專利名稱：一種低蛋白米的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體是利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將控制低蛋白的 QTL聚合到同一個水稻品種內(nèi)，從而達(dá)到降低大米內(nèi)蛋白質(zhì)含量的方法。
背景技術(shù)：
腎病是嚴(yán)重危害人類健康的大敵，這類疾病不但難治，而且容易復(fù)發(fā)，從而導(dǎo)致疾病不斷惡化。隨著我國經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展和人民生活水平的不斷提高及人口老齡化等因素， 人們對健康的關(guān)注達(dá)到前所未有的程度。然而我國腎病的患者人數(shù)卻呈不斷增長的趨勢。 由于腎功能衰竭引起的腎病患者在蛋白質(zhì)代謝方面存在障礙，在進(jìn)行治療時，除服用藥物夕卜，如果能配合低蛋白飲食，就能更有效地限制蛋白質(zhì)攝入量，減少血中的氮素滯留，減輕腎臟的負(fù)擔(dān)，從而延緩慢性腎功能衰竭的進(jìn)程。由于普通品種大米的易消化蛋白質(zhì)含量都高于4%，腎病患者不宜長期直接食用，為了配合治療，他們只能食用經(jīng)過加工的低蛋白食品?？墒沁@些代替食品價格高、口味差，不但增加了患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、精神壓力，還不容易長期堅持食用，反而降低了治療效果。因此，采用適合腎病患者食用的低蛋白米來配合治療，顯得尤為重要。自1994年日本在世界上首次選育出低蛋白米功能稻品種。多年臨床試驗的結(jié)果表明，患者食用低蛋白稻米，可以減少非優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)攝入量，增加優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)攝入量，血清肌酸酐含量明顯降低，達(dá)到減輕腎臟負(fù)擔(dān)的目的。同時還能保證機體有充足的熱量供應(yīng)。能防止腎功能衰退，可有效緩解病情，減輕患者精神經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、提高療效。特別是對以米飯為主食的患者效果更加顯著。我國在腎病、糖尿病食療方面積累了豐富經(jīng)驗，許多醫(yī)學(xué)專家、 營養(yǎng)學(xué)家都著書，闡述低蛋白飲食在糖尿病、腎病治療中的重要性。因為普通谷物中可消化蛋白質(zhì)含量在8%-10%，不適于患者食用。因此，亟待開發(fā)適于腎病患者食用的低蛋白米。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備低蛋白米的方法，其可消化蛋白質(zhì)含量在5% (重量比)以下。稻米的蛋白質(zhì)含量屬于數(shù)量遺傳性狀，受多基因控制，這些基因位點被稱作 quantitative trait locus，即QTL，這些QTL能夠通過QTL定位軟件檢測到。野生稻中有些類型蛋白質(zhì)含量低，適于腎病患者食用，但是由于野生稻落粒性強，不易收獲，同時野生稻產(chǎn)量極低，因此，無法直接利用，必須加以改良。改良的方法就是通過將野生稻與栽培稻雜交，并連續(xù)與栽培稻回交，保證雜交后代中的主要農(nóng)藝性狀與栽培稻親本相似，這樣才能獲得較高的產(chǎn)量。同時，在有些后代中就會同時聚集野生稻的控制低蛋白的基因座位和栽培稻的控制低蛋白的基因座位，而這些材料的其他農(nóng)藝性狀如株型、抗病性、高產(chǎn)性等又較為理想，得到適于大面積生產(chǎn)并獲得較高產(chǎn)量同時蛋白質(zhì)含量低的品系。本發(fā)明的技術(shù)方案，一種低蛋白米的制備方法，包含以下步驟
(1)首先收集栽培稻品種和野生稻材料，并分別測定籽粒蛋白質(zhì)含量；
(2)選擇低蛋白含量的品種和低蛋白含量的野生稻雜交獲得雜交一代即Fl的種子；(3)種植F1，利用分子標(biāo)記技術(shù)剔除假雜種，令其自交獲得F2的種子；
