專利名稱：一種凝結(jié)芽孢桿菌及其發(fā)酵液和發(fā)酵方法及發(fā)酵液作為生物農(nóng)藥的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物農(nóng)藥領(lǐng)域，尤其是一種凝結(jié)芽孢桿菌及其發(fā)酵液和發(fā)酵方法及發(fā)酵液作為生物農(nóng)藥的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
凝結(jié)芽孢桿菌TQ33，呈桿狀、兩端鈍圓、革蘭氏陽性、過氧化氫酶陽性、芽孢端生、無鞭毛，其在代謝過程中還會產(chǎn)生抗真菌活性物質(zhì)，可以抑制植物病原菌的生長。凝結(jié)芽孢桿菌是目前國際市場上研究和應(yīng)用的新一代益生菌，它除具有普通乳酸菌的營養(yǎng)保健作用外，同時(shí)還具有抗逆性強(qiáng)、耐高溫高壓、易貯存等獨(dú)特的生物特性成為當(dāng)今研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)，它可以對多種動、植物及人類病原菌起到很好的抑制作用，是一株應(yīng)用前景非常廣闊的益生菌。苯乳酸是乳酸菌產(chǎn)生的一種新型抑菌物質(zhì)，它不僅能夠抑制多種食源性致病菌，而且對引起食品腐敗的真菌具有廣泛的作用，苯乳酸能有效抑制革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的生長。苯乳酸對真菌的最小抑菌濃度較大，主要集中在(5 10)mg/mL范圍內(nèi)，對紅酵母、克魯維酵母和青霉抑制作用較強(qiáng)，其最小抑菌濃度為5mg/mL，對毛霉的抑菌作用較弱，最小抑菌濃度為10mg/mL。此外，苯乳酸穩(wěn)定性高，安全無毒，被認(rèn)為是繼乳酸菌產(chǎn)生的第一代抑菌物質(zhì)，已成為乳酸菌抑菌能力的有效標(biāo)志之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種凝結(jié)芽孢桿菌及其發(fā)酵液和發(fā)酵方法及發(fā)酵液作為生物農(nóng)藥的應(yīng)用，本發(fā)明從凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵液中分離出一種抗菌活性物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)鑒定為苯乳酸，驗(yàn)證了苯乳酸對植物病原菌的抑制作用，為凝結(jié)芽孢桿菌應(yīng)用于生物農(nóng)藥，抑制植物病原菌生長等方面提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下一種凝結(jié)芽孢桿菌，其特征在于名稱為TQ33，分類名稱Bacillus coagulans，保藏編號為=CGMCC No. 5233，保藏日期2011年9月9日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心?！N凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵獲得發(fā)酵液的方法，其特征在于方法所用發(fