-168)制備由蛋PC(兩性磷脂)和DOTAP (陽離子磷脂)組成的陽離子脂質(zhì)體。簡言之，將I. 5mg蛋PC與DOTAP的混合物(重量比=9 I)溶解在ImL氯仿中。通過在溶液上鼓入氬氣15min來蒸發(fā)溶剤。然后將干燥的脂質(zhì)膜用3mL去離子水水化，接著潤旋Imin并在浴超聲處理器(Fisher Scientific FS30D)中超聲處理3min從而產(chǎn)生多層囊泡(MLV)。使用Ti-探針(Branson 450超聲破碎器)將MLV在20W下超聲處理l_2min從而產(chǎn)生單層囊泡。為了形成窄分布的小單層囊泡(SUV)，將該溶液從具有IOOnm孔尺寸的聚碳酸酯膜中擠出11次。通過將脂質(zhì)體與AuC納米粒子以期望的摩爾比在溫和的浴超聲處理下混合10分鐘來制備AuC-穩(wěn)定化的脂質(zhì)體(AuC-脂質(zhì)體)。
通過使用Malvern Zetasizer ZS (Malvern Instruments, UK)評估所制備的脂質(zhì)體和AuC-脂質(zhì)體的流體動(dòng)力學(xué)尺寸和表面ζ電位。分別通過動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和電泳遷移率測量確定平均直徑和 電位。所有表征測量都在25°C下重復(fù)三次。通過裝配有冷陰極場發(fā)射電子源和潤輪泵主室(turbo-pumped main chamber)的Hitachi HD2000掃描透射電子顯微鏡(STEM)表征AuC-脂質(zhì)體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。用于STEM表征的樣品通過將含有AuC-脂質(zhì)體的溶液分散到碳膜涂覆的Cu網(wǎng)表面上來制備。將該樣品風(fēng)干，然后通過蒸發(fā)用薄無定形碳膜進(jìn)行涂覆。使用提供表面形貌細(xì)節(jié)的二次電子信號(hào)、直接透射的電子束(未被散射的電子)或收集在環(huán)形暗場檢測器上的衍射透射電子，將所有圖像作為掃描束圖像(,scanned beam image) I己求在 STEM 中。熒光猝滅和恢復(fù)研究通過在制備脂質(zhì)體前將0. 5摩爾％ DMPE-RhB與蛋PC和DOTAP混合來制備DMPE-RhB標(biāo)記的脂質(zhì)體。為了監(jiān)測AuC對熒光標(biāo)記的脂質(zhì)體的猝滅效應(yīng)，將AuC與脂質(zhì)體以O(shè)至280范圍內(nèi)的期望摩爾比(MAuC/ML)混合，接著超聲處理lOmin。通過使用突光分光光度計(jì)(Infinite M200, TECAN, Switzerland)在470nm的激發(fā)波長下測量DMPE-RhB在500-650nm的范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜。選擇590nm處的發(fā)射峰來量化熒光粹滅產(chǎn)量。為了研究DMPE-RhB標(biāo)記的AuC-脂質(zhì)體在不同的pH值環(huán)境下的熒光恢復(fù)產(chǎn)量，選擇MAuC/ML = 200的AuC-脂質(zhì)體溶液。使用具有目標(biāo)pH值(對于pH = 3-5為鄰苯ニ甲酸氫鉀緩沖液，而對于PH = 5. 5-7為磷酸ニ氫鉀緩沖液)的適當(dāng)緩沖溶液，將DMPE-RhB標(biāo)記的AuC-脂質(zhì)體調(diào)節(jié)至期望的pH值。姆種AuC-脂質(zhì)體溶液的實(shí)際pH值通過Orion 3-starplus便攜式pH計(jì)測量。在pH調(diào)節(jié)后每種AuC-脂質(zhì)體溶液的鹽濃度為5mM。如前面描述的那樣測量DMPE-RhB的熒光發(fā)射光譜。相同摩爾比的熒光標(biāo)記的脂質(zhì)體與裸露金納米粒子(AuB，無羧基修飾)的混合物用作陽性對照。AuC-脂質(zhì)體在pH = 7和pH = 4的環(huán)境下的UV可見吸收光譜按照上述方案制備AuC-脂質(zhì)體。為了將AuC-脂質(zhì)體溶液的pH值調(diào)節(jié)至pH = 4，使用0. IM HCl,因?yàn)樗粫?huì)引起任何不期望的UV吸收背景。通過以I. 3X104rpm離心IOmin將未結(jié)合AuC從溶液中除去。用分光光度計(jì)記錄在300nm至700nm的范圍內(nèi)的吸收光譜。為了排除來自陽離子脂質(zhì)體和背景的可能UV吸收，測量與AuC-脂質(zhì)體具有相同濃度和pH值的游離脂質(zhì)體(未添加AuC)，將該游離脂質(zhì)體的信號(hào)從所測得的AuC-脂質(zhì)體UV吸收光譜中扣除。所有測量都重復(fù)二次。AuC-脂質(zhì)體融合研究為了研究AuC-脂質(zhì)體在不同的pH值環(huán)境下對抗其它脂質(zhì)體或靶標(biāo)細(xì)胞的融合活性，通過如上所述的擠出方法合成由蛋PC和月桂酸(重量比=9 I)組成的帶負(fù)電荷脂質(zhì)體從而模擬帶負(fù)電荷的細(xì)胞。用發(fā)色團(tuán)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)對、熒光供體(C6NBD，0. I摩爾％ )和熒光猝滅劑(DMPE-RhB，O. 5摩爾％ )標(biāo)記這些陰離子脂質(zhì)體。制備AuC-陽離子脂質(zhì)體(MAuC/ML = 200)溶液井分別將其調(diào)節(jié)至pH = 7和pH = 4。通過以I. 3X 104rpm離心IOmin來除去未結(jié)合AuC納米粒子。將AuC-陽離子脂質(zhì)體的上清液與FRET-標(biāo)記的陰離子脂質(zhì)體以7 I的摩爾比混合。因此，通過使用熒光分光光度計(jì)在470nm處激發(fā)樣品，獲得在500_650nm的范圍處的熒光發(fā)射光譜。