專利名稱：植物抗性相關(guān)蛋白mag及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物抗性相關(guān)蛋白MAG及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物在栽培生產(chǎn)過程中常發(fā)生各種病害，一些病害對植物生長構(gòu)成極大威脅，嚴(yán)重?fù)p害農(nóng)作物其產(chǎn)量和質(zhì)量。對于植物病害，目前主要采用藥物措施防治。最近人們開始應(yīng)用非生物誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)植物抗病性，并已廣泛應(yīng)用于煙草、馬鈴薯、番茄、黃瓜、菜豆、水稻等多種重要農(nóng)作物。這種措施的效果雖然理想，但成本較高，并污染環(huán)境。因此，迫切需要開發(fā)新的生物學(xué)手段以提高植物自身的抗病性。系統(tǒng)獲得性抗性是植物的一種防御反應(yīng)，當(dāng)植物遭受病原體和害蟲攻擊時，這種反應(yīng)會被誘導(dǎo)，并且能夠迅速擴(kuò)散到植株的其它部位以保護(hù)植物。病程相關(guān)蛋白ra是一類逆境蛋白，被認(rèn)為在植物的抗病中起重要作用，其中編碼 PRl蛋白的基因常被用作植物抗病反應(yīng)和系統(tǒng)獲得抗性中的指示基因，PRl基因的表達(dá)在植物抗病反應(yīng)中起重要作用。PRl基因在正常生長條件下，本底表達(dá)量很低，也就是說I3Rl 基因啟動子在正常生長條件下基本不發(fā)揮啟動功能，受逆境誘導(dǎo)(遭受病害侵襲時啟動基因的表達(dá)。水楊酸是廣泛存在于植物體內(nèi)的酚類物質(zhì)，被認(rèn)為是誘發(fā)系統(tǒng)獲得性抗性的信號，可以誘導(dǎo)對病毒、細(xì)菌、真菌等多種病原體的抗性。研究表明，外施水楊酸后，PRl基因的轉(zhuǎn)錄被顯著激活。研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植物某部位遭受病原體攻擊之后，植物體內(nèi)水楊酸含量會增加，而且水楊酸的增加出現(xiàn)在PRl基因表達(dá)之前。植物中水楊酸的合成在很大程度上是通過異分支酸合成酶(ICS，isochorismate synthase) ICSl作用于底物異分支酸 (isochorismate)從而合成水楊酸。ICSl基因在正常生長條件下，本底表達(dá)量很低，也就是說ICSl基因啟動子在正常生長條件下基本不發(fā)揮啟動功能，受逆境誘導(dǎo)(病原菌侵染和紫外線照射)啟動基因的表達(dá)。到目前為止，僅僅發(fā)現(xiàn)ETHYLENEINSENSITIVE3(EIN3)和 EIN3-LIKE1能夠與SA生物合成關(guān)鍵基因ICSl啟動子直接結(jié)合，并且負(fù)調(diào)節(jié)SA的合成水平，尚未發(fā)現(xiàn)能通過正向誘導(dǎo)ICSl啟動子啟動ICSl基因表達(dá)，從而增加水楊酸合成水平的蛋白。另外研究發(fā)現(xiàn)SAR Deficient 1 (SARDl)和CBP60g蛋白是誘導(dǎo)ICSl基因表達(dá)和SA 合成的重要因子，但未能發(fā)現(xiàn)更多地通過正向誘導(dǎo)ICSl啟動子啟動ICSl基因表達(dá)，從而增加水楊酸合成水平的蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物抗性相關(guān)蛋白MAG及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白，命名為MAG蛋白，來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)，是如下(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的任意一種(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有誘導(dǎo)ICSl基因啟動子啟動功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)；(C)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有誘導(dǎo)PRl基因啟動子啟動功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)；(d)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物中的水楊酸合成相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)；(e)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列
