專利名稱：適用于臍帶組織衍生干細(xì)胞的臍帶組織冷凍保存的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于干細(xì)胞，特別是關(guān)于臍帶組織衍生干細(xì)胞。本申請(qǐng)主張2011年9月I日提出申請(qǐng)的臺(tái)灣專利申請(qǐng)第100131519號(hào)的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)的整體內(nèi)容在此以引用的方式并入本申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
前人已提出保存嬰兒臍帶血的潛在好處，現(xiàn)在，科學(xué)家則要進(jìn)一步保存實(shí)際的臍帶組織。此想法是要保存出生時(shí)的一段臍帶與其內(nèi)的所有細(xì)胞，并將臍帶組織冷凍在低溫儲(chǔ)槽內(nèi)以利長(zhǎng)期保存。未來(lái)如果需要嬰兒的細(xì)胞做為治療之用，即可以當(dāng)時(shí)最先進(jìn)的技術(shù)處理臍帶組織，進(jìn)而擷取出細(xì)胞。
臍帶(臍帶組織)內(nèi)的華通氏膠富含多能間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，其于再生醫(yī)學(xué)上具有巨大潛力。MSC可分化為骨骼、軟骨、神經(jīng)、脂肪、心臟、平滑肌、肝臟與皮膚細(xì)胞。然而，無(wú)論就保存或后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)而言，以上所述均屬相當(dāng)新穎的技術(shù)領(lǐng)域，尚須建立一套有效率的作業(yè)流程。

發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明是關(guān)于一種保存臍帶的方法。該方法包括獲取一段臍帶；將臍帶切碎成臍帶組織塊，其中各臍帶組織塊的尺寸不大于2毫米(mm);將臍帶組織塊與冷凍組合物混合以形成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護(hù)劑與蛋白質(zhì)；搖晃該混合物，且搖晃的時(shí)間不少于28分鐘但亦不超過(guò)32分鐘；然后冷凍保存該混合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明是關(guān)于一種保存臍帶的方法，其包括獲取一段臍帶；將臍帶切碎成臍帶組織塊；將臍帶組織塊與冷凍組合物混合以形成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護(hù)劑與蛋白質(zhì)；搖晃該混合物，且搖晃的時(shí)間不少于20分鐘但亦不超過(guò)40分鐘；然后冷凍保存該混合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明是關(guān)于一種從一段臍帶中獲取臍帶組織衍生干細(xì)胞的方法，其包括獲取一段臍帶；將臍帶切碎成臍帶組織塊；將臍帶組織塊與冷凍組合物混合以形成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護(hù)劑與蛋白質(zhì)；搖晃該混合物，且搖晃的時(shí)間不少于20分鐘但亦不超過(guò)40分鐘；冷凍保存該混合物；將該混合物解凍，并去除冷凍組合物；然后在培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)臍帶組織塊，以獲得臍帶衍生干細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明是關(guān)于一種冷凍組合物，其包括a)血清白蛋白或人類血清；與13)冷凍保護(hù)劑，其中組合物不含非人類動(dòng)物衍生組分。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明是關(guān)于一種冷凍組合物，其包括30%至50%的人類臍帶血血清或2. 5%至25%的血清白蛋白；5. 5%至55%的二甲基亞砜(DMSO);與0. 5%至5%的葡聚糖。在參閱以下較佳實(shí)施例的說(shuō)明及附圖后，即可清楚了解上述與其它實(shí)施方式。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可提出變化例與修正例而不脫離本案新穎概念的實(shí)質(zhì)與范圍。
附圖顯示本發(fā)明一個(gè)以上的實(shí)施例，圖式的作用是與書(shū)面說(shuō)明共同解釋本發(fā)明的原理。在可能情況下，所有圖式均以相同的參考標(biāo)號(hào)表示同一實(shí)施例中相同或類似的組件。


圖IA至IE為顯微照片，分別顯示僅以酶處理而未經(jīng)冷凍保存、冷凍保存前先以酶處理、未以酶處理也未經(jīng)冷凍保存、冷凍保存后以酶處理，以及僅冷凍保存而未以酶處理的切碎臍帶組織塊衍生細(xì)胞。圖2A至 2C顯不突光激活細(xì)胞分選法(Fluorescence Activated Cell Sortingorf I ow cy tome try, FACS)或流動(dòng)式細(xì)胞測(cè)量法的分析結(jié)果,其分析對(duì)象分別為冷凍保存前先以酶處理、冷凍保存后以酶處理，以及僅冷凍保存而未以酶處理的切碎臍帶組織塊衍生細(xì)胞。圖3顯示衍生自切碎臍帶組織塊的細(xì)胞數(shù)量，其中切碎臍帶組織塊分別為未接受酶處理，及在冷凍保存之前或之后接受酶處理。