將具有相應(yīng)摩爾比和PH值的AuB-陽離子脂質(zhì)體混合物用作陽性對照。將具有相應(yīng)濃度和pH值的単獨(dú)FRET-標(biāo)記的陰離子脂質(zhì)體(未添加陽離子脂質(zhì)體)用作陰性對照。所有測量都在25°C下進(jìn)行并重復(fù)三次。酸響應(yīng)性AuC-Mg-LipoLA的合成為了制備AuC-Mg-lipoLA,首先通過上述擠出方法制備由蛋PC和LA(3 2重量比)構(gòu)成的lipoLA。在S印hadex G75柱上將未包封的LA從該脂質(zhì)體中分離出來。通過硼氫化鈉還原方法制備AuC。在冰冷的溫度下用0.0 05gNaBH4還原HAuCl4水溶液(10_4M，50mL)，由此形成裸露金納米粒子(AuB)。通過將AuB與MPA(4X 10_4M)培育過夜來對AuB進(jìn)行羧基官能化。將由此產(chǎn)生的AuC經(jīng)由截留分子量為IOkDa 的 Amicon Ultra-4 離心過濾器(Millipore, Billerica, MA)洗漆 3 次。將所得的lipoLA、MgSO4和AuC在溫和的浴超聲處理下混合(I 2000 200摩爾比)IOmin以便產(chǎn)生 AuC-Mg-LipoLA。為了將 AuC-Mg-IipoLA 溶液的 pH 值調(diào)節(jié)至 pH = 4，使用 O. IM HCl，因?yàn)樗粫?huì)引起任何不期望的UV吸收背景。通過以I. 3X104rpm離心IOmin將未結(jié)合AuC從溶液中除去。用分光光度計(jì)記錄在300nm至800nm的范圍內(nèi)的吸收光譜。為了排除來自陽離子脂質(zhì)體和背景的可能UV吸收，測量與AuC-脂質(zhì)體具有相同濃度和pH值的游離脂質(zhì)體(未添加AuC)，將該游離脂質(zhì)體的信號(hào)從所測得的AuC-脂質(zhì)體UV吸收光譜中扣除。所有測量都重復(fù)三次。AuC-Mg-LipoLA與痤瘡丙酸桿菌細(xì)菌之間的融合將RhB-AuC-Mg-LipoLA (初始脂質(zhì)體濃度為140 μ g/mL)與7. 93 X 108CFU/mL痤瘡丙酸桿菌混合，并用緩沖溶液將該溶液的pH從4調(diào)節(jié)至7。在室溫下培育15min后,將樣品以13，200rpm離心5min從而除去過量的RhB-AuC-Mg-LipoLA,并重懸在PBS中。因此，通過使用熒光分光光度計(jì)(Infinite M200，TECAN, Switzerland)在550nm處激發(fā)樣品，獲得在580nm處的發(fā)射強(qiáng)度。AuC-Mg-LipoLA對抗痤瘡丙酸桿菌的抗微生物活性為了確定AuC-Mg-LipoLA對抗痤瘡丙酸桿菌的抗微生物活性，將具有利用緩沖溶液調(diào)節(jié)的范圍為4. O至7. O的pH的AuC-Mg-LipoLA與痤瘡丙酸桿菌(5X 107CFU/mL) —起在37°C下在厭氧條件下培育期望的培育時(shí)間。將該樣品在PBS中以I : 10至I : 106稀釋，并將5 μ L稀釋液點(diǎn)在強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基瓊脂板上。將瓊脂板在37°C下在厭氧條件下培育3天，并量化痤瘡丙酸桿菌的CFU(菌落形成単位)。緩沖溶液和空脂質(zhì)體(不含LA，pH 4. O)用作陰性對照。實(shí)施例2-經(jīng)由脂質(zhì)體孔形成的MRSA治療實(shí)驗(yàn)方法材料氫化L-α -磷脂酰膽堿(蛋PC)和膽固醇購自Avanti PolarLipids, Inc.(Alabaster, AL)。Sephadex G-75購自 Fisher Scientific (Pittsburgh,PA)。8-氨基萘-I,3，6-三磺酸ニ鈉鹽(ANTS)和對ニ甲苯-雙吡啶鎗溴鹽(DPX)得自Invitrogen (Carlsbad，CA) ο聚(こニ醇)甲基(Mn = 2000Da)和膜蛋白酶大豆肉湯(Triptic Soy Broth) (TSB)購自 Sigma Aldrich (St Louis, MO)。四氯金酸(HAuCl4)和硼氫化鈉(NaBH4)來自 ACROSOrganics (Geel, Belgium)。殼聚糖-50 購自 Wako PureChemical Industries, Ltd. (Osaka,Japanノ。AuChi和AuChi-脂質(zhì)體的制備和表征通過硼氫化鈉還原技術(shù)(Pornpattananangkul,D.等，ACS Nano2010,4,1935-1942 ；Aryal, S.等，Spectrochim. ActaA2006,63,160-163)制備殼聚糖修飾的金納米粒子(AuChi)。簡言之，在冰冷的溫度下用O. 005g NaBH4還原HAuCl4水溶液(10-4M，50mL)從而制備裸露金納米粒子。然后將獲得的裸露金納米粒子與預(yù)先溶解在O. IMこ酸中的 O. 1% w/v殼聚糖一起培育過夜。將由此產(chǎn)生的AuChi經(jīng)由截留分子量為IOkDa的AmiconUltra-4 離心過濾器(Millipore, Billerica, MA)純化 3 次。按照此前描述的擠出方法制備脂質(zhì)體。簡言之，將9mg脂質(zhì)組分溶解在ImL氯仿中，然后通過在溶液上鼓入氬氣15分鐘來蒸發(fā)有機(jī)溶劑，從而形成干燥的脂質(zhì)膜。將該脂質(zhì)膜用3mL含有ANTS/DPX染料或萬古霉素的去離子水再水化，接著渦旋Imin并在浴超聲處理器(Fisher Scientific FS30D, Pittsburgh, PA)中超聲處理3min從而產(chǎn)生多層囊泡(MLV)。然后用Ti-探針(Branson 450超聲破碎器，Danbury，CT)將所獲得的MLV在20W下超聲處理l_2min從而產(chǎn)生單層囊泡。將該溶液從具有IOOnh孔尺寸的聚碳酸酯膜中擠出11次從而形成窄分布的小單層囊泡(SUV)。