標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(b)、(c)、(d)或(e)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)、(c)、(d)或(e)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列2 所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述蛋白的基因(MAG基因)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因可為如下1)至10)中任一所述的DNA分子1)序列表的序列2自5’末端第53至814位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表的序列2所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有誘導(dǎo)ICSl基因啟動子啟動功能的蛋白的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有誘導(dǎo)ICSl基因啟動子啟動功能的蛋白的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有誘導(dǎo)PRl基因啟動子啟動功能的蛋白的DNA分子；6)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有誘導(dǎo)PRl基因啟動子啟動功能的蛋白的DNA分子；7)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植物水楊酸合成相關(guān)蛋白的DNA分子；
8)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物水楊酸合成相關(guān)蛋白的DNA分子；9)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗性相關(guān)蛋白的DNA 分子；10)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物抗性相關(guān)蛋白的 DNA分子?！皣?yán)格雜交條件”通常指鹽濃度低于約1. 5M，通常為約0. 01-1. 0Μ，ρΗ在約7. 0-8. 3 之間，溫度在約30-60攝氏度之間。也可以通過添加去穩(wěn)定劑，例如甲酰胺，來實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格雜交條件。上述嚴(yán)格條件可為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。所述ICSl基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述PRl基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列4所示。含有所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的 DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動子或組成型啟動子，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG 起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因寸。所述重組表達(dá)載體具體可為在3^-FLAG表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入序列表的序列2所示DNA片段得到的重組質(zhì)粒；所述3^-FLAG表達(dá)載體為在pUC19載體的多克隆位點(diǎn) (如I3StI和EcoRI酶切位點(diǎn)之間)插入序列表的序列6所示DNA得到的重組質(zhì)粒。所述重組表達(dá)載體具體可為在所述3^-FLAG表達(dá)載體的^CbaI和BamHI酶切位點(diǎn)之間插入序列表的序列2所示的MAG基因得到的重組質(zhì)粒。擴(kuò)增所述基因的全長或其任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)所述蛋白或所述基因在誘導(dǎo)ICSl基因啟動子的啟動功能中的應(yīng)用；所述ICSl基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述應(yīng)用具體可為在擬南芥中誘導(dǎo)重組質(zhì)粒3^-ProAtresi: :GFP中的所述ICSl基因啟動子啟動GFP基因的表達(dá)；所述重組質(zhì)粒3^-ProAtiesi: :GFP為將326-GFP表達(dá)載體I3StI和BamHI酶切位點(diǎn)間的小片段 (35S組成型啟動子)取代為了序列表的序列3所示的ICSl基因啟動子(ftx)AtICSl)得到的重組質(zhì)粒；所述326-GFP表達(dá)載體為在pUC19載體的I^stI和EcoRI酶切位點(diǎn)之間插入序列表的序列7所示DNA得到的重組質(zhì)粒。所述GFP基因如序列表的序列7自5’末端第 862-1578位核苷酸所示。本發(fā)明還保護(hù)所述蛋白或所述基因在誘導(dǎo)PRl基因啟動子的啟動功能中的應(yīng)用； 所述PRl基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列4所示。