圖4顯示切碎臍帶組織塊衍生細(xì)胞未經(jīng)過(guò)冷凍保存及經(jīng)過(guò)冷凍保存之后的倍增時(shí)間。圖5為顯微照片，分別顯示切碎臍帶組織塊(左圖)與濾液(右圖)的細(xì)胞培養(yǎng)物。圖6A與6B分別顯示衍生自切碎臍帶組織塊與非切碎臍帶組織塊的群落數(shù)量與細(xì)胞數(shù)量。圖7顯示干細(xì)胞標(biāo)記基因的RT-PCR分析結(jié)果。圖8A為顯微照片，顯示切碎臍帶衍生干細(xì)胞與造血干細(xì)胞共同培養(yǎng)物中的鵝卵石構(gòu)造。圖SB顯示RT-PCR的分析結(jié)果，其分析對(duì)象為臍帶組織衍生干細(xì)胞上與細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)途徑。圖9A至9C為顯微照片，分別顯示從切碎臍帶組織衍生干細(xì)胞分化而成的脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞。圖IOA至IOF顯示細(xì)胞在接受血管生成誘導(dǎo)前(圖IOA至10C)、后(圖IOD至10F)的熒光激活細(xì)胞分選法(FACS)或流動(dòng)式細(xì)胞測(cè)量法的分析結(jié)果。圖11顯示干細(xì)胞群落形成單位的數(shù)量與臍帶組織以冷凍保護(hù)劑溶液培養(yǎng)的時(shí)間長(zhǎng)短的關(guān)系。
具體實(shí)施例方式定義本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)所使用的術(shù)語(yǔ)在本發(fā)明范圍內(nèi)及各術(shù)語(yǔ)的特定上下文中大致具有其相關(guān)領(lǐng)域中的通常涵義。本說(shuō)明書(shū)中用以描述本發(fā)明的特定用語(yǔ)將在下文中或在本說(shuō)明書(shū)的他處加以說(shuō)明，以利業(yè)界人士了解本發(fā)明的相關(guān)敘述。為便于閱讀，某些術(shù)語(yǔ)可能會(huì)以斜體及/或引號(hào)等格式加以凸顯，但使用這些凸顯格式并不影響術(shù)語(yǔ)的范圍與意義。同一術(shù)語(yǔ)在相同上下文中的范圍與意義皆相同，此與是否采用凸顯格式無(wú)關(guān)。此外，同一件事的表示方法不止一種。因此，本文所討論的術(shù)語(yǔ)均可以替代用語(yǔ)及同義詞取代，且一術(shù)語(yǔ)是否在本文中經(jīng)詳細(xì)說(shuō)明或討論，并無(wú)任何特別意義。本文提供某些術(shù)語(yǔ)的同義詞，但使用某一或多個(gè)同義詞并不表示排除其它同義詞。本說(shuō)明書(shū)所提供的范例，包括此處所討論的術(shù)語(yǔ)范例，僅供說(shuō)明之用，而非用于局限本發(fā)明或任何例示術(shù)語(yǔ)的范圍與意義。同樣的，本發(fā)明并不限于本說(shuō)明書(shū)所列舉的各種實(shí)施例。除非另有定義，否則本文中所有技術(shù)與科學(xué)術(shù)語(yǔ)的含義均與本領(lǐng)域技術(shù)人員所普遍了解者相同。若有相互沖突之處，則以本說(shuō)明書(shū)及其所提供的定義為解釋依據(jù)。在本文中，「左右」、「約」或「大約」均指已知數(shù)值或范圍的20%以內(nèi)，較佳者為10%以內(nèi)，更佳者則為5%以內(nèi)。本文所列的數(shù)量為約略值，亦即縱使未明白寫(xiě)出「左右」、「約」或「大約」等詞，仍帶有該等用詞的含義。在本文中，「臍帶組織塊」與「切碎的臍帶組織」兩詞可以互換。切碎的臍帶組織塊是指一塊尺寸小于O. 5厘米(cm)的臍帶組織。在本文中，臍帶組織塊的尺寸不超過(guò)O. 4厘米，或不超過(guò)O. 3厘米，或不超過(guò)O. 2厘米。臍帶組織塊的尺寸不超過(guò)O. 2厘米是指該臍·帶組織塊可通過(guò)篩孔大小為2毫米(mm)的細(xì)胞過(guò)濾器。在本文中，「一段臍帶組織」是指臍帶的一部分，其長(zhǎng)度為O. 5厘米或超過(guò)O. 5厘米。一段臍帶組織可為O. 5、1、2或3厘米，甚至超過(guò)3厘米?！咐鋬霰４娣ā够颉咐鋬霰４妗咕竿环椒?，其中是將細(xì)胞或整個(gè)組織冷卻至零度以下的低溫，通常為77K或零下196°C (液態(tài)氮的沸點(diǎn))，借以達(dá)到保存細(xì)胞或整個(gè)組織的目的。在此等低溫下，任何生物活性，包括會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的生化反應(yīng)，皆能得到有效遏制。然而，若不使用冷凍保護(hù)劑溶液，則被保存的細(xì)胞往往會(huì)在接近低溫或回暖至室溫的過(guò)程中因冷凍而受損?！咐鋬觥古c「冷凍保存」兩詞可以互換?！咐鋬鼋M合物」、「冷凍溶液」、「冷凍保存組合物」與「抗凍溶液」等詞可以互換。除非另有規(guī)定，否則「臍帶組織衍生細(xì)胞」、「臍帶組織塊衍生細(xì)胞」、「臍帶組織衍生干細(xì)胞」與「臍帶組織衍生MSC」等詞可以互換。「倍增時(shí)間」是指尺寸或數(shù)值增加一倍所需的時(shí)間。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明是關(guān)于一種保存臍帶的方法。該方法包括獲取一段臍帶；將臍帶切碎成臍帶組織塊，其中各臍帶組織塊的尺寸不大于2毫米；將臍帶組織塊與冷凍組合物混合成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護(hù)劑與蛋白質(zhì)；搖晃該混合物，且搖晃的時(shí)間不少于28分鐘但亦不超過(guò)32分鐘；然后冷凍保存該混合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明是關(guān)于一種保存臍帶的方法，其包括獲取一段臍帶；將臍帶切碎成臍帶組織塊；將臍帶組織塊與冷凍組合物混合成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護(hù)劑與蛋白質(zhì)；搖晃該混合物，且搖晃的時(shí)間不少于20分鐘但亦不超過(guò)40分鐘；然后冷凍保存該混合物。