通過使用用水或等滲PBS溶液平衡的SephadexG-75柱進(jìn)行凝膠過濾來純化該脂質(zhì)體，從而除去未包封的染料或藥物。為了制備AuChi-穩(wěn)定化的脂質(zhì)體(AuChi-脂質(zhì)體)，使用HCl將AuChi和脂質(zhì)體溶液的pH都調(diào)節(jié)至6. 5。然后將脂質(zhì)體與AuChi以期望摩爾比混合在一起，接著進(jìn)行IOmin的浴超聲處理，從而制備AuChi-脂質(zhì)體。用分光光度計(jì)(InfiniteM200, TECAN,Mannedorf, Switzerland)記錄 AuChi 在從300nm至600nm的UV可見吸收光譜。通過裝配有冷陰極場發(fā)射電子源和渦輪泵主室的掃描透射電子顯微鏡(STEM) (Hitachi HD2000, Tokyo, Japan)表征 AuChi 的形態(tài)。在 200keV加速電壓和20mA電流下操作STEM，并且以二次電子模式和透射電子模式記錄圖像。用EDAX能量色散X射線型光譜儀(EDS)進(jìn)行元素分析。使用Malvern Zetasizer ZS (MalvernInstruments, Worcestershire, UK)測量所制備的AuChi、脂質(zhì)體和AuChi-脂質(zhì)體的流體動(dòng)力學(xué)尺寸和表面ζ電位。分別通過動(dòng)態(tài)光散射(DLS)和電泳遷移率測量確定平均脂質(zhì)體直徑和表面ζ電位。所有表征測量都在25°C下重復(fù)三次。AuChi-脂質(zhì)體的穩(wěn)定性將負(fù)載有12. 5mM ANTS和45mMDPX的脂質(zhì)體與AuChi以不同摩爾比(I OU 150，或I : 300)混合。將獲得的AuChi-脂質(zhì)體與既沒有負(fù)載染料，也沒有被AuChi穩(wěn)定化的裸露脂質(zhì)體以I : 4的摩爾比在室溫下培育lh。然后，將該樣品通過截留分子量為IOOkDa的Microcon YM-100離心過濾器(Millipore,Billerica,MA)以 13. 2X103rpm 過濾 20min。使用熒光分光光度計(jì)(Infinite M200, TECAN, Mannedorf,Switzerland)，在360nm的激發(fā)波長下測量濾液中的ANTS量在510nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度。成孔測定為了研究α -毒素針對脂質(zhì)體的成孔活性，將12. 5mMANTS和45mM DPX共同包封在脂質(zhì)體中，在其中ANTS的熒光被DPX最大程度地猝滅。然后將由此產(chǎn)生的脂質(zhì)體(600 μ g/mL)與α-毒素(20 μ g/mL)在室溫下培育lhr。一旦成孔,包封的染料就會(huì)從脂質(zhì)體中滲漏，導(dǎo)致ANTS的熒光恢復(fù)。培育后，使用熒光分光光度計(jì)在360nm的激發(fā)波長下測量ANTS在510nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度。為了獲得最大的熒光染料泄漏，將TritonX-100 (I %v/v)用作用于使脂質(zhì)體完全裂解的陽性對照。在不存在α-毒素情況下的相應(yīng)濃度的ANTS/DPX用作陰性對照和實(shí)驗(yàn)背景。為了確定最佳的脂質(zhì)體制劑，分別制備由蛋PC和膽固醇(0、10重量％、25重量％、50重量％)構(gòu)成的脂質(zhì)體并裝載ANTS/DPX染料以測試它們的成孔特性。通過將PEG以各種PEG濃度lmg/mL、25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL,或150mg/mL加入到脂質(zhì)體溶液中，評估PEG對脂質(zhì)體成孔特性的影響。毒素觸發(fā)的萬古霉素釋放萬古霉素(10mg/mL)負(fù)載的脂質(zhì)體被AuChi穩(wěn)定化(萬古霉素AuChi-脂質(zhì)體)。為了測量萬古霉素-脂質(zhì)體和萬古霉素AuChi-脂質(zhì)體的載藥產(chǎn)量,將ImL脂質(zhì)體溶液真空干燥2h從而除去所有液體,然后將粒狀物用500L水重構(gòu)。將所獲得的懸浮液以5000rpm離心5min,并收集上清液用于使用Agilent IlOOseries (SantaClara, CA)進(jìn)行反相高效液相色譜(HPLC)分析。將樣品以80 μ L的注射體積注射到ZorbaxC18柱中。使用由こ腈和含有O. 1% (ν/ν)三氟こ酸(TFA)的水構(gòu)成的梯度流動(dòng)相(8-18% 的こ腈，0-20min)以lmL/min的流速進(jìn)行洗脫。用UV/Vis檢測器在280nm處檢測萬古霉素，檢測器溫度為20°C。將獲得的萬古霉素強(qiáng)度與不同濃度的萬古霉素的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，從而計(jì)算出包封在脂質(zhì)體制劑內(nèi)的萬古霉素量。為了測量毒素觸發(fā)脂質(zhì)體釋放的萬古霉素，將該樣品與PEG(100mg/mL)混合，并與耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌菌株MRSA252(lX108CFU/mL) —起在5% (ν/ν)胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)中在37°C下分別培育0.5h和24h。培育后，通過經(jīng)由離心過濾裝置(IOOkDaMWCO)以13. 2X 103rpm過濾20min來分離游離萬古霉素。濾液中的萬古霉素量按照上面描述的方案通過HPLC量化?？刮⑸餃y定將萬古霉素AuChi-脂質(zhì)體與PEG (100mg/mL)混合，并與MRSA252 (I X 108CFU/mL) —起在5% (v/v)TSB中在37°C下培育24h。