所述應(yīng)用具體可為在擬南芥中誘導(dǎo)重組質(zhì)粒3^-ProAtPK1: :GFP中的所述PRl基因啟動子啟動GFP基因的表達(dá)；所述重組質(zhì)粒3^-ProAtPK1: :GFP為將326-GFP表達(dá)載體I3StI和BioI酶切位點(diǎn)間的小片段(35S組成型啟動子)取代為了序列表的序列4所示的PRl基因啟動子(ProAtPK1)得到的重組質(zhì)粒； 所述326-GFP表達(dá)載體為在pUC19載體的I^stI和EcoRI酶切位點(diǎn)之間插入序列表的序列 7所示DNA得到的重組質(zhì)粒。所述GFP基因如序列表的序列7自5，末端第862-1578位核苷酸所示。本發(fā)明還保護(hù)所述蛋白或所述基因在培育抗性植物中的應(yīng)用。所述抗性體現(xiàn)為水楊酸合成能力增加和/或抗病害能力增加。所述植物為雙子葉植物或單子葉植物，如擬南芥。所述病害的致病菌可為丁香假單胞桿菌番茄致病變種(細(xì)菌)和/或蕓苔霜霉菌(真菌)，該兩種微生物均危害葉片。所述病害的致病菌還可為根際萎凋病菌。所述擬南芥具體可為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，將MAG基因融合到含有FLAG報(bào)告基因的轉(zhuǎn)化表達(dá)載體中，通過與連接有ICSl基因啟動子的GFP報(bào)告基因的轉(zhuǎn)化表達(dá)載體共同瞬時轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體，根據(jù)熒光顯微鏡觀察植物原生質(zhì)體是否產(chǎn)生綠色熒光，并提取原生質(zhì)體總蛋白，分別用GFP和FLAG的抗體進(jìn)行Wfestern Blotting試驗(yàn)。結(jié)果表明，MAG基因可以誘導(dǎo)ICSl基因啟動子的啟動功能，從而促使GFP報(bào)告基因表達(dá)。 在本發(fā)明的另一個實(shí)施例中，將MAG基因融合到含有FLAG報(bào)告基因的轉(zhuǎn)化表達(dá)載體中，通過與連接有PRl基因啟動子的GFP報(bào)告基因的轉(zhuǎn)化表達(dá)載體共同瞬時轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體，根據(jù)熒光顯微鏡觀察植物原生質(zhì)體是否產(chǎn)生綠色熒光，并提取原生質(zhì)體總蛋白，分別用GFP和FLAG的抗體進(jìn)行Wfestern Blotting試驗(yàn)。結(jié)果表明，MAG基因可以誘導(dǎo)PRl基因啟動子的啟動功能，從而促使GFP報(bào)告基因表達(dá)。本發(fā)明提供的MAG蛋白可以通過調(diào)控植物中水楊酸的合成，增強(qiáng)植物的抗病性。 本發(fā)明對于培育抗病植物均有重大價(jià)值。


圖1為PCR擴(kuò)增獲得MAG基因的電泳圖。圖2為重組質(zhì)粒326-MAG-FLAG的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為PCR擴(kuò)增獲得ICSl基因啟動子的電泳圖。圖4為重組質(zhì)粒326-ftx)AtIcsl: :GFP的結(jié)構(gòu)示意圖。圖5為PCR擴(kuò)增獲得PRl基因啟動子的電泳圖。圖6為重組質(zhì)粒3^_ProAtPK1: :GFP的結(jié)構(gòu)示意圖。圖7為重組質(zhì)粒326-MAG-FLAG和重組質(zhì)粒3^_ProAtresi :GFP共同轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后，GFP熒光蛋白的顯微鏡觀測結(jié)果。圖8為重組質(zhì)粒326-MAG-FLAG和重組質(zhì)粒3^_ProAtresi :GFP共同轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后，GFP熒光蛋白的Wfestern Blotting結(jié)果(內(nèi)參蛋白為Rubisco大亞基)。
圖9為重組質(zhì)粒326-MAG-FLAG和重組質(zhì)粒3^_ProAtresi :GFP共同轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后，F(xiàn)LAG蛋白的Wfestern Blotting結(jié)果(內(nèi)參蛋白為Rubisco大亞基)。圖10為重組質(zhì)粒326-MAG-FLAG和重組質(zhì)粒3^_ProAtPK1: GFP共同轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后，GFP熒光蛋白的顯微鏡觀測結(jié)果。圖11為重組質(zhì)粒326-MAG-FLAG和重組質(zhì)粒3^_ProAtPK1: GFP共同轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后，GFP熒光蛋白的Wfestern Blotting結(jié)果(內(nèi)參蛋白為Rubisco大亞基)。