(4)剝?nèi)2種子的胚消毒后培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基上，獲得幼苗后并令其結(jié)種子，取葉片用常規(guī)法提取葉片DNA，并用在野生稻和栽培稻間這兩個親本間擴(kuò)增出的DNA條帶有差異的SSR引物，利用PCR儀擴(kuò)增F2的DNA，確定每對引物在各個幼苗中的帶型，即屬于野生稻的帶型、屬于栽培稻的帶型和屬于野生稻與栽培稻的混合帶型，以此構(gòu)建分子標(biāo)記遺傳圖譜，作為QTL定位的基因型數(shù)據(jù)；同時測定F2胚乳部分的蛋白質(zhì)含量，作為QTL定位的表現(xiàn)型數(shù)據(jù)。(5)利用QTL分析軟件對基因型和表現(xiàn)型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得控制蛋白質(zhì)含量的 QTL情報信息。(6 )依據(jù)分子標(biāo)記遺傳圖譜選同時具有所有來源于野生稻的，控制低蛋白的，并且是純合QTL的F2植株與栽培稻親本回交，獲得BClFl的種子；
(7)種植BC1F1，經(jīng)分子標(biāo)記技術(shù)輔助選擇剔除假雜種，獲得BC1F2的大量種子；
(8)種植BC1F2，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)確定同時具有來源于野生稻的控制低蛋白的純合QTL (這些QTL因與某些SSR標(biāo)記連鎖而容易找到)的單株與栽培稻親本再次回交， 獲得BC2F1的種子；
(9)種植BC2F1，經(jīng)分子標(biāo)記技術(shù)輔助選擇剔除假雜種，獲得BC2F2的大量種子；
(10)按照(8)的方法選擇農(nóng)藝性狀好，同時具有野生稻的低蛋白的純合QTL，以及含有1個以上源于栽培稻的控制低蛋白的QTL的BC2F2單株與栽培稻親本再回交一次，獲得 BC3F1的種子；
(11)將得到的BC3F1的種子繁殖，經(jīng)分子標(biāo)記技術(shù)輔助選擇剔除假雜種，獲得大量的BC3F2的種子；
(12)種植BC3F2，選取農(nóng)藝性狀好的單株，通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)確定同時含有來源于野生稻的控制低蛋白的QTL的，同時含有2個以上源于栽培稻的控制低蛋白的QTL 的單株，在孕穗期采取尚未吐穗的穗子，在無菌條件下剝?nèi)∑浠ㄋ幎堵涞绞⒂谌瞧恐械臏邕^菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在暗光下培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，然后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分別誘導(dǎo)生根及出芽，最后形成實生苗，經(jīng)自然加倍后獲得染色體純合的個體。成熟后單株收獲種子，次年種植這些種子成株行，成熟后按照株行收獲，并采用凱氏定氮法測定其籽粒蛋白質(zhì)含量，從中發(fā)現(xiàn)3株農(nóng)藝性狀與越光相似而蛋白質(zhì)含量低于5. 0%的單株，蛋白質(zhì)含量最低的只有4. 1。經(jīng)連續(xù)2年種植，表明該單株低蛋白質(zhì)含量特性能夠穩(wěn)定遺傳。所述的制備方法，優(yōu)選的方案是，步驟(2)所述野生稻為云南元江普通野生稻。更優(yōu)選的是，所述云南元江普通野生稻的蛋白質(zhì)含量< 6. 5%。所述的制備方法，優(yōu)選的方案是，所述栽培稻品種為越光。更優(yōu)選的是，所述栽培稻品種的蛋白質(zhì)含量彡8. 7%。所述的制備方法，優(yōu)選的方案是，步驟(5)所述QTL分析軟件為Map Manager QTXb 17分析軟件。所述的制備方法，優(yōu)選的方案是，步驟(11)所得適于腎病患者食用的株系的蛋白
質(zhì)含量< 5%。所述的制備方法，優(yōu)選的方案是，步驟(3)中所述分子標(biāo)記方法為利用SSR引物或 Indel引物對葉片DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過聚丙烯凝膠電泳檢測所擴(kuò)增的DNA條帶是屬于哪個親本的方法。通過本發(fā)明提供的方法，能夠顯著降低大米的蛋白質(zhì)含量，其適于腎病患者食用， 達(dá)到減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，增加適口性和起到食療保健的作用。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例詳細(xì)說明本發(fā)明的方案，但保護(hù)范圍不被此限制。實施例利用系列號為W06的云南元江普通野生稻(0. rufipogon)，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)庫提供)與優(yōu)良栽培稻品種越光(蛋白質(zhì)含量8. 7%)雜交獲得低蛋白米新品系， 其包括步驟如下