培育后，用分光光度計(jì)測量該細(xì)菌在600nm處的吸光度從而確定細(xì)菌生長。為了排除來自背景的可能干擾，測量不含MRSA252的相應(yīng)樣品的吸光度并將其從所獲得的0D600中扣除。在該研究中，未用AuChi穩(wěn)定化的萬古霉素負(fù)載的脂質(zhì)體(萬古霉素脂質(zhì)體)和游離萬古霉素用作陽性對照，而AuChi-脂質(zhì)體(不含萬古霉素)和PBS用作陰性對照。所有實(shí)驗(yàn)都重復(fù)三次。結(jié)果和討論為了制備AuChi-脂質(zhì)體，首先按照此前描述的方案通過非原位(ex situ)穩(wěn)定化技術(shù)合成AuChi。簡言之，通過硼氫化鈉還原方法合成金水溶膠，然后將該金水溶膠在環(huán)境條件下用計(jì)算量的殼聚糖進(jìn)行穩(wěn)定化。首先通過1H-NMR譜證實(shí)AuChi的形成。如
圖12A所示，當(dāng)殼聚糖附連至金納米粒子時(shí)，殼聚糖的特征質(zhì)子共振顯著地向高磁場遷移。例如，在游離殼聚糖的光譜中，ct -碳(異頭碳，C-1)上的質(zhì)子在4. 8ppm處的共振峰完全被寬D2O共振掩蓋；β-碳(C-2碳)上的質(zhì)子在2. 9ppm處顯示出共振峰；并且所有其它糖苷質(zhì)子都集中在3. 3ppm至3. 8ppm處。相比之下,在AuChi的1H-NMR譜中，α質(zhì)子和β質(zhì)子分別從4. 8ppm遷移至4. 3ppm以及從2. 9ppm遷移至2. 5ppm。另外,集中在3. 3ppm至3. 8ppm處的對應(yīng)于殼聚糖的糖苷質(zhì)子的寬峰顯著地朝向高磁場遷移并且集中在2. 6ppm至3. 5ppm。質(zhì)子向高磁場的這種顯著遷移可以歸因于它們與金屬中心極為接近以及由金屬中心產(chǎn)生的不均質(zhì)性，這進(jìn)ー步證實(shí)了 AuChi的形成。極為接近金屬中心的質(zhì)子共振的類似遷移此前已在不同氨基酸封端的金納米粒子上觀察到。進(jìn)ー步通過UV-Vis光譜證實(shí)AuChi的形成。如
圖12B所示，AuChi在512nm處顯示出強(qiáng)吸收，其為不含殼聚糖涂層的相應(yīng)裸露金納米粒子的特征。這指示殼聚糖的涂覆沒有改變金納米粒子的等離子共振。通過掃描透射電子顯微鏡(STEM)對AuChi粒子的形態(tài)進(jìn)行成像。提供表面形貌細(xì)節(jié)的二次電子(SE)信號(hào)顯示具有幾乎均勻的粒度分布的AuChi的粒度為 lOnm。直接透射電子(TE)信號(hào)顯示內(nèi)部金核的粒度為 4nm，其與未經(jīng)修飾的金納米粒子的粒度一致?；赟E和TE圖像(
圖12B插圖)，我們得出這樣的結(jié)論粒度從4nm増加至IOnm完全由殼聚糖的涂覆引起，而不是由金粒子的聚集引起。因?yàn)锳uChi的表面特性對于AuChi與脂質(zhì)體的相互作用至關(guān)重要，所以我們接下來通過使用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測量AuChi的電泳遷移率來表征它們的表面ζ電位。AuChi的ζ電位為43. 4± I. OmV，指示粒子表面上存在殼聚糖的陽離子氨基。隨后，通過囊泡擠出技術(shù)制備由氫化L-α-磷脂酰膽堿(蛋PC)和膽固醇(50 50重量比)組成的脂質(zhì)體。為了排除離子強(qiáng)度在表面(電位測量中的干擾，在去離子水中制備脂質(zhì)體。所形成的脂質(zhì)體的 粒度和表面 電位分別為IlOilnm和-14. 1 + 0. 4mV(
圖12C)。然后通過將所合成的脂質(zhì)體與AuChi以I : 300的摩爾比在溫和的浴超聲處理下混合IOmin來制備AuChi-脂質(zhì)體。通過DLS表征由此產(chǎn)生的AuChi-脂質(zhì)體復(fù)合物的粒度和表面ζ電位。測得的AuChi-脂質(zhì)體的粒度稍大于裸露脂質(zhì)體的粒度，掲示IOnm AuChi吸附在脂質(zhì)體表面上。表面ζ電位從-14. 1±0. 4mV顯著地變化至35. 6±0. 4mV(
圖12C)，這證實(shí)帶正電荷的AuChi通過靜電引力結(jié)合至帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體。通過由8-氨基萘-I，3，6-三磺酸ニ鈉鹽(ANTS)和對ニ甲苯-雙吡啶鎗溴鹽(DPX)組成的熒光測定評價(jià)AuChi-脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。ANTS是多陰離子熒光團(tuán)，而DPX是相應(yīng)的陽離子猝滅劑。這對熒光團(tuán)/猝滅劑已被廣泛地用于研究在脂質(zhì)體彼此之間融合或者與其它生物膜融合后的脂質(zhì)體泄漏，并因而用于評價(jià)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。當(dāng)將這兩種染料以適當(dāng)?shù)哪柋裙餐庠谥|(zhì)體內(nèi)吋，DPX通過碰撞猝滅效應(yīng)可以最大程度低猝滅ANTS的熒光發(fā)射。然而，當(dāng)染料負(fù)載的脂質(zhì)體不穩(wěn)定并且與其它物質(zhì)融合時(shí)，該染料將會(huì)從脂質(zhì)體中滲漏出去并被周圍介質(zhì)稀釋。該稀釋將會(huì)減少ANTS與DPX之間的碰撞機(jī)會(huì)，并然后導(dǎo)致ANTS的熒光恢復(fù)。因此，在360nm的激發(fā)波長下，在510nm處的ANTS發(fā)射信號(hào)通常用來測試脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。例如，