圖12為重組質(zhì)粒326-MAG-FLAG和重組質(zhì)粒3^_ProAtPK1: GFP共同轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后，F(xiàn)LAG蛋白的Wfestern Blotting結(jié)果(內(nèi)參蛋白為Rubisco大亞基)。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，具體步驟可參見dMolecular Cloning =A Laboratory Manual)) (Sambrook J.，Russell, David W.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001,NY, Cold Spring Harbor)。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中所用引物的合成及DNA序列的測定，均由北京英駿生物有限公司進(jìn)行。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Arabidopsis thaliana)，又稱擬南芥或擬南芥Col-0 參考文獻(xiàn)Jin JB, Kim YA, Kim SJ, Lee SH, Kim DH, Cheong Gff, Hwang I. 2001. Anew dynamin-like protein, ADL6, is involved in traffickingfrom the trans—Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis. Plant Cell 13:1511-1526.；公眾可以從美國擬南芥生物資源中心(ABRC)購買得到。pUC19載體購自NEB公司，商品目錄號為N3041S。326-FLAG表達(dá)載體在pUC19載體的I3StI和EcoRI酶切位點(diǎn)之間插入序列表的序列6所示DNA得到的重組質(zhì)粒；序列表的序列6所示DNA中，自5，末端第1至835位核苷酸為35S組成型啟動子，第862-933位核苷酸為3XFLAG基因，第934-1192位核苷酸為 Nos終止子。326-GFP表達(dá)載體在pUC19載體的I^stI和EcoRI酶切位點(diǎn)之間插入序列表的序列7所示DNA得到的重組質(zhì)粒；序列表的序列7所示DNA中，自5，末端第1至835位核苷酸為35S組成型啟動子，第862-1578位核苷酸為GFP基因，第1579-1837位核苷酸為Nos
終止子。實(shí)施例中所用的Anti-GFP抗體為Clontech公司的GFP Living Colors Α. V. Monoclonal Antibody (貨號 632381)。實(shí)施例中所以那個的Anti-FLAG抗體為Sigma公司的Anti-FLAG M2 Monoclonal Antibody (貨號 F3165)。實(shí)施例1、MAG蛋白及其編碼基因的獲得1、根據(jù)現(xiàn)有的NCBI數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)，設(shè)置一對引物如下Fl (正向引物)5，-TCTAGAGTCAACGTCGCATACTTTTGAA-3，(下劃線標(biāo)注 XbaI 酶切識別序列)；
Rl (反向引物)5，-GGATCCCGAGAGGTTTAAGAGTGTTCTTA-3，(下劃線標(biāo)注 BamHI 酶切識別序列)。2、提取哥倫比亞生態(tài)型擬南芥葉片的基因組DNA。3、以基因組DNA為模板，采用步驟1設(shè)計(jì)的引物對，用TaKaRa公司I^rimeSTAR HS 高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。4、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，如序列表的序列2所示。將序列表的序列1所示的蛋白命名為MAG蛋白。將MAG蛋白的編碼基因命名為 MAG基因，其基因組DNA如序列表的序列2所示(自5’末端第53至55位核苷酸為起始密碼子)。實(shí)施例2、各個基因的克隆及其重組表達(dá)載體的構(gòu)建
一、MAG基因的獲得和重組質(zhì)粒326-MAG-FLAG的構(gòu)建1、提取哥倫比亞生態(tài)型擬南芥葉片的基因組DNA。2、以步驟1的基因組DNA為模板，用Fl和Rl組成的引物對，在TaKaRa公司 PrimeSTAR HS高保真酶的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1 (M代表核苷酸的marker，為TaKaRa公司的DL2000)。3、用限制性內(nèi)切酶^CbaI和BamHI雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶^CbaI和BamHI雙酶切3^-FLAG表達(dá)載體，回收約3827bp的載體骨架。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒326-MAG-FLAG (結(jié)構(gòu)示意圖見圖2)。