(1)首先收集栽培稻品種和野生稻材料，并用國標(biāo)凱氏定氮法分別測定籽粒蛋白質(zhì)含量，選擇蛋白質(zhì)含量為6. 5%的元江普通野生稻與蛋白質(zhì)含量較低的優(yōu)良栽培稻品種越光作為親本，在出穗期采用手工去雄法以野生稻為母本、越光為父本雜交獲得雜交一代即Fl 的種子15粒；
(2)種植F1，采用常規(guī)CTAB法提取葉片的DNA，采用分子標(biāo)記技術(shù)利用在親本間有多態(tài)性的引物hdel-C4-6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，hdel-C4-6引物序列為上游引物 CCACGTATAAAGCAGTTTGTTAGG,下游引物 CAAGTGTGGTTGTTAGCATCAAA，采用 PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增， 擴(kuò)增片段大小為12^ρ，PCR反應(yīng)體系為20 μ L,包括IOX PCR緩沖液2 μ L (含Mg2+ )、 2.5 mmol/L dNTP 1 μ L、模板 DNA 1 μ L、Taq 酶 0. 2 yL( 5 U/μ L), Prmier (10 μ mol/L) 0.6 μ L、加去離子水至20 μ L。擴(kuò)增程序如下94度預(yù)變性5 min ;94度變性30s，55度退火30s，72度延伸1 min，35個循環(huán)；72度保溫10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯影，確定其中12粒為真雜種；
(3)Fl自交獲得5000余粒F2的種子；
(4)剝?nèi)?00粒F2種子的胚消毒后培養(yǎng)在MS固體培養(yǎng)基上，獲得幼苗并使其結(jié)種子， 取葉片提取葉片DNA，采用上述分子標(biāo)記技術(shù)，用在野生稻和栽培稻的2個親本間有多態(tài)性的138對SSR引物及hdel引物用PCR儀擴(kuò)增F2的DNA，經(jīng)8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，確定每對引物在各個幼苗中的帶型，即屬于野生稻的帶型、屬于栽培稻的帶型和屬于野生稻與栽培稻的混合帶型，采用Mapmarker/EXP3. 0進(jìn)行連鎖分析，用MapdrawV. 2. 1繪制連鎖圖譜，用Kosambi函數(shù)將標(biāo)記間的重組交換率轉(zhuǎn)變?yōu)檫z傳圖距單位一一厘摩(CM)。構(gòu)建好定位群體的分子標(biāo)記遺傳圖譜，作為QTL定位的基因型數(shù)據(jù)。同時測定F2胚乳部分的蛋白質(zhì)含量，作為QTL定位的表現(xiàn)型數(shù)據(jù)。(5)利用Map Manager QTXb 17分析軟件對基因型和表現(xiàn)型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，檢測到來自野生稻的控制低蛋白的QTL五個，其中三個位于第7染色體上，分別與R1C95、冊82、 RM172連鎖，第8和第10染色體上各有1個，分別與RM25及RM258連鎖；來自栽培稻的控制低蛋白的3個QTL全部位于第1染色體上，分別與R1C43、RM23和RM212連鎖；
(6)依據(jù)分子標(biāo)記遺傳圖譜選同時具有上述五個來源于野生稻的控制低蛋白QTL的F2 單株共10株作為父本與栽培稻親本越光回交，獲得BClFl的種子535粒；