圖13A分別示出ANTS/DPX負(fù)載的脂質(zhì)體在PBS中以及在1%TritonXlOO表面活性劑的存在下的熒光發(fā)射信號(hào)?？梢郧宄乜闯?，當(dāng)在PBS緩沖液中的脂質(zhì)體完整時(shí)檢測到的ANTS信號(hào)可忽略不計(jì)，但是在存在膜成孔表面活性劑如TritonX-100的情況下信號(hào)顯著增加。測試具有各種脂質(zhì)體/AuChi摩爾比(例如，I 0、1 150和I : 300)的AuChi-脂質(zhì)體復(fù)合物的穩(wěn)定性。將ANTS和DPX預(yù)先裝載在AuChi-脂質(zhì)體中，然后將每種樣品與裸露脂質(zhì)體以I : 4的摩爾比培育lh。裸露脂質(zhì)體既沒有用AuChi穩(wěn)定化，也沒有負(fù)載該染料對。如果AuChi-脂質(zhì)體與裸露脂質(zhì)體發(fā)生融合，那么預(yù)計(jì)ー些染料將會(huì)從AuChi-脂質(zhì)體中轉(zhuǎn)移至裸露脂質(zhì)體。為了放大轉(zhuǎn)移染料的信號(hào)，將該樣品通過濾膜以13. 2X 103rpm離心20min,在這種條件下裸露脂質(zhì)體和不穩(wěn)定的AuChi-脂質(zhì)體都破碎并且完全釋放該染料，而穩(wěn)定的AuChi-脂質(zhì)體保持完整。因此，在濾液中檢測到的ANTS的熒光強(qiáng)度是來自已與裸露脂質(zhì)體或?yàn)V膜融合的不穩(wěn)定的AuChi-脂質(zhì)體的累積信號(hào)。如
圖13B所示，在脂質(zhì)體未被任何AuChi保護(hù)時(shí)檢測到高水平的ANTS信號(hào)。相比之下，當(dāng)脂質(zhì)體/AuChi摩爾比為I : 150和I : 300時(shí)，檢測到的ANTS信號(hào)分別僅為裸露脂質(zhì)體的30%和20%。在較低的脂質(zhì)體/AuChi摩爾比(例如，I 150和I : 300)條件下獲得的ANTS信號(hào)可以歸因于DPX對ANTS的不完全猝滅。這對染料的碰撞猝滅機(jī)制確定該熒光猝滅既不是永久的，也不是完全的。這些結(jié)果證明AuChi在脂質(zhì)體表面上的吸附可以有效地阻止它們彼此之間融合或者與濾膜在激烈(rigorous)離心下融合，并因而顯著地提高脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。這些結(jié)果也與利用帶負(fù)電荷的羧基修飾的金納米粒子使陽離子脂質(zhì)體穩(wěn)定化的此前的穩(wěn)定性研究(Pornpattananangkul,D 等,ACS Nano2010,4,1935-1942) 一致。因?yàn)镮 : 300的脂質(zhì)體/AuChi摩爾比得到最穩(wěn)定的制劑，所以選擇這種制劑用于隨后的毒素觸發(fā)的藥物釋放研究。固定脂質(zhì)體AuChi摩爾比，進(jìn)ー步優(yōu)化脂質(zhì)體制劑以便使細(xì)菌毒素，特別是α -毒素獲得最高的成孔活性。α-毒素是金黃色葡萄球菌細(xì)菌分泌的成孔毒素之一，也是用于在人工或生物膜中形成孔的最普遍報(bào)道的毒素之一。為了找出對α-毒素最敏感的最佳脂質(zhì)體制劑，調(diào)查兩種參數(shù)膽固醇在脂質(zhì)體膜中的含量和聚こニ醇(PEG)在脂質(zhì)體溶 液中的添加。這兩個(gè)參數(shù)此前已被報(bào)道可影響毒素在人工膜中的成孔活性。在這個(gè)實(shí)施例中，制備具有不同膽固醇水平(例如，O重量％、10重量％、25重量％，和50重量％ )的含有ANTS/DPX染料的脂質(zhì)體，然后在測量ANTS的熒光發(fā)射之前將該脂質(zhì)體與α-毒素QOyg/mL)培育lh。通過用1% (v/v) Triton X_100裂解所有脂質(zhì)體獲得最大染料泄漏，而來自在PBS中的相應(yīng)脂質(zhì)體的染料的熒光發(fā)射用作背景信號(hào)。α -毒素的成孔百分比使用如下公式計(jì)算成孔百分比(% )=(し毒素IpbsV(Itx-K1q-Ipbs) X 100，其中Ia-毒素、Ipbs，和Ιτχ-100分別表示與a -毒素、PBS，和Triton-X-IOO —起培育的脂質(zhì)體制劑在510nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度。如
圖14A所示，在膽固醇含量増加時(shí)觀察到成孔的增加，掲示膽固醇提高了 a-毒素的成孔效率。發(fā)現(xiàn)，在脂質(zhì)體膜中的50重量％的膽固醇使得a-毒素具有最大的成孔活性。推測膽固醇可能促進(jìn)a-毒素與磷脂酰膽堿頭基之間的相互作用或者自身與a-毒素相互作用。接下來，我們將脂質(zhì)體制劑中的膽固醇濃度固定為50重量％，并調(diào)查PEG對a-毒素的成孔活性的影響。首先將含有ANTS/DPX的脂質(zhì)體與在Omg/mL至150mg/mL范圍內(nèi)的不同PEG濃度的PEG混合，然后與a-毒素培育lh，接著量化成孔百分比。如
圖14B所示，當(dāng)溶液中的PEG濃度從0mg/mL增加至100mg/mL時(shí),成孔增加并且然后在100mg/mL時(shí)達(dá)到最大值。然而，當(dāng)PEG濃度高于lOOmg/mL時(shí)，成孔減少。PEG的作用是由于它與水具有強(qiáng)的氫鍵而使脂質(zhì)體表面脫水，并因而促進(jìn)毒素的膜插入過程。這些結(jié)果揭示對a-毒素最敏感的脂質(zhì)體制劑含有在脂質(zhì)體膜中的50%的膽固醇以及在溶液中的lOOmg/mL PEG。一旦毒素插入到脂質(zhì)體膜中，組裝的蛋白質(zhì)寡聚物就在廣泛范圍的pH和溫度內(nèi)是穩(wěn)定的并且所形成的跨膜孔在正常條件下保持敞開。通過這些孔，藥物有效載荷可以從脂質(zhì)體中釋放出來。為了對使用毒素形成孔并觸發(fā)藥物從AuChi-脂質(zhì)體釋放進(jìn)行驗(yàn)證，我們選擇MRSA作為分泌毒素的細(xì)菌模型以及使用萬古霉素作為對MRSA細(xì)菌具有強(qiáng)抑制作用的抗生素模型。