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒M6-MAG-FLAG進(jìn)行結(jié)果描述如下在 326-FLAG表達(dá)載體的)(bal和BamHI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2所示的MAG基因。二、ICSl基因啟動子(ProAtICSl)的獲得和重組質(zhì)粒3^_ProAtIcsl :GFP的構(gòu)建1、檢索NCBI數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)，獲得異分支酸合成酶基因的序列(登錄號 AT1G74710)，根據(jù)序列設(shè)計(jì)一對靶向啟動子的引物如下F2(正向引物):5，-AACTGCAGTTATCCACGCTTTGTCACACA-3‘(下劃線標(biāo)注 PstI 酶切識別序列)；R2 (反向引物)5’-CGGGATCCCCATTGCAGAAATTCGTAAAGT-3’ (下劃線標(biāo)注 BamHI 酶切識別序列)。2、提取哥倫比亞生態(tài)型擬南芥葉片的基因組DNA。3、以步驟2的基因組DNA為模板，用F2和R2組成的引物對，在TaKaRa公司 PrimeSTAR HS高保真酶的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖3 (M代表核苷酸的marker，為TaKaRa公司的DL2000)。4、用限制性內(nèi)切酶I3StI和BamHI雙酶切步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。5、用限制性內(nèi)切酶I3StI和BamHI雙酶切3^_GFP表達(dá)載體，回收約3635bp的載體骨架(去除了 3^-GFP表達(dá)載體中的35S組成型啟動子)。6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 326-ProAtIcsl: GFP (結(jié)構(gòu)示意圖見圖4)。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒3^_ProAtiesi :GFP進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下將326-GFP表達(dá)載體I^stI和BamHI酶切位點(diǎn)間的小片段(35S組成型啟動子)取代為了序列表的序列3所示的ICSl基因啟動子(ftx)AtICSl)。
三、PRl基因啟動子(ProAtPK1)的獲得和重組質(zhì)粒3^-ProAtPK1: :GFP的構(gòu)建1、檢索NCBI數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)，獲得AtPRl的序列(登錄號AT2G14610)，根據(jù)序列設(shè)計(jì)一對靶向啟動子的引物如下F3 (正向引物)5，-AACTGCAGTGGCAAATAAACAACGGACA-3‘(下劃線標(biāo)注 PstI 酶切識別序列)；R3(反向引物)5’ -CCGCTCGAGTAAAATTCATTTTTCTAAGTTGA-3’ (下劃線標(biāo)注 XhoI 酶切識別序列)。2、提取哥倫比亞生態(tài)型擬南芥葉片的基因組DNA。3、以步驟2的基因組DNA為模板，用F3和R3組成的引物對，在TaKaRa公司 PrimeSTAR HS高保真酶的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖5 (M代表核苷酸的marker，為TaKaRa公司的DL2000)。4、用限制性內(nèi)切酶I^stI和BioI雙酶切步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。5、用限制性內(nèi)切酶I3StI和BioI雙酶切326-GFP表達(dá)載體，回收約3641bp的載體骨架。6、將步驟4的酶切產(chǎn)物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 326-ProAtPE1 ::GFP(結(jié)構(gòu)示意圖見圖6)。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒3^-ProAtPK1 :GFP進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下將326-GFP表達(dá)載體I^stI和B10I酶切位點(diǎn)間的小片段(35S組成型啟動子)取代為了序列表的序列4所示的PRl基因啟動子(ProAtPK1)。四、重組質(zhì)粒326-T7-FLC的構(gòu)建合成序列表的序列的序列5所示的T7-FLC基因(自5’末端第1至33位核苷酸為T7標(biāo)簽、第34至660位核苷酸為FLC基因)，插入326-FLAG表達(dá)載體的SpeI和BamHI 酶切位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒326-T7-FLC。FLC基因是一個已知不與ftx)Atresi和ProAtPK1作用的基因。