專利名稱：一種誘導(dǎo)毛脈蓼產(chǎn)生毛狀根的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)毛脈蓼產(chǎn)生毛狀根的方法，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)毛脈蓼試管苗葉片獲得毛脈蓼毛狀根，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1982 年，Chilton 等人首次報(bào)道了發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes) Ri 質(zhì)粒在感染植物細(xì)胞時(shí)，通過(guò)細(xì)菌和植物細(xì)胞之間的附著，Vir基因(virulencegene)的激活和表達(dá)，其T-DNA (transferred DNA)片段被轉(zhuǎn)移、插入并穩(wěn)定地在植物細(xì)胞基因組中表達(dá)誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生毛狀根(hairy roots)。與培養(yǎng)細(xì)胞相比，毛狀根培養(yǎng)具有激素自主性快速生長(zhǎng)、分化，次生代謝物種類多、含量高，遺傳性穩(wěn)定，且在基因轉(zhuǎn)移過(guò)程中無(wú)需標(biāo)記基因等優(yōu)點(diǎn)，使毛狀根在生產(chǎn)植物次生代謝物和傳統(tǒng)中藥材有效成分方面具有很大的工業(yè)化生產(chǎn)潛力，并取得了飛速的發(fā)展。毛脈蓼(Λ^τ^ο/" ciliinerve (Nakai) Ohwi)，亦名朱砂七，別名朱砂蓮、紅藥子，始載于《圖經(jīng)本草》，為蓼科蓼屬的多年生纏繞草本植物，分布于中國(guó)東北及陜西(大巴山)、湖北、四川、貴州等省，海拔200 - 2700 m。毛脈蓼主要藥用部位為根莖，含食用大黃甙 (rhapontin)、蒽醌類物質(zhì)及鞣質(zhì)，其味苦、性涼，功能清熱解毒、活血涼血、止血止瀉、去風(fēng)濕、強(qiáng)腰膝，民間廣泛用于治療急性胃痛、胃腸炎、菌痢、扁桃體炎、尿路感染及跌打損傷、風(fēng)濕腰痛等癥，臨床效果顯著，為“太白七藥”之一。目前毛脈蓼的藥用價(jià)值已經(jīng)得到臨床證實(shí)，有關(guān)毛脈蓼的研究多集中在其藥用有效成分的檢測(cè)分離，未見(jiàn)利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的毛脈蓼獲得毛狀根，繼而進(jìn)行其藥用有效成分利用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以毛脈蓼葉片外植體為受體，利用含甘露堿型Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株w. T15834對(duì)其侵染轉(zhuǎn)化，歷經(jīng)共培養(yǎng)、篩選培養(yǎng)、鑒定，誘導(dǎo)和培養(yǎng)獲得毛脈蓼毛狀根。本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)過(guò)程如下
一種誘導(dǎo)毛脈蓼產(chǎn)生毛狀根的方法，其以毛脈蓼葉片為外植體，通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌株 W. T15834對(duì)其誘導(dǎo)形成毛狀根，培養(yǎng)得到大量毛脈蓼毛狀根。具體誘導(dǎo)毛脈蓼產(chǎn)生毛狀根的步驟如下
(1)選取在MS固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)的毛脈蓼20天齡無(wú)菌苗的幼嫩葉片切成1.0cm2 大小的不具葉柄的葉片外植體，置于MS基本培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)Mh ；
(2)浸入用MS液體培養(yǎng)基稀釋5倍的發(fā)根農(nóng)桿菌W.T15834菌懸液中震蕩，取出外植體，用無(wú)菌濾紙吸去多余菌液并放回原培養(yǎng)基上黑暗共培養(yǎng)5天；
(3)轉(zhuǎn)入MS篩選培養(yǎng)基上，在25°C、每天14h散射光下培養(yǎng)誘導(dǎo)形成毛狀根；
(4)切取從葉片外植體切口中脈處產(chǎn)生的毛狀根，置于MS篩選培養(yǎng)基上除菌培養(yǎng)，每7天繼代一次獲得無(wú)菌毛脈蓼毛狀根；
(5)毛脈蓼毛狀根培養(yǎng)于MS固體或液體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，最好在1/2MS液體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)時(shí)間為4周。所述MS液體培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基，附加30 g/L蔗糖，pH為5. 8 6. 2。所述MS固體培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基，附加30 g/L蔗糖，7 g/L瓊脂，pH 為 5. 8 6. 2。所述MS篩選培養(yǎng)基組成為MS固體培養(yǎng)基，附加300 mg/L頭胞噻肟鈉，pH為 5. 8 6. 2。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果