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明是關(guān)于一種從一段臍帶中獲取臍帶組織衍生干細(xì)胞的方法，其包括獲取一段臍帶；將臍帶切碎成臍帶組織塊；將臍帶組織塊與冷凍組合物混合成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護(hù)劑與蛋白質(zhì)；搖晃該混合物，且搖晃的時(shí)間不少于20分鐘但亦不超過(guò)40分鐘；冷凍保存該混合物；將該混合物解凍，并去除冷凍組合物；然后在培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)該臍帶組織塊，以獲得臍帶衍生干細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，培養(yǎng)介質(zhì)包括人類臍帶血血清，或者，培養(yǎng)介質(zhì)是由DMEM與人類臍帶血血清組成。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，各臍帶組織塊的尺寸為2毫米或小于2毫米(亦即不超過(guò)2毫米)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，上述方法包括持續(xù)搖晃所述混合物25至30分鐘。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，搖晃步驟持續(xù)28至32分鐘。所述搖晃步驟可持續(xù)30分鐘。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述搖晃步驟是于低于15°C、或0°C與10°C之間，或不高于4°C的溫度下進(jìn)行。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述臍帶組織塊未經(jīng)酶消化處理。 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述臍帶組織塊在混合步驟前或在解凍步驟后接受酶消化處理。上述方法可進(jìn)一步包括利用酶抑制劑抑制酶消化作用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明是關(guān)于一種冷凍組合物，其包括a)血清白蛋白或人類血清；與13)冷凍保護(hù)劑，其中該組合物不含非人類動(dòng)物衍生組分。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，冷凍保護(hù)劑是從二甲基亞砜(DMSO)、甘油、乙二醇與丙二醇中選出，且至少為其中之一。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，冷凍保存溶液包括DMEM或磷酸鹽緩沖溶液，以及DMSO或甘油。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，冷凍保存溶液包括DMEM或磷酸鹽緩沖溶液，以及DMSO或甘油，以及人類臍帶血血清或胎牛血清。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，冷凍保存溶液包括DMEM或磷酸鹽緩沖溶液，以及DMSO或甘油，以及血清白蛋白或血漿蛋白部分(PPF)。或者，冷凍保存溶液是由DMEM、DMS0、葡聚糖，以及人類臍帶血血清或血清白蛋白組成。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，蛋白質(zhì)組分是從血清白蛋白、人類血清與血漿蛋白部分(PPF)中選出，且至少為其中之一。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施例中，冷凍組合物不含非人類動(dòng)物衍生組分與單糖。而在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明是關(guān)于一種冷凍組合物，其包括30%至50%的人類臍帶血血清或2. 5%至25%的血清白蛋白；5. 5%至55%的DMSO ;與O. 5%至5%的葡聚糖。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，冷凍組合物包括40 %的人類臍帶血血清或2. 5 %至25%的血清白蛋白；5. 5%至55%的DMSO ;與O. 5%至5%的葡聚糖。實(shí)施例以下僅為本發(fā)明實(shí)施例中的示范用設(shè)備、器材、方法及其相關(guān)結(jié)果，不應(yīng)視為本發(fā)明的限制。請(qǐng)注意，各范例的標(biāo)題或子標(biāo)題僅為方便閱讀之用，同樣不應(yīng)視為本發(fā)明的限制。此外，本文雖提出并披露若干理論，但只要本發(fā)明是依據(jù)其本身實(shí)施，而非依據(jù)特定理論或?qū)嵭蟹桨福瑒t該等理論無(wú)論正確與否，均不應(yīng)視為本發(fā)明的限制。材料與方法細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)適合培養(yǎng)臍帶衍生干細(xì)胞的市售介質(zhì)包括但不限于RPMI、MDM、DMEM, α -MEM,F12K、McCoy’ s 5a與X-VIVO 10。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是以DMEM (90%至70% )與人類血清(10%至30% )培養(yǎng)臍帶衍生細(xì)胞。