實(shí)施例3、MAG基因在誘導(dǎo)ICSl基因啟動子(I^roAtICSl)啟動基因表達(dá)中的應(yīng)用一、重組質(zhì)粒在擬南芥葉片原生質(zhì)體中的瞬時表達(dá)將實(shí)施例2構(gòu)建的重組質(zhì)粒326-MAG-FLAG和重組質(zhì)粒3^_ProAtresi :GFP共同轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體(將重組質(zhì)粒326-T7-FLC作為重組質(zhì)粒326-MAG-FLAG的一個負(fù)對照； 將3^-FLAG表達(dá)載體作為重組質(zhì)粒326-MAG-FLAG的另一個負(fù)對照)，具體步驟如下1、在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)哥倫比亞生態(tài)型擬南芥種子，待根長至1-3厘米時移栽到土里，23°C溫室培養(yǎng)(每天光照12h，光照強(qiáng)度為150 μ E)。2、在90mm培養(yǎng)皿中加入20ml雙蒸水，再加入1.82g D-甘露醇并使其溶解。3、取步驟1中培養(yǎng)4周未抽薹的葉片(約90片)，切成Imm寬的長條，置于步驟2 的甘露醇溶液中0. 5小時。4、在 IOOml 三角瓶配置 15ml 酶解體系Cellulase R-IO (購自 YAKULT HONSHA) 150mg、Marcerozyme R-IO (購自 YAKULT H0NSHA) 37. 5mg、MES (購自 USB)30mg、 BSA(購自 AMRESC0)15mg、Mannitol (購自 Sigma，貨號 M1902，為 IM Mannitol 母液)7. 5ml、 CaCl2(購自 Sigma，貨號 C-2536，為 200mM母液)0. 075ml，其余為水，用 IM KOH調(diào)pH為 5. 6。5、將步驟3的將細(xì)條撈出，置于步驟4的酶解體系中，在黑暗條件下酶解3小時 (23°C>40-50rpm)。
10
6、將進(jìn)行完步驟5的酶解液過100-200目的篩子，將過濾后的綠色混合物置于 15ml離心管(直徑約Icm)中，均分為兩管。7、將步驟6的離心管離心、60g) 15分鐘收集沉淀，每管加入冰冷的W5溶液輕柔洗滌，然后離心、100g) 1分鐘收集沉淀，每管加入冰冷的W5溶液輕柔洗滌； 冰上放置30分鐘，然后離心(23°C、100g) 1分鐘收集沉淀，每管沉淀用0. 5ml MaMg溶液重懸，即為原生質(zhì)體溶液。W5 溶液NaCl (購自 Junsei)9g、CaCl2(購自 Sigma，貨號 C-2661) 13. 88g、MES(購自 USB) 0. 292mg,KCl (購自 AMRESC0) 0. 372mg,Glucose (購自 AMRESC0) 0. 902g，用水定容至 1L，用 IM KOH 調(diào) pH 為 5. 6。MaMg 溶液Mannitol (購自 Sigma，貨號 M1902) 7. 288g、MgCl2 (購自 AMRESC0，貨號 0288-500G)0. 305g、MES(購自 USB) 100mg，用水定容至 100ml，用 IM KOH 調(diào) pH 為 5. 6。8、將重組質(zhì)粒326-MAG-FLAG (或重組質(zhì)粒326_T7_FLC或3^-FLAG表達(dá)載體)和重組質(zhì)粒326-ProAtIcsl: :GFP各取15ug于IOml管中，加300ul原生質(zhì)體溶液，用200ul槍頭(剪去前端)輕柔混勻；然后加入310ul PEG4000/Ca (NO3)2溶液，輕柔混勻；放置30分鐘 (20-30分鐘均可)，然后加入Iml W5溶液來回顛倒混勻，然后離心(23°C、100g) 1分鐘收集沉淀；加入IOOul W5溶液混勻，然后再加900ul W5溶液混勻。設(shè)置只轉(zhuǎn)染326-GFP表達(dá)載體的正對照。PEG4000/Ca (NO3) 2 溶液PEG4000 4g、Mannitol (購自 Sigma，貨號 M1902，為 IMMannitol 母液)4ml、Ca (NO3)2 lmg、dH20 1. 8ml，用水定容至 10ml。9、將步驟8得到的混合液置于六孔板內(nèi)，23°C孵育12小時。二、熒光顯微鏡觀察吸取30ul步驟一的9中孵育完成的混合液，置于載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片后，放于^ISS AXI0SK0P熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照。結(jié)果見圖7。在熒光觀測下共同轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒3^_ProAtiesi: :GFP和重組質(zhì)粒 326-MAG-FLAG的原生質(zhì)體中，出現(xiàn)了與轉(zhuǎn)化326-GFP載體的正對照相同的綠色熒光；共同轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒3^-ProAtiesi: :GFP和重組質(zhì)粒326-T7-FLC (或3^-FLAG表達(dá)載體)的原生質(zhì)體并不能觀察到明顯的綠色熒光。結(jié)果表明，MAG蛋白可以與ICSl啟動子區(qū)作用，促使其后續(xù)GFP基因表達(dá)，MAG基因在正調(diào)控水楊酸合成關(guān)鍵酶ICSl的啟動子上，起到了促進(jìn)的作用。