(7)種植BC1F1，經(jīng)分子標(biāo)記技術(shù)輔助選擇剔除假雜種，所用SSR標(biāo)記為R1C95，RM295 的引物序列為上游引物CGAGACGAGCATCGGATAAG，下游引物GATCTGGTGGAGGGGAGG，PCR擴(kuò)增方法及電泳方法同上，獲得BC1F2的種子50000余粒；(8)剝?nèi)C1F2種子的胚消毒后接種在MS培養(yǎng)基上獲得幼苗并獲得種子，將其胚乳測定蛋白質(zhì)含量，選擇農(nóng)藝性狀好、蛋白質(zhì)含量低的單株提取葉片DNA，并利用上述與QTL緊密連鎖的引物，通過PCR擴(kuò)增經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測找到同時具有野生稻低蛋白的 5個純合QTL的單株3株與栽培稻親本越光再次回交，獲得BC2F1的種子387粒；
(9)種植BC2F1，經(jīng)分子標(biāo)記技術(shù)輔助選擇剔除假雜種，所用SSR標(biāo)記為R1C95，PCR擴(kuò)增方法及電泳方法同上，獲得BC2F2的種子45000余粒，
(10)按照(8)的方法將得到的低蛋白的，并經(jīng)分子標(biāo)記輔助選擇確認(rèn)的同時具有野生稻的低蛋白純合QTL以及具有1個以上源于栽培稻的低蛋白QTL的BC2F2單株共2株與越光再回交一次，獲得BC3F1的種子456粒；
(11)將得到的BC3F1的種子繁殖，經(jīng)分子標(biāo)記技術(shù)輔助選擇剔除假雜種，所用SSR
標(biāo)記為R1C95，PCR擴(kuò)增方法及電泳方法同上，獲得BC3F2的種子50000余粒；
(12)種植BC3F2，選取農(nóng)藝性狀好的單株，通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)確定同時含有
源于野生稻的控制低白的QTL的單株，以及至少含有2個以上源于栽培稻親本的低蛋
白QTL的單株共8株，在孕穗期采取尚未吐穗的穗子，在無菌條件下剝?nèi)∑浠ㄋ幎堵涞绞⒂谌瞧恐械臏邕^菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在暗光下培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，然后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分別誘導(dǎo)生根及出芽，最后形成實生苗，經(jīng)自然加倍后獲得染色體純合的單株325 株。成熟后單株收獲種子，次年種植這些種子成株行，成熟后按照株行收獲，并采用凱氏定氮法測定其籽粒蛋白質(zhì)含量，從中發(fā)現(xiàn)3株農(nóng)藝性狀與越光相似而蛋白質(zhì)含量低于5. 0%的單株，這3個株系各方面性狀均已穩(wěn)定，SSR分子標(biāo)記分析表明，其中的1株栽培稻中控制高蛋白的5個QTL被野生稻中的控制低蛋白質(zhì)含量的QTL替換掉，同時栽培稻中的控制低蛋白質(zhì)含量的3個QTL被保留。經(jīng)連續(xù)2年種植，表明該單株低蛋白質(zhì)含量特性能夠穩(wěn)定遺傳，其中一株的蛋白質(zhì)含量最低只有4. 1。
權(quán)利要求
1.一種低蛋白米的制備方法，其特征是，包括步驟如下(1)首先收集栽培稻品種和野生稻材料，并分別測定籽粒蛋白質(zhì)含量；(2)選擇低蛋白含量的品種和低蛋白含量的野生稻雜交獲得雜交一代即Fl的種子； 3)種植F1，利用分子標(biāo)記技術(shù)剔除假雜種，令其自交獲得F2的種子；(4)剝?nèi)2種子的胚消毒后培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基上，獲得幼苗后并令其結(jié)種子，取葉片用常規(guī)法提取葉片DNA，并用在野生稻和栽培稻間這兩個親本間擴(kuò)增出的DNA條帶有差異的SSR引物，利用PCR儀擴(kuò)增F2的DNA，確定每對引物在各個幼苗中的帶型，即屬于野生稻的帶型、屬于栽培稻的帶型和屬于野生稻與栽培稻的混合帶型，以此構(gòu)建分子標(biāo)記遺傳圖譜，作為QTL定位的基因型數(shù)據(jù)；同時測定F2胚乳部分的蛋白質(zhì)含量，作為QTL定位的表現(xiàn)型數(shù)據(jù)；(5)利用QTL分析軟件對基因型和表現(xiàn)型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得控制蛋白質(zhì)含量的QTL情報信息；(6)依據(jù)分子標(biāo)記遺傳圖譜選同時具有所有來源于野生稻的，控制低蛋白的，并且是純合QTL的F2植株與栽培稻親本回交，獲得BClFl