在某些實(shí)施例中，先以市售介質(zhì)培養(yǎng)諸如HUVEC、MS-5或人類基質(zhì)細(xì)胞系等細(xì)胞，以便取得含有該等細(xì)胞所分泌的因子的培養(yǎng)介質(zhì)。收集此含有該等細(xì)胞所分泌的因子的介質(zhì)，并于稀釋后或以未稀釋的狀態(tài)使用，借以取代市售介質(zhì)做為細(xì)胞培養(yǎng)之用。在另一些實(shí)施例中，市售介質(zhì)含有諸如FBS、FCS等細(xì)胞培養(yǎng)添加劑；人類外周血血清；人類臍帶血血清；富含血小板的血漿(PRP);諸如IL-3、IL-6、TP0、FltL-3、SCF、EGF、TGF-β、bFGF等細(xì)胞生長(zhǎng)因子；丙酮酸鈉；葡萄糖；麩胺酰胺與/或HEPES。或者，用以培養(yǎng)臍帶衍生干細(xì)胞的市售介質(zhì)同時(shí)含有細(xì)胞培養(yǎng)添加劑與上述由細(xì)胞所分泌的因子。臍帶處理以酒精(70%至75% )與磷酸鹽緩沖溶液清潔臍帶。將臍帶切成適當(dāng)小段，然后以機(jī)械工具將臍帶小段切碎成更小的臍帶組織塊。所有工具均經(jīng)過(guò)消毒。酶處理為評(píng)估酶消化作用對(duì)臍帶組織衍生細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的影響，發(fā)明人進(jìn)行以下試驗(yàn)。部分臍帶組織塊未經(jīng)酶處理，部分臍帶組織塊則在冷凍保存之前或之后以酶處理30分鐘。試驗(yàn)時(shí)是以胰蛋白酶或以胰蛋白酶與膠原酶的混合物進(jìn)行酶消化。其它可用的酶包括但不限于蛋白酶、gelatase、透明質(zhì)酸酶與其任意組合。消化作用在人類血清(臍帶血血清或非臍帶血血清)或胎牛血清等酶抑制劑的作用下停止?？捎靡匀〈宓钠渌敢种苿┌ǖ幌抻谝鹊鞍酌敢种苿?、含血清(人類或非人類動(dòng)物血清)介質(zhì)，或含有EDTA的緩沖溶液。細(xì)胞以緩沖溶液或培養(yǎng)介質(zhì)進(jìn)一步清洗數(shù)次，借以將酶去除，然后在培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)7天，每隔3至7天更換一次介質(zhì)。冷凍保存經(jīng)過(guò)酶消化處理或未經(jīng)酶消化處理的臍帶組織塊先以磷酸鹽緩沖溶液清洗，再與冷凍組合物混合，接著以旋轉(zhuǎn)器(搖動(dòng)器)在諸如4°C的低溫下連續(xù)搖晃30分鐘，然后以BIOARCHIVE 搭配機(jī)器人式液態(tài)氮冷凍保存與儲(chǔ)存系統(tǒng)，將其儲(chǔ)存在零下196°C左右的溫度至少一星期，以確保其長(zhǎng)期生存力。冷凍溶液含有緩沖溶液或細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)，以及冷凍保護(hù)劑。冷凍保存溶液可視需要含有來(lái)自人類的血清(如人類臍帶血血清或人類血清)與來(lái)自人類的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)可為但不限于血清白蛋白或血漿蛋白部分(PPF)。緩沖溶液可為磷酸鹽緩沖溶液。細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)可為DMEM。冷凍保護(hù)劑可為二甲基亞砜(DMSO)、甘油、乙二醇或丙二醇。冷凍保存溶液可進(jìn)一步包括蔗糖、海藻糖或葡聚糖。為評(píng)估冷凍儲(chǔ)存對(duì)于來(lái)自臍帶組織的臍帶衍生細(xì)胞的培養(yǎng)與生長(zhǎng)有何種影響，上述臍帶組織塊解凍后便放置在含有介質(zhì)的培養(yǎng)皿中，并在37°C與5%二氧化碳的培養(yǎng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞計(jì)數(shù)臍帶組織塊在培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)7天，更換新介質(zhì)后再培養(yǎng)8至14天。收集細(xì)胞后，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞群體倍增時(shí)間是按照下列公式計(jì)算倍增時(shí)間=培養(yǎng)小時(shí)數(shù)/Log2(細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù))。臍帶組織衍生細(xì)胞與造血干細(xì)胞(HSC)的共同培養(yǎng)
造血干細(xì)胞可來(lái)自人類臍帶血或外周血。使用FICOLL_PAQUE PLUS(GE醫(yī)療集團(tuán))從人類臍帶血中分離出單核細(xì)胞后，以磁場(chǎng)激活細(xì)胞分選法(MACS)進(jìn)行CD34+造血干細(xì)胞的純化與分離。另一方面，將臍帶組織塊衍生干細(xì)胞(即MSC)接種到6孔板，然后在培養(yǎng)器內(nèi)以37°C與95%的濕度培養(yǎng)數(shù)天。以含有生長(zhǎng)因子的新介質(zhì)取代介質(zhì)后，將臍帶組織塊衍生干細(xì)胞與⑶34+造血干細(xì)胞(HSC)共同培養(yǎng)一星期。每隔2至3天更換一次介質(zhì)或添加更多生長(zhǎng)因子。生長(zhǎng)因子包括但不限于干細(xì)胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)與Flt3-配位基(Flt3-Ligand)。最后以臺(tái)盼藍(lán)(Trypan blue, Invitrogen公司)與血球細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈鎖反應(yīng)(RT-PCR)RT-PCR技術(shù)是用于檢查干細(xì)胞早期標(biāo)記基因的表達(dá)，并偵測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路內(nèi)的基因的表達(dá)。