三、Western Blotting 檢測吸取30ul步驟一的9中孵育完成的混合液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為4%、長度為1cm;電流采用20mA)，然后采用Anti-GFP抗體(或 Anti-FLAG抗體)和羊抗鼠的辣根過氧化物酶HRP抗體進(jìn)行^festern Blotting。采用Anti-GFP抗體雜交的結(jié)果見圖8。在共同轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒326_ProAtiesi :GFP 和重組質(zhì)粒326-MAG-FLAG的原生質(zhì)體中，出現(xiàn)了與轉(zhuǎn)化326-GFP載體的正對照相同的條帶，可以確定為GFP條帶。共同轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒3^-ProAtKS1 GFP和重組質(zhì)粒326_T7_FLC (或 326-FLAG表達(dá)載體)，基本沒有GFP蛋白信號。采用Anti-FLAG抗體雜交的結(jié)果見圖9。在共同轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒326-ProAtiesi: :GFP 和重組質(zhì)粒326-MAG-FLAG的原生質(zhì)體中，MAG基因確實(shí)得到了表達(dá)，這就進(jìn)一步從蛋白水平說明了 MAG基因所表達(dá)的蛋白可以與ICSl的啟動子區(qū)作用，并且促使其后續(xù)GFP基因的表達(dá)。因此可以判斷，MAG基因在正調(diào)控水楊酸合成關(guān)鍵酶基因ICSl的啟動子上，起到了促進(jìn)的作用。實(shí)施例4、MAG基因在誘導(dǎo)PRl基因啟動子(ProAtPK1)啟動基因表達(dá)中的應(yīng)用一、重組質(zhì)粒在擬南芥葉片原生質(zhì)體中的瞬時表達(dá)用重組質(zhì)粒3^-ProAtPK1: :GFP代替重組質(zhì)粒3^_ProAtiesi :GFP，其它同實(shí)施例3 的步驟一。二、熒光顯微鏡觀察同實(shí)施例3的步驟二。結(jié)果見圖10。在熒光觀測下，在共同轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒3^-ProAtPK1: :GFP和重組質(zhì)粒326-MAG-FLAG的原生質(zhì)體中，出現(xiàn)了與轉(zhuǎn)化326-GFP載體的正對照相同的綠色熒光；共同轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒3^-ProAtPK1 GFP和重組質(zhì)粒326_T7_FLC (或3^-FLAG表達(dá)載體)的原生質(zhì)體并不能觀察到明顯的綠色熒光。結(jié)果表明，MAG蛋白促進(jìn)了抗病基因PRl啟動子起始轉(zhuǎn)錄，并且促使其后續(xù)GFP基因的表達(dá)。MAG基因可能是通過調(diào)控植物水楊酸的合成促進(jìn)了抗病基因PRl啟動子的起始轉(zhuǎn)錄。三、Western Blotting 檢測同實(shí)施例3的步驟三。采用Anti-GFP抗體雜交的結(jié)果見圖11。在共同轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒326-ProAtPK1: :GFP 和重組質(zhì)粒326-MAG-FLAG的原生質(zhì)體中，出現(xiàn)了與轉(zhuǎn)化326-GFP的正對照相同條帶，可以確定為GFP條帶。共同轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒3^-ProAtPK1 GFP和重組質(zhì)粒326_T7_FLC (或3^-FLAG 表達(dá)載體)的原生質(zhì)體中，并沒有GFP蛋白信號。采用Anti-FLAG抗體雜交的結(jié)果見圖12。在共同轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒3^-ProAtPK1: :GFP 和重組質(zhì)粒326-MAG-FLAG的原生質(zhì)體中，MAG基因確實(shí)得到了表達(dá)，這也進(jìn)一步說明了 MAG 蛋白誘導(dǎo)了抗病基因PRl啟動子起始轉(zhuǎn)錄，促使了后續(xù)GFP基因的表達(dá)。