在這個(gè)實(shí)施例中，將lOmg/mL萬古霉素裝載在根據(jù)上述研究確定的最佳AuChi-脂質(zhì)體制劑中，并將該制劑與MRSA252細(xì)菌(lX108CFU/mL) —起在5%胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)中在37°C下培育。在預(yù)定的時(shí)間點(diǎn)，使用截留分子量為IOOKDa的過濾離心裝置從該混合物溶液中收集釋放的萬古霉素。通過反相HPLC確定萬古霉素的濃度。在該實(shí)驗(yàn)中，最終的萬古霉素濃度為約62 μ g/mL。因?yàn)槿f古霉素對MRSA細(xì)菌的最低抑制濃度(Mic)為約2 μ g/mL，所以提出被細(xì)胞膜吸收的萬古霉素的量將不會(huì)顯著地影響萬古霉素釋放動(dòng)力學(xué)的測量。在這個(gè)實(shí)施例中，對在0-100 μ g/mL范圍內(nèi)的一系列萬古霉素樣品測量在280nm處的UV吸收強(qiáng)度從而產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(
圖15，插圖)。然后，通過將測得的吸收強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來量化釋放的萬古霉素濃度。如
圖15所示，在萬古霉素負(fù)載的AuChi-脂質(zhì)體與MRSA細(xì)菌培育后的O. 5h和24h，分別在釋放介質(zhì)中檢測到29. 5 μ g/mL和62. O μ g/mL萬古霉素，其轉(zhuǎn)化為總包封萬古霉素的48%和100%的累積藥物釋放。相比之下，當(dāng)萬古霉素負(fù)載的AuChi-脂質(zhì)體在不存在MRSA細(xì)菌的情況下培育時(shí)，在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的任一時(shí)間點(diǎn)都沒有檢測到游離的萬古霉素。這進(jìn)ー步證實(shí)AuChi-脂質(zhì)體在離心過程期間保持穩(wěn)定，因而在存在MRSA的情況下檢測到的萬古霉素完全由細(xì)菌毒素在脂質(zhì)體膜上成孔所引起。因?yàn)?4h是用于研究抗生素的抗微生物活性的標(biāo)準(zhǔn)培育時(shí)間，所以在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得的萬古霉素負(fù)載的AuChi-脂質(zhì)體的藥物完全釋放暗示這個(gè)系統(tǒng)在有效抑制細(xì)菌生長方面的潛在應(yīng)用。在證明AuChi-脂質(zhì)體在由MRSA細(xì)菌分泌的毒素的存在下的藥物釋放之后，檢查萬古霉素負(fù)載的AuChi-脂質(zhì)體在體外抑制MRSA252生長的能力。將萬古霉素負(fù)載的 AuChi-脂質(zhì)體與MRSA252 (I X 108CFU/mL) 一起在5 % TSB中培育24h，接著測量OD6tltl以確定細(xì)菌生長。未用AuChi穩(wěn)定化的萬古霉素負(fù)載的脂質(zhì)體和游離脂質(zhì)體用作陽性對照；空白AuChi-脂質(zhì)體(不含萬古霉素)和PBS用作陰性對照。如
圖16所示，萬古霉素AuChi-脂質(zhì)體可以與萬古霉素脂質(zhì)體和游離萬古霉素以相同的程度抑制MRSA252的生長。斯氏t檢驗(yàn)顯示，萬古霉素AuChi-脂質(zhì)體的0D_值與萬古霉素的OD6tltl值之間的差異不顯著，P-值為O. 18 (P > O. I)。所獲得的萬古霉素AuChi-脂質(zhì)體的OD6tltl信號(hào)中已扣除AuChi-脂質(zhì)體(不含萬古霉素)的0D_信號(hào)，從而排除來自裸露脂質(zhì)體藥物載體的任何可能干擾信號(hào)。在
圖16中的觀察到的不可忽略的AuChi-脂質(zhì)體的抑制作用可能是由于脂質(zhì)的ー些本征性質(zhì)和/或未結(jié)合AuChi納米粒子與細(xì)菌之間的相互作用造成的。雖然萬古霉素AuChi-脂質(zhì)體和萬古霉素脂質(zhì)體都抑制MRSA252細(xì)菌的生長，但是它們的工作機(jī)制不同。萬古霉素AuChi-脂質(zhì)體被穩(wěn)定化而不能融合并且在細(xì)菌毒素不存在的情況下不釋放藥物。因而，所觀察到的它們的抑制作用僅由通過由細(xì)菌毒素形成的孔釋放的萬古霉素引起。相比之下，萬古霉素脂質(zhì)體未被AuChi保護(hù)并且可以容易地彼此融合以及與細(xì)菌膜融合，由此導(dǎo)致萬古霉素釋放，這回答了所觀察到的抑制作用。與裸露萬古霉素脂質(zhì)體相比，萬古霉素AuChi-脂質(zhì)體系統(tǒng)展示出數(shù)個(gè)獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。首先，它增加了脂質(zhì)體制劑的儲(chǔ)存壽命，使得最低量的藥物將在施用之前被釋放。其次，它能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)菌靶向的抗生素遞送。因?yàn)檫@種制劑不與生物膜融合，所以該藥物將僅在細(xì)菌分泌毒素的感染部位處被釋放。最后，抗生素的劑量被感染的嚴(yán)重程度自我調(diào)節(jié)。較多的細(xì)菌將會(huì)分泌較多的毒素并因而觸發(fā)較多的藥物釋放。注意，萬古霉素對MRSA的最低抑制濃度(MIC)是約2 μ g/mL。從萬古霉素AuChi-脂質(zhì)體釋放的萬古霉素具有多達(dá)62 μ g/mL的濃度，其足以抑制細(xì)菌的生長。其它實(shí)施方案提供上面給出的詳細(xì)描述僅為了幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明。