本發(fā)明利用離體培養(yǎng)建立無(wú)菌快繁體系的基礎(chǔ)上，利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化毛脈蓼，可以獲得大量毛脈蓼毛狀根。對(duì)于用根的藥用植物而言，根中的次生代謝產(chǎn)物含量高于其他組織，在體外建立根培養(yǎng)體系利于藥用成分的提取利用。本發(fā)明所提供的毛脈蓼毛狀根的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，具有激素自主性快速生長(zhǎng)、分化，增殖系數(shù)高，遺傳穩(wěn)定，取材方便，不受季節(jié)限制，具有培養(yǎng)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于毛脈蓼轉(zhuǎn)基因技術(shù)的完善，為毛脈蓼毛狀根的大量培養(yǎng)及利用后期毛脈蓼毛狀根的次生產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化具有積極作用。


圖1毛脈蓼毛狀根的誘導(dǎo)和培養(yǎng)，A葉片IOd誘導(dǎo)的毛狀根，B MS固體繼代培養(yǎng)的5 d的毛狀根，C MS液體懸浮培養(yǎng)30 d的毛狀根；
圖2毛脈蓼毛狀根中甘露堿的檢測(cè)；1:甘露堿標(biāo)品2:未轉(zhuǎn)化植株根陰性對(duì)照3 7: 不同毛狀根的單克??；
圖3毛脈蓼毛狀根r^B基因PCR分析；M 分子量標(biāo)記1 :Ri質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照2 未轉(zhuǎn)化植株的陰性對(duì)照3 7 不同毛狀根的單克??； 圖4毛脈蓼毛狀根MS固/液培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線； 圖5 MS固/液培養(yǎng)對(duì)毛脈蓼毛狀根生長(zhǎng)量的影響。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明。本發(fā)明使用的MS培養(yǎng)基按手冊(cè)通用方法配制，組成與含量如下大量元素NH4N03 1650mg/L, KNO3 1900 mg/L, CaCl2 · 2H20 440 mg/L, MgSO4 · 7H20 370mg/L, KH2PO4 1700mg/L ；微量元素KI 0. 83 mg/L, H3BO3 6. 2 mg/L, MnSO4 · 4H20 22. 3 mg/L, ZnSO4 · 7H208. 6 mg/L, Na2Mn04 · 2H20 0. 25 mg/L, CuSO4 · 5H20 0. 025 mg/L, CoCl2 · 6H20 0. 025mg/L,FeSO4 ·7Η20 (27. 8)mg/L +Na2-EDTA ·2Η20 (27. 3)mg/L ；有機(jī)成分肌醇 IOOmg/ L，煙酸0.5 mg/L，鹽酸吡哆醇(維生素 )0.5 mg/L，鹽酸硫胺素(維生素B1) 0. 5mg/L，甘氨酸2 mg/L。本發(fā)明使用的培養(yǎng)基組成如下
MS固/液體培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基，附加30 g/L蔗糖，pH為5. 8 6. 2 ；MS 固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加入7 g/L瓊脂。MS篩選培養(yǎng)基組成為MS固體培養(yǎng)基，附加300 mg/L頭胞噻肟鈉(cefotaxime)pH 為 5. 8 6. 2。YEB基本培養(yǎng)基組成為牛肉浸膏5 g/L，酵母浸膏1 g/L，蛋白胨5 g/L，蔗糖5 g/ L，0. 002 mmol/L MgSO4. 7H20 ；
YEB固/液體培養(yǎng)組成為YEB基本培養(yǎng)基，附加lOOyg/mL鏈霉素(Str. )，pH7. 2 ;YEB 固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加入15g/L瓊脂。在本發(fā)明的下述實(shí)施實(shí)例中，所用菌株為發(fā)根農(nóng)桿菌(A rhizogenes) M 株W. T15834，為陜西省生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存菌種；實(shí)驗(yàn)材料毛脈蓼(Polygonum ciliinerve (Nakai) Ohwi )采自西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物園。實(shí)施例1 毛脈蓼毛狀根誘導(dǎo)
1.細(xì)菌菌株及培養(yǎng)YEB固體培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)發(fā)根農(nóng)桿菌W. T15834后，挑取單菌落， 25°C活化J8°C，200 r/min黑暗震蕩培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接到新鮮YEB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至0D_為 0.6時(shí)供感染用。2.外植體制備毛脈蓼20 d齡無(wú)菌苗的幼嫩葉片切成約1.0 cm2大小的不具葉柄的葉片外植體，并置于MS固體培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)24h后，用于轉(zhuǎn)化。3.