試驗(yàn)時(shí)是使用RNAeasy迷你套組(Qiagen公司)，并依制造商手冊(cè)所規(guī)定的方式從臍帶組織衍生細(xì)胞中提取出總RNA。 脂肪細(xì)胞分化切碎臍帶組織衍生細(xì)胞在DMEM/血清介質(zhì)中生長(zhǎng)至100%融合后，在不含血清的培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)48小時(shí)，然后在脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)介質(zhì)中再培養(yǎng)4周。脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)介質(zhì)含有DMEM、血清、抗生素(鏈霉素與青霉素)、異丁基甲基黃嘌呤、地塞米松(dexamethasone)、胰島素與吲哚美辛。為判別脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)的效果，分化后的細(xì)胞以油紅0(0il red O)染色。正脂肪細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下染成紅色。軟骨分化收集以上述方式在DMEM/血清介質(zhì)中生長(zhǎng)的切碎臍帶組織衍生細(xì)胞，然后在軟骨細(xì)胞分化介質(zhì)中培養(yǎng)2至3周，每隔3天更換一次新的誘導(dǎo)分化介質(zhì)。軟骨細(xì)胞分化介質(zhì)包含DMEM/血清、抗生素(鏈霉素與青霉素)、地塞米松、丙酮酸鈉、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 3 (TGF- β 3)。在為期14天的軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)過(guò)程中，細(xì)胞分泌出一種細(xì)胞外基質(zhì)，基質(zhì)內(nèi)含第二型膠原蛋白、蛋白聚糖與陰離子蛋白多糖。分化后的軟骨組織經(jīng)冷凍、切片，并以醋酸溶液沖洗，然后以阿爾辛藍(lán)(Alcian blue)染色。樣本切片再以核固紅(Nuclear fastred)進(jìn)行對(duì)比染色。干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞的特征在于出現(xiàn)阿爾辛染色區(qū)。強(qiáng)酸性硫酸鹽黏液物質(zhì)是染成藍(lán)色，原子核是染成粉紅色至紅色，細(xì)胞質(zhì)則染成淡粉紅色。血管生成分化將細(xì)胞接種在涂有基質(zhì)膠或膠原蛋白的板上，然后在內(nèi)皮生長(zhǎng)介質(zhì)-2(EGM_2)中培養(yǎng)，以便分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。臍帶組織塊培養(yǎng)于冷凍溶液的時(shí)間長(zhǎng)度為找出最佳的冷凍溶液培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)度，臍帶組織塊與冷凍溶液混合后便在細(xì)胞培養(yǎng)器內(nèi)以旋轉(zhuǎn)器輕輕搖晃，但搖晃時(shí)間各不相同。簡(jiǎn)言之，試驗(yàn)時(shí)共采集3位捐贈(zèng)者的臍帶，每條臍帶各取14厘米。臍帶組織均勻切碎成小塊(<2毫米)后，分為7個(gè)均等的樣本。在60分鐘內(nèi)，每隔10分鐘從各樣本中取樣一次，陸續(xù)加入15毫升的離心管內(nèi)與冷凍溶液混合，并以旋轉(zhuǎn)器搖晃。60分鐘結(jié)束時(shí)，以標(biāo)準(zhǔn)冷凍保存法同時(shí)冷凍保存所有7個(gè)樣本。7個(gè)樣本在冷凍保存3天后同時(shí)解凍，并去除冷凍溶液，接著將臍帶組織塊培養(yǎng)10天。培養(yǎng)10天后，計(jì)算來(lái)自各樣本的群落形成單位數(shù)與臍帶組織衍生干細(xì)胞數(shù)。結(jié)果
臍帶組織塊衍生細(xì)胞為間質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。圖IA至ID分別顯示臍帶組織塊于培養(yǎng)第7天時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)物上的臍帶組織衍生細(xì)胞。該等細(xì)胞為紡錘狀，且增殖快速。在進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)以獲得臍帶組織衍生細(xì)胞前，各臍帶組織塊或僅接受酶消化處理(圖1A)，或既接受酶消化處理也接受冷凍保存處理(圖1B)，或?yàn)槲唇邮苊柑幚硪参唇邮芾鋬霰４嫣幚淼男履殠ЫM織塊(圖1C)，或先接受冷凍保存處理再接受酶消化處理(圖1D)，或僅接受冷凍保存處理(圖1E)。結(jié)果顯示，冷凍保存與/或酶處理并不影響臍帶組織塊衍生細(xì)胞的形狀。臍帶組織衍生細(xì)胞的細(xì)胞類型是以FACS (熒光激活細(xì)胞分選法)或流動(dòng)式細(xì)胞測(cè)量法加以評(píng)估。為分析細(xì)胞表面抗原，先收集臍帶組織塊衍生細(xì)胞，再以磷酸鹽緩沖溶液沖洗，接著使細(xì)胞分別與抗體⑶ 13、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC、HLA-DR、7AAD或SSEA-4反應(yīng)后，再與異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)或藻紅蛋白菁染料5(PE-Cy5) (BD生物科學(xué)公司)偶聯(lián)。圖2A至2C為細(xì)胞散點(diǎn)圖。在進(jìn)行臍帶組織塊 植體培養(yǎng)前，細(xì)胞分別衍生自冷凍保存前(圖2A)或后(圖2B)接受酶消化處理、或僅接受冷凍保存處理而未經(jīng)酶處理(圖2C)的臍帶組織塊植體。