然而，本文描述并要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍不受本文公開的具體實(shí)施方案限制，因?yàn)檫@些實(shí)施方案意在作為本發(fā)明數(shù)個(gè)方面的例證。任何等效的實(shí)施方案都落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實(shí)上，根據(jù)前述描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)明了除本文示出和描述的那些之外的沒有偏離本發(fā)明精神或范圍的本發(fā)明的各種修改。此類修改也落在所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。引用的參考文獻(xiàn)本申請中引用的所有出版物、專利、專利申請和其它參考文獻(xiàn)都以引用的方式完整地并入本文以用于所有目的，引用程度如同每篇單獨(dú)的出版物、專利、專利申請或其它參考文獻(xiàn)均被具體単獨(dú)地指出以引用的方式完整地并入本文用于所有目的一祥。本文的參考文獻(xiàn)引用不應(yīng)解讀為承認(rèn)此類參考文獻(xiàn)是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。特別意欲落在本發(fā)明范圍內(nèi)并且以引用的方式完整地并入本文的是下列出版物
Dissaya Pornpattananangkul， Li Zhang, Sage Olson, Santosh Aryal,Marygorret Obonyo, Kenneth Veccnio， Chun-Ming Huang, andLiangfang Zhang,Bacterial Toxin-Triggered Drug Release from GoldNanoparticIe_StabIIlzedLiposomes for the Treatment of BacterialInfection, J. Am. Chem. Soc. ArticlesASAP (February 23,2011),以及 Pornpattananangkul D，Olson S，Aryal S，Sartor M，Huang CM， VecchioK， Zhang L ， Stimuli-responsive liposome fusion mediated bygoldnanoparticles, ACS Nano. 20IOApr 27 ；4 (4) :1935-42.以引用的方式完整地并入本文的其它出版物包括Aiyal，S. ;B，K. C. R.；Dharmaraj，N. ；Bhattarai, N. ；Kim, C. H. ;Kim，Η· Υ·，Spectroscopic Identification ofS-Au Interaction in Cysteine Capped Gold Nanoparticles. Spectrochim. ActaA2006,63,160-163.BarenhoIz, Y.，Liposome Application Problems and Prospects. Curr. Opin.Coll. Inter. Sci. 2001，6，66-77.Bashford，C. L. ；Alder, G. M. ；Fulford, L. G. ；Korchev, Y. E ；Kovacs, E.；MacKinnon, A. ；Pederzolli, C. ；Pasternak, C. A. , J. Membr. Biol. 1996，150，37-45.Bhakdi, S. ;Tranum_Jensen，J. , Microbiol. Rev. 1991，55，733-751.Blackwood, R. A. ;Smolen，J. E ；Hessler, R. J. ；Harsh, D. M. ；Transue, A.，Biochem. J. 1996，314 (Pt 2)，469-475.Boisselier，E. ；Astruc, D.，Gold Nanoparticles in Nanomedicine Preparations，Imaging，Diagnostics，Therapies and ioxicity.しhem. Soc. Rev. 2009，38，1759-1782.Castro，G. A. ;Ferreira，L. A.，Novel Vesicular and Particulate DrugDelivery Systems forTopical Treatment ofAcne. Expert Opin. Drug Deliv.2008，5，665-679.Corma, A. Diaz, U. ；Arrica, M. ；Fernandez, E. ;0rtega， .，Organic-InorganicNanosphereswith Responsive Molecular Gates for Drug Storage and Release. Angew.Chem. Int. Ed. 2009，48，6247-6250.Davis, Μ. E. ;Chen，Z. G. ;Shin，D. M.，Nanoparticle Therapeutics anEmergingTreatment Modality for Cancer. Nat. Rev. Drug Discov.2008，7，771-782.Farokhzad, 0. C. ;Cheng，J. ;Teply，B.A. ；Sherifi, I. ;Jon，S. ；Kantoff, P. W.；Richie，J. P. ；Langer, R.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA2006，103，6315-6320.Forti，S. ；Menestrina, G.，Eur. J. Biochem. 1989，181，767-773.