毛狀根的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)將上述預(yù)培養(yǎng)Mh的毛脈蓼葉片外植體浸入用MS 培養(yǎng)基稀釋5倍的發(fā)根農(nóng)桿菌W. T15834菌懸液中輕輕震蕩lOmin，取出外植體，用無(wú)菌濾紙吸去多余菌液并放回原培養(yǎng)基上黑暗共培養(yǎng)5天后，轉(zhuǎn)入MS篩選培養(yǎng)基上，在25°C、每天 14h散射光下培養(yǎng)誘導(dǎo)毛狀根。發(fā)根農(nóng)桿菌感染的葉片外植體培養(yǎng)10天后，從其葉片切口中脈處產(chǎn)生毛狀根(圖1，A)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加數(shù)量增多，毛狀根產(chǎn)生頻率約為35. 3%。 切下毛狀根置于MS篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔7天左右轉(zhuǎn)接一次，5 6次后可完全除菌。之后可在MS固體培養(yǎng)基上快速自主生長(zhǎng)(圖1，B)，并且分枝較多，也可在MS液體培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)(圖1，C)。對(duì)照結(jié)果表明無(wú)菌苗的離體根(未用農(nóng)桿菌感染)不能在MS固體培養(yǎng)基上自主生長(zhǎng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸褐化壞死。實(shí)施例2 毛脈蓼毛狀根甘露堿的檢測(cè)
以非轉(zhuǎn)化植株根為陰性對(duì)照，甘露堿標(biāo)準(zhǔn)品(1.02 mg/m /L)為陽(yáng)性對(duì)照，參考王關(guān)林等的方法，檢測(cè)轉(zhuǎn)化毛根內(nèi)的甘露堿。發(fā)根農(nóng)桿菌W. T15834的Ri質(zhì)粒TR-DNA (T-DNA右臂)區(qū)中編碼冠癭堿合成酶的基因可以整合到毛脈蓼基因組DNA中，并且在毛脈蓼細(xì)胞中得到表達(dá)出特異產(chǎn)物甘露堿(圖2)。實(shí)施例3 毛脈蓼毛狀根的PCR檢測(cè)
1.植物DNA提取用微量CTAB法提取毛狀根DNA，以非轉(zhuǎn)化植株毛狀根總DNA作為對(duì)照，純化后用作PCR擴(kuò)增的模板。2.發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒DNA提取取200μ1活化的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株W.T15834菌液，6000 r/min離心5min，收集沉淀菌體，加入40μ1裂解液(上海生工技術(shù)公司)，懸浮混勻，94°C裂解15min，13,000 r/min離心5min，取上清液備用。并取少量上清液測(cè)其OD6c 值為 0. 6。3. PCR反應(yīng)反應(yīng)體系20 μ L，其中DNA模板1 μ g，上下游引物各1 μ L(終濃度 20 pmol/L)，所用引物根據(jù)Ri質(zhì)粒TL-DNA上存在的與毛狀根發(fā)生相關(guān)基因r^B設(shè)計(jì)(上海生工技術(shù)公司合成)，上游引物為 &-GATATATGCCAAATTTACACTAG-3’， 下游引物為 &-GTTAACAAAGTAGGAAACAGG-3’。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min ；94°C變性40 s ；52°C退火55 s ；72°C，延伸1 min;循環(huán)5次；94°C變性50 s;50°C退火50 s ;72°C延伸1 min ;30次循環(huán)；72°C，延伸10 min0預(yù)期產(chǎn)物大小為564bp。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和KBr染色進(jìn)行分析。PCR反應(yīng)可以從毛脈蓼毛狀根的基因組DNA中擴(kuò)增到預(yù)期的564bp左右的特異性 DNA片段(圖3)，即發(fā)根農(nóng)桿菌W. T15834的rW基因的RiTL-DNA部分已整合在毛脈蓼基因組中。實(shí)施例4 毛脈蓼毛狀根的MS固/液體培養(yǎng)
切取MS篩選培養(yǎng)基鑒定的毛狀根各約0. 5克，分別于MS固/液體培養(yǎng)基上，在^rc, 暗培養(yǎng)/lOOr/min震蕩培養(yǎng)，除菌、篩選培養(yǎng)，定期收集，濾紙吸干水分后進(jìn)行鮮重和干重測(cè)量，統(tǒng)計(jì)分析固/液體培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線及對(duì)毛狀根生長(zhǎng)的影響。毛脈蓼無(wú)菌毛狀根MS固 /液體培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)曲線(圖4)結(jié)果得知其生長(zhǎng)可基本分成3個(gè)階段，即前2周的快速生長(zhǎng)階段，3 5周的持續(xù)增長(zhǎng)5周后生長(zhǎng)速度減慢，以此毛脈蓼毛狀根培養(yǎng)的最佳繼代培養(yǎng)時(shí)間為4周。培養(yǎng)方式對(duì)毛脈蓼毛狀根生長(zhǎng)有影響。無(wú)菌毛狀根在MS固/液體培養(yǎng)基上均能快速生長(zhǎng)，但在MS液體培養(yǎng)中的生長(zhǎng)速度比MS固體培養(yǎng)的要快，1/2MS液體培養(yǎng)中生長(zhǎng)速度最快，效果優(yōu)于MS液體或固體培養(yǎng)。繼代3次后，1/2MS液體培養(yǎng)的毛狀根的鮮重和干重分別為MS固體培養(yǎng)的2. 72,2. 47倍，是MS液體培養(yǎng)的1. 26,1. 17倍(圖5)。