每一點(diǎn)代表單一細(xì)胞，其位置則表示其前向散射(forwardscatter,FSC)強(qiáng)度值(細(xì)胞大小)與側(cè)向散射(side scatter,SSC)強(qiáng)度值(細(xì)胞粒度)。前向散射與細(xì)胞直徑大致成比例，而側(cè)向散射則與細(xì)胞粒度成比例。結(jié)果顯示，根據(jù)本發(fā)明的方法，以酶與冷凍保存法進(jìn)行臍帶組織塊之前處理并不會(huì)對(duì)臍帶組織塊衍生細(xì)胞的純度與屬性造成影響。為分析細(xì)胞表面抗原，先收集臍帶組織塊衍生細(xì)胞，再以磷酸鹽緩沖溶液沖洗，接著使細(xì)胞分別與抗體⑶13、⑶29、⑶31、⑶34、⑶44、CD45、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC, HLA_DR、7AAD 或 SSEA-4 反應(yīng)后，再與異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)或藻紅蛋白菁染料5(PE-Cy5) (BD生物科學(xué)公司)偶聯(lián)。結(jié)果顯示，無(wú)論細(xì)胞系衍生自冷凍保存前或后以酶處理的臍帶組織塊、或在冷凍保存前或后均未以酶處理的臍帶組織塊，細(xì)胞表面上所能辨別的抗原類型皆相同(相關(guān)數(shù)據(jù)恕未顯示)。發(fā)明人也評(píng)估臍帶組織塊冷凍保存前或后的酶處理對(duì)臍帶組織衍生細(xì)胞數(shù)量的影響，試驗(yàn)數(shù)據(jù)是以相對(duì)細(xì)胞數(shù))表示，其中100%是定義為先接受酶消化處理再冷凍保存的臍帶組織塊于解凍后所衍生出的細(xì)胞數(shù)量(如圖3的“冷凍前酶處理”柱)。結(jié)果顯示，無(wú)論臍帶組織塊是否接受酶處理(如圖3的“未經(jīng)酶處理”柱)，或者臍帶組織塊是否在冷凍保存前或后以酶處理(如圖3的“冷凍前酶處理”柱及“冷凍后酶處理”柱)，細(xì)胞數(shù)量均無(wú)顯著差異。此外，以胰蛋白酶抑制劑取代血清做為停止酶消化作用的酶抑制劑也不致顯著影響所收集的細(xì)胞數(shù)量(相關(guān)數(shù)據(jù)恕未顯示)。在對(duì)照研究中，每一組實(shí)驗(yàn)僅使用一塊臍帶組織。發(fā)明人亦評(píng)估冷凍保存對(duì)細(xì)胞倍增時(shí)間的影響，評(píng)估方法是比對(duì)臍帶組織塊在冷凍保存前(亦即在未接受冷凍保存處理的情況下)所衍生的細(xì)胞的倍增時(shí)間與臍帶組織塊冷凍保存一周后所衍生的細(xì)胞的倍增時(shí)間。結(jié)果顯示，根據(jù)本發(fā)明，臍帶組織塊的冷凍保存對(duì)細(xì)胞倍增時(shí)間并無(wú)顯著影響(圖4)。因此，本發(fā)明的冷凍與儲(chǔ)存過(guò)程并未對(duì)臍帶組織塊衍生MSC的產(chǎn)量造成不利影響。發(fā)明人亦分析以血清白蛋白取代冷凍溶液中的血清是否會(huì)對(duì)臍帶組織塊衍生細(xì)胞的產(chǎn)量有所影響。結(jié)果顯示，以血清白蛋白取代冷凍組合物中的血清時(shí)，細(xì)胞數(shù)量并無(wú)顯著差異。此項(xiàng)發(fā)現(xiàn)的意義在于提供一種不含血清且可行的冷凍組合物。
圖5的試驗(yàn)結(jié)果顯示，組織培養(yǎng)板中所生長(zhǎng)與增殖的細(xì)胞是從臍帶組織塊衍生而來(lái)，而非從臍帶組織樣本中的游離細(xì)胞衍生而來(lái)。臍帶組織塊與緩沖溶液混合后，是以網(wǎng)目大小為100微米的細(xì)胞濾器(Cell Strainer,BDFALC0N )過(guò)濾。通過(guò)網(wǎng)目的臍帶組織塊與緩沖溶液(即濾液或通過(guò)流體)分別在適用于臍帶組織衍生細(xì)胞的培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)。結(jié)果顯示，只有包含臍帶組織塊的培養(yǎng)出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)與遷移的現(xiàn)象，而僅含有濾液的培養(yǎng)皿則無(wú)。換言之，根據(jù)本發(fā)明，衍生自臍帶組織塊的細(xì)胞(亦即間質(zhì)干細(xì)胞)并非來(lái)自四處游走的游離細(xì)胞，而是來(lái)自臍帶組織內(nèi)的干細(xì)胞。換言之，干細(xì)胞是由臍帶組織塊產(chǎn)生，并于培養(yǎng)條件下從組織植體向 外遷移。為評(píng)估切碎的動(dòng)作是否對(duì)臍帶組織衍生干細(xì)胞的生長(zhǎng)有所影響，發(fā)明人將一段具有適當(dāng)長(zhǎng)度(約2厘米)且未切碎的臍帶直接與冷凍溶液混合，然后以零下160°C冷凍保存5至7天，并于解凍后加以培養(yǎng)，期能長(zhǎng)出臍帶組織衍生細(xì)胞。為進(jìn)行比對(duì)，另將一段同源臍帶切碎，與冷凍溶液混合后再以相同條件冷凍保存，接著解凍與培養(yǎng)。兩組試驗(yàn)均以顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。結(jié)果顯示，不論是否切碎臍帶組織，兩組試驗(yàn)皆生出細(xì)胞。于培養(yǎng)第10天時(shí)計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)物上的細(xì)胞群落數(shù)量。如圖6A所示，從切碎的臍帶組織塊所衍生的細(xì)胞群落數(shù)量是從未切碎的臍帶組織部分所衍生的細(xì)胞群落數(shù)量的20. 5倍。計(jì)算細(xì)胞群落數(shù)量時(shí)是以出現(xiàn)干細(xì)胞外移現(xiàn)象的臍帶組織塊數(shù)量為依據(jù)。