的種子；(7)種植BC1F1，經(jīng)分子標(biāo)記技術(shù)輔助選擇剔除假雜種，獲得BC1F2的大量種子；(8)種植BC1F2，利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)確定同時具有來源于野生稻的控制低蛋白的純合QTL的單株與栽培稻親本再次回交，獲得BC2F1的種子；(9)種植BC2F1，經(jīng)分子標(biāo)記技術(shù)輔助選擇剔除假雜種，獲得BC2F2的大量種子；(10)按照(8)的方法選擇農(nóng)藝性狀好，同時具有野生稻的低蛋白的純合QTL，以及含有1個以上源于栽培稻的控制低蛋白的QTL的BC2F2單株與栽培稻親本再回交一次，獲得 BC3F1的種子；(11)將得到的BC3F1的種子繁殖，經(jīng)分子標(biāo)記技術(shù)輔助選擇剔除假雜種，獲得大量的 BC3F2的種子；(12)種植BC3F2，選取農(nóng)藝性狀好的單株，通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)確定同時含有來源于野生稻的控制低蛋白的QTL的，同時含有2個以上源于栽培稻的控制低蛋白的QTL的單株，在孕穗期采取尚未吐穗的穗子，在無菌條件下剝?nèi)∑浠ㄋ幎堵涞秸T導(dǎo)培養(yǎng)基上，在暗光下培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，然后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分別誘導(dǎo)生根及出芽，最后形成實生苗，經(jīng)自然加倍后獲得染色體純合的個體，成熟后單株收獲種子，次年種植這些種子成株行，成熟后按照株行收獲，并采用凱氏定氮法測定其籽粒蛋白質(zhì)含量，從中發(fā)現(xiàn)農(nóng)藝性狀與越光相似而蛋白質(zhì)含量低于5. 0%的單株，經(jīng)連續(xù)2年種植，表明該單株低蛋白質(zhì)含量特性能夠穩(wěn)定遺傳。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是，步驟(2)所述野生稻為云南元江普通野生稻。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是，所述云南元江普通野生稻的蛋白質(zhì)含量彡6. 5%ο
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是，所述栽培稻品種為越光。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征是，所述栽培稻品種的蛋白質(zhì)含量<8. 7%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是，步驟(5)所述QTL分析軟件為Map Manager QTXb 17 分析軟件。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是，所述分子標(biāo)記技術(shù)為利用SSR引物或 Indel引物對葉片DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過聚丙烯凝膠電泳檢測所擴(kuò)增的DNA條帶是屬于哪個親本的技術(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備低蛋白米的方法，是通過將野生稻與栽培稻雜交，并連續(xù)與栽培稻回交后多代自交，通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)等，經(jīng)過篩選得到適于大面積生產(chǎn)并獲得較高產(chǎn)量同時蛋白質(zhì)含量低的品系。本方法所得大米能夠顯著降低大米的蛋白質(zhì)含量，適于腎病患者食用，達(dá)到減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，增加適口性和起到食療保健的作用。
文檔編號A01H1/02GK102499059SQ20111033979
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者吳珊珊, 張思亮, 張思遠(yuǎn), 張文會, 李楠 申請人:聊城大學(xué)