本發(fā)明所提供的毛脈蓼毛狀根的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，具有激素自主性快速生長(zhǎng)、分化，增殖系數(shù)高，發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后10天可以產(chǎn)生毛狀根，產(chǎn)生頻率約為35. 3%，最佳繼代培養(yǎng)條件為1/2MS液體培養(yǎng)，4周收獲，短時(shí)間內(nèi)可以得到大量毛脈蓼毛狀根，具有遺傳穩(wěn)定，取材方便，不受季節(jié)限制，具有培養(yǎng)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于毛脈蓼轉(zhuǎn)基因技術(shù)的完善，為毛脈蓼毛狀根的大量培養(yǎng)和及利用后期毛脈蓼毛狀根的次生產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化具有積極作用。
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)毛脈蓼產(chǎn)生毛狀根的方法，其特征在于以毛脈蓼葉片為外植體，通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌株w. T15834對(duì)其誘導(dǎo)形成毛狀根，培養(yǎng)得到大量毛脈蓼毛狀根。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)毛脈蓼產(chǎn)生毛狀根的方法，其特征在于包括以下步驟(1)選取在MS固體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)的毛脈蓼20天齡無(wú)菌苗的幼嫩葉片切成1.0cm2 大小的不具葉柄的葉片外植體，置于MS基本培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)Mh ；(2)浸入用MS液體培養(yǎng)基稀釋5倍的發(fā)根農(nóng)桿菌W.T15834菌懸液中震蕩，取出外植體，用無(wú)菌濾紙吸去多余菌液并放回原培養(yǎng)基上黑暗共培養(yǎng)5天；(3)轉(zhuǎn)入MS篩選培養(yǎng)基上，在25°C、每天14h散射光下培養(yǎng)誘導(dǎo)形成毛狀根；(4)切取從葉片外植體切口中脈處產(chǎn)生的毛狀根，置于MS篩選培養(yǎng)基上除菌培養(yǎng)，每7 天繼代一次獲得無(wú)菌毛脈蓼毛狀根；(5)毛脈蓼毛狀根培養(yǎng)于MS固體或液體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)毛脈蓼產(chǎn)生毛狀根的方法，其特征在于MS液體培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基，附加30 g/L蔗糖，pH為5. 8 6. 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)毛脈蓼產(chǎn)生毛狀根的方法，其特征在于MS固體培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基，附加30 g/L蔗糖，7 g/L瓊脂，pH為5. 8 6. 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的誘導(dǎo)毛脈蓼產(chǎn)生毛狀根的方法，其特征在于MS篩選培養(yǎng)基組成為=MS固體培養(yǎng)基，附加300 mg/L頭胞噻肟鈉，pH為5. 8 6. 2。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)毛脈蓼產(chǎn)生毛狀根的方法，其特征在于毛脈蓼毛狀根繼代培養(yǎng)時(shí)間為4周。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)毛脈蓼產(chǎn)生毛狀根的方法，其特征在于毛脈蓼毛狀根繼代培養(yǎng)于1/2MS液體培養(yǎng)基上。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種誘導(dǎo)毛脈蓼產(chǎn)生毛狀根的方法，其以毛脈蓼葉片為外植體，通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌株W.T15834對(duì)其誘導(dǎo)形成毛狀根，培養(yǎng)得到大量毛脈蓼毛狀根。本發(fā)明利用離體培養(yǎng)建立無(wú)菌快繁體系的基礎(chǔ)上，利用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化毛脈蓼，可以獲得大量毛脈蓼毛狀根。本發(fā)明毛脈蓼毛狀根的誘導(dǎo)和培養(yǎng)方法，具有激素自主性快速生長(zhǎng)、分化，增殖系數(shù)高，遺傳穩(wěn)定，取材方便，不受季節(jié)限制，具有培養(yǎng)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于毛脈蓼轉(zhuǎn)基因技術(shù)的完善，為毛脈蓼毛狀根的大量培養(yǎng)及利用后期毛脈蓼毛狀根的次生產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化具有積極作用。
文檔編號(hào)A01H5/06GK102517322SQ20111042071
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者步懷宇, 王英娟 申請(qǐng)人:西北大學(xué)