換言之，出現(xiàn)干細(xì)胞外移現(xiàn)象的臍帶組織塊數(shù)量即為細(xì)胞群落的數(shù)量。如圖6B所示，從切碎的臍帶組織塊所衍生的細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞數(shù)量是從未切碎的臍帶組織部分所衍生的細(xì)胞的相對(duì)細(xì)胞數(shù)量的11. 17倍。結(jié)果顯示，將臍帶組織切碎成小塊會(huì)影響臍帶組織所產(chǎn)出的干細(xì)胞數(shù)量。因此，結(jié)果顯示，臍帶組織依本發(fā)明的方式切碎并冷凍保存后所能產(chǎn)出的臍帶組織衍生干細(xì)胞遠(yuǎn)多于未切碎的臍帶組織于冷凍保存后所能產(chǎn)出的臍帶組織衍生干細(xì)胞。此項(xiàng)發(fā)現(xiàn)具有重要臨床意義，因?yàn)楸仨氃诙虝r(shí)間內(nèi)提供足量的干細(xì)胞才能將細(xì)胞治療的風(fēng)險(xiǎn)降到最低。上述臍帶組織衍生細(xì)胞均表達(dá)出BMP4、0ct4、REXl、S0X2與Nanog等多能干細(xì)胞標(biāo)記。如圖7所示的瓊脂凝膠帶為RT-PCR的DNA產(chǎn)物，顯示該等干細(xì)胞標(biāo)記在從切碎的臍帶組織所衍生的細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)。結(jié)果顯示，依本發(fā)明的方式從切碎的臍帶組織所衍生的干細(xì)胞為多能的初期干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，從切碎的臍帶組織所衍生的干細(xì)胞可做為飼養(yǎng)細(xì)胞，以支持造血干細(xì)胞(HSC)的成長(zhǎng)與增殖。臍帶組織衍生細(xì)胞與HSC的共同培養(yǎng)物可形成一鵝卵石結(jié)構(gòu)(圖8A)，其中每一鵝卵石皆為一HSC細(xì)胞團(tuán)，其在相位差顯微鏡中呈現(xiàn)灰暗的鵝卵石狀。形成鵝卵石結(jié)構(gòu)的原理如下松散浮動(dòng)在飼養(yǎng)細(xì)胞上的HSC為球形，因而具有折射性，而位于飼養(yǎng)細(xì)胞下方的HSC則為扁平狀，故不具有折射性。結(jié)果顯示，將造血干細(xì)胞與臍帶組織塊衍生干細(xì)胞一同培養(yǎng)可促進(jìn)造血干細(xì)胞的增長(zhǎng)。發(fā)明人也在依本發(fā)明而取得的臍帶組織衍生干細(xì)胞中偵測(cè)與細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)途徑。偵測(cè)得到的信號(hào)如圖8B所示，包括IGF-2信號(hào)途徑，如IGF-2與IGFBP5 ;FGF信號(hào)途徑，如FGF-I與FGF-2 ;間隙連接信號(hào)途徑，如Panx-I、Panx_2 ；EMT途徑，如a -SMA、骨橋蛋白、CK18、Twist、BMP-4、TGF-β I ;早期基因，如0ct4、Rexl、S0X2 ;其它基因，如血管生成素類-2(Angptl-2)、dlk ;Wnt信號(hào)途徑，如Wnt5a、SFRP1、Dkk3 ;表面標(biāo)記，如CD13 ;以及黏著分子，如N型|丐黏素(N-cadherin)、β -連鎖蛋白(β -catenin)。
衍生自切碎臍帶組織的細(xì)胞為多能干細(xì)胞，其具有形成脂肪、軟骨以及血管生成與血管新生的能力。圖9A顯示在脂肪介質(zhì)中經(jīng)過(guò)4周培養(yǎng)后、由臍帶組織衍生干細(xì)胞分化而成且經(jīng)油紅染色的脂肪細(xì)胞。在軟骨介質(zhì)中培養(yǎng)2至3周可誘導(dǎo)臍帶組織衍生干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞，其以阿爾辛藍(lán)染色后呈現(xiàn)陽(yáng)性(圖9B)。內(nèi)皮生長(zhǎng)介質(zhì)-2(EGM-2)則可誘導(dǎo)臍帶組織衍生干細(xì)胞分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞(圖9C)，其中分化后的細(xì)胞變?yōu)殚L(zhǎng)形且相互連結(jié)，最后形成毛細(xì)管狀網(wǎng)絡(luò)。在此利用流動(dòng)式細(xì)胞測(cè)量法偵測(cè)細(xì)胞的尺寸(直徑)、粒度與表面抗原在血管生成誘導(dǎo)前、后的變化。圖IOA與IOD顯示細(xì)胞尺寸與粒度皆產(chǎn)生變化。此外，誘導(dǎo)分化細(xì)胞以抗VEGF-Rl與抗VE-Cad抗體染色后呈現(xiàn)陽(yáng)性(圖10B、10C、IOE與10F)，顯示分化細(xì)胞具有血管內(nèi)皮細(xì)胞的特征。冷凍保存的臍帶組織塊，其產(chǎn)生臍帶衍生干細(xì)胞的能力乃受到臍帶組織于冷凍溶液中培養(yǎng)的時(shí)間長(zhǎng)短的影響。圖11顯示群落形成單位(CFU)的數(shù)量與冷凍溶液培養(yǎng)時(shí)間 的關(guān)系。各樣本以冷凍溶液分別培養(yǎng)不同時(shí)間后，將各樣本的CFU與培養(yǎng)30分鐘的樣本比較。實(shí)驗(yàn)中共使用3個(gè)捐贈(zèng)者樣本(η = 3)。P值< O. 05者以星號(hào)標(biāo)示。長(zhǎng)條顯示平均值土SEM。結(jié)果顯示，以冷凍溶液持續(xù)培養(yǎng)的適當(dāng)時(shí)間為20至40分鐘，最佳培養(yǎng)時(shí)間則為30分鐘。僅以冷凍溶液培養(yǎng)O至20分鐘的臍帶組織塊并未充分貼附于培養(yǎng)皿的底面。臍帶組織塊若能貼附于培養(yǎng)皿底面，將使MSC更容易貼附在培養(yǎng)皿的底面以利增長(zhǎng)。