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權(quán)利要求
1.一種脂質(zhì)體，其包含所述脂質(zhì)體的內(nèi)球面和外表面、多個(gè)生物相容性納米粒子，所述生物相容性納米粒子利用刺激敏感性鍵連接至脂質(zhì)分子，并且進(jìn)一步包含在所述內(nèi)球面內(nèi)的活性物，其中所述活性物在觸發(fā)所述刺激敏感性鍵時(shí)釋放。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的脂質(zhì)體，其中所述生物相容性納米粒子選自由金納米粒子、銀納米粒子和合成納米粒子組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述生物相容性納米粒子的表面包含陰離子官能團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述生物相容性納米粒子的表面包含陽離子官能團(tuán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述生物相容性納米粒子的表面包含羧酸根。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述生物相容性納米粒子的直徑為約Inm至約20nm。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體包含氫化L-a-磷脂酰膽堿和I，2- 二 -(9Z-十八烯酰基)-3_ 二甲基銨基丙燒。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述活性物選自由抗生素、抗微生物劑、生長因子、化療劑及其組合組成的組。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述活性物選自由月桂酸、過氧化苯甲酰、萬古霉素及其組合組成的組。
10.根據(jù)權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體的直徑為約IOnm至約 300nm。
11.根據(jù)權(quán)利要求I至10中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述生物相容性納米粒子占所述脂質(zhì)體表面的約5%至約25%。
12.根據(jù)權(quán)利要求I至11中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述觸發(fā)器選自由真皮pH、天然存在或合成的毒素成孔活性，以及光的施加組成的組。
13.根據(jù)權(quán)利要求I至12中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述刺激敏感性鍵是pH-敏感性鍵。
14.一種脂質(zhì)體，其包含所述脂質(zhì)體的內(nèi)球面和外表面、多個(gè)生物相容性納米粒子，所述生物相容性納米粒子經(jīng)由靜電相互作用與脂質(zhì)分子接觸，并且進(jìn)一步包含在所述內(nèi)球面內(nèi)的活性物，其中所述活性物在觸發(fā)脂質(zhì)體孔形成時(shí)釋放。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的脂質(zhì)體，其中所述生物相容性納米粒子選自由金納米粒子、銀納米粒子和合成納米粒子組成的組。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述生物相容性納米粒子的表面包含陰離子官能團(tuán)。
17.根據(jù)權(quán)利要求14或15中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述生物相容性納米粒子的表面包含陽離子官能團(tuán)。
18.根據(jù)權(quán)利要求14或15中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述生物相容性納米粒子的表面包含殼聚糖。
19.根據(jù)權(quán)利要求14至18中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述生物相容性納米粒子的直徑為約Inm至約20nm。
20.根據(jù)權(quán)利要求14至19中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體包含氫化L-a-磷脂酰膽堿和I，2- 二 -(9Z-十八烯?；?-3_ 二甲基銨基丙燒。
21.根據(jù)權(quán)利要求14至20中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述活性物選自由抗生素、抗微生物劑、生長因子、化療劑及其組合組成的組。
22.根據(jù)權(quán)利要求14至21中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述活性物選自由月桂酸、過氧化苯甲酰、萬古霉素及其組合組成的組。
23.根據(jù)權(quán)利要求14至22中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體的直徑為約IOnm至約300nm。
24.根據(jù)權(quán)利要求14至23中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述結(jié)合的金納米粒子占所述脂質(zhì)體表面的約5%至約25%。
25.根據(jù)權(quán)利要求14至24中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述觸發(fā)器選自由真皮pH、天然存在或合成的毒素成孔活性，以及UV光的施加組成的組。
26.根據(jù)權(quán)利要求14至25中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體，其中所述脂質(zhì)體包含在所述膜中的50%的膽固醇以及在所述溶液中的lOOmg/mL PEG。
27.一種藥劑遞送系統(tǒng)，其包含根據(jù)權(quán)利要求I或14所述的組合物。
28.一種在藥學(xué)上可接受的媒介物中的根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥劑遞送系統(tǒng)。
29.一種選擇性地遞送活性物至靶標(biāo)真皮部位的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求I或14所述的脂質(zhì)體施用至所述靶標(biāo)真皮部位以及觸發(fā)活性物釋放。
30.一種用于治療真皮疾病或病狀的方法，所述方法包括將治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求I或14所述的脂質(zhì)體施用至需要其的受試者的靶標(biāo)真皮部位以及觸發(fā)活性物釋放。
31.一種用于治療真皮疾病或病狀的方法，所述方法包括經(jīng)由根據(jù)權(quán)利要求27所述的藥劑遞送系統(tǒng)將治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求I或14所述的脂質(zhì)體施用至需要其的受試者。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的方法，其中所述病狀選自由MRSA感染、金黃色葡萄球菌感染和痤瘡丙酸桿菌感染組成的組。
33.一種在觸發(fā)釋放之前穩(wěn)定地儲(chǔ)存藥劑的方法，所述方法包括將所述藥劑封閉在根據(jù)權(quán)利要求I或14所述的脂質(zhì)體中。
全文摘要
公開了一種通過使生物相容性納米粒子吸附到磷脂脂質(zhì)體外表面上來控制脂質(zhì)體的融合活性的新途徑。該生物相容性納米粒子有效地阻止脂質(zhì)體彼此融合。活性物從脂質(zhì)體的釋放經(jīng)由包括pH觸發(fā)器、成孔毒素觸發(fā)器和光敏觸發(fā)器在內(nèi)的觸發(fā)器機(jī)制完成。涵蓋用于治療多種皮膚疾病如尋常痤瘡和葡萄球菌感染的真皮藥物遞送。
文檔編號(hào)A01N25/28GK102858153SQ201180020640
公開日2013年1月2日 申請日期2011年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月12日
發(fā)明者張良方, 迪薩亞·波恩帕坦納南庫爾, 俊銘·E·黃 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)