MAG基因可能通過調(diào)控植物水楊酸的合成促進(jìn)了抗病基因PRl啟動子的表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下(a)、(b)、(c)、(d)和(e)中的任意一種(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有誘導(dǎo)ICSl基因啟動子啟動功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)；所述ICSl基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列3所示；(c)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有誘導(dǎo)PRl基因啟動子啟動功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)；所述PRl基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列4所示；(d)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物中的水楊酸合成相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)；(e)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)至10)中任一所述的DNA 分子1)序列表的序列2自5’末端第53至814位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表的序列2所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有誘導(dǎo)ICSl基因啟動子啟動功能的蛋白的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有誘導(dǎo)ICSl基因啟動子啟動功能的蛋白的DNA分子；5)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有誘導(dǎo)PRl基因啟動子啟動功能的蛋白的DNA分子；6)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有誘導(dǎo)PRl基因啟動子啟動功能的蛋白的DNA分子；7)在嚴(yán)格條件下與1)或幻限定的DNA序列雜交且編碼植物水楊酸合成相關(guān)蛋白的 DNA分子；8)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物水楊酸合成相關(guān)蛋白的DNA分子；9)在嚴(yán)格條件下與1)或幻限定的DNA序列雜交且編碼植物抗性相關(guān)蛋白的DNA分子10)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼植物抗性相關(guān)蛋白的DNA 分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為在3^-FLAG 表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)插入序列表的序列2所示DNA片段得到的重組質(zhì)粒；所述3^-FLAG 表達(dá)載體為在PUC19載體的多克隆位點(diǎn)插入序列表的序列6所示DNA得到的重組質(zhì)粒。
6.權(quán)利要求1所述蛋白在誘導(dǎo)ICSl基因啟動子的啟動功能中的應(yīng)用；所述ICSl基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
7.權(quán)利要求1所述蛋白在誘導(dǎo)PRl基因啟動子的啟動功能中的應(yīng)用；所述PRl基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列4所示。
8.權(quán)利要求2或3所述基因在誘導(dǎo)ICSl基因啟動子的啟動功能中的應(yīng)用；所述ICSl 基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
9.權(quán)利要求2或3所述基因在誘導(dǎo)PRl基因啟動子的啟動功能中的應(yīng)用；所述PRl基因啟動子的核苷酸序列如序列表的序列4所示。
10.權(quán)利要求1所述蛋白，和/或，權(quán)利要求2或3所述基因，在培育抗性植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物抗性相關(guān)蛋白MAG其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白，命名為MAG蛋白，來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)，是如下任意一種(a)序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有如下任一功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)ICS1基因啟動子啟動功能、誘導(dǎo)PR1基因啟動子啟動功能、與植物中的水楊酸合成相關(guān)、與植物抗性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的MAG蛋白可以通過調(diào)控植物中水楊酸的合成，增強(qiáng)植物的抗病性。本發(fā)明對于培育抗病植物均有重大價(jià)值。
文檔編號A01H5/00GK102367275SQ20111031724
公開日2012年3月7日 申請日期2011年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月18日
發(fā)明者林曉莉, 蔡斌, 金京波 申請人:中國科學(xué)院植物研究所