以冷凍溶液培養(yǎng)40至60分鐘的臍帶組織塊，其臍帶組織塊衍生MSC的產(chǎn)量并不穩(wěn)定，原因在于多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞數(shù)量差異頗大(相關(guān)數(shù)據(jù)恕未顯示)。以上為本發(fā)明的實(shí)施范例，其作用僅在于說(shuō)明，而非窮盡本發(fā)明的所有可能型態(tài)，且本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于上述型態(tài)。依據(jù)以上教導(dǎo)，當(dāng)可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的多種修改及變化。以上實(shí)施例與范例的選擇與描述，是為解釋本發(fā)明的原理及其實(shí)際應(yīng)用，使本領(lǐng)技術(shù)人員得以利用本發(fā)明及各種實(shí)施例，或依實(shí)際需要而以不同方式修改。本領(lǐng)技術(shù)人員可在不偏離本案實(shí)質(zhì)與范圍的情況下，容易想到多種替代實(shí)施例。因此，本發(fā)明的范圍取決于后附申請(qǐng)權(quán)利要求范圍，而非由以上敘述及其中所描述的實(shí)施范例加以定義。在本發(fā)明的上述說(shuō)明中曾引用若干參考文獻(xiàn)，包括專利、專利申請(qǐng)案及多種出版物。之所以引用及/或討論該些參考文獻(xiàn)乃為闡明本發(fā)明的內(nèi)容，而非承認(rèn)該些參考文獻(xiàn)為本發(fā)明的「背景技術(shù)」。本專利說(shuō)明書(shū)所引用與討論的所有參考文獻(xiàn)，在此以引用的方式將其全文并入本文，且其并入的程度一如各參考文獻(xiàn)是分別以引用的方式并入本文。
權(quán)利要求
1.一種保存臍帶的方法，包括下列步驟 獲取一段臍帶； 將臍帶切碎成臍帶組織塊，其中各臍帶組織塊的尺寸皆不大于2毫米； 將該臍帶組織塊與冷凍組合物混合，以形成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護(hù)劑與蛋白質(zhì)； 搖晃該混合物，且搖晃的時(shí)間不少于28分鐘但亦不超過(guò)32分鐘；以及 冷凍保存該混合物。
2.一種保存臍帶的方法，包括下列步驟 獲取一段臍帶； 將臍帶切碎成臍帶組織塊； 將該臍帶組織塊與冷凍組合物混合，以形成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護(hù)劑與蛋白質(zhì)； 搖晃該混合物，且搖晃的時(shí)間不少于20分鐘但亦不超過(guò)40分鐘；以及 冷凍保存該混合物。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中各臍帶組織塊的尺寸為2毫米或小于2毫米。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，包括搖晃所述混合物25至35分鐘。
5.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中搖晃步驟是在低于15°C的溫度下實(shí)施。
6.如權(quán)利要求5或3所述的方法，其中搖晃步驟是在介于0°C與10°C之間的溫度下實(shí)施。
7.如權(quán)利要求6或3所述的方法，其中搖晃步驟是在不超過(guò)4°C的溫度下實(shí)施。
8.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中搖晃步驟實(shí)施28至32分鐘。
9.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中臍帶組織塊未經(jīng)酶消化處理。
10.一種從一段臍帶中獲取臍帶組織衍生干細(xì)胞的方法，其包括下列步驟 獲取一段臍帶； 將臍帶切碎成臍帶組織塊； 將該臍帶組織塊與冷凍組合物混合，以形成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護(hù)劑與蛋白質(zhì)； 搖晃該混合物，且搖晃的時(shí)間不少于20分鐘但亦不超過(guò)40分鐘； 冷凍保存該混合物； 使該混合物解凍，并去除冷凍組合物；以及 在培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)該臍帶組織塊，以獲得臍帶組織衍生干細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中各臍帶組織塊的尺寸為2毫米或小于2毫米。
12.如權(quán)利要求10或11所述的方法，包括搖晃該混合物25至35分鐘。
13.如權(quán)利要求10或11所述的方法，其中所述臍帶組織塊未經(jīng)酶消化處理。
14.如權(quán)利要求10或11所述的方法，其中所述臍帶組織塊是在混合步驟前或在解凍步驟后接受酶消化處理。
15.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中冷凍組合物包括 (a)30%至50%的人類臍帶血血清或2. 5%至25%的血清白蛋白； (b)5.5%至55%的二甲基亞砜；以及·0.5%至5%的葡聚糖。
全文摘要
在此披露一種保存臍帶的方法，該方法包括獲取一段臍帶；將臍帶切碎成臍帶組織塊；將臍帶組織塊與冷凍組合物混合以形成混合物，其中冷凍組合物包括冷凍保護(hù)劑與蛋白質(zhì)；搖晃該混合物，搖晃時(shí)間不少于20分鐘但亦不超過(guò)40分鐘；然后冷凍保存該混合物。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102960334SQ20111042772
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月1日
發(fā)明者章修綱, 羅瑋瑜 申請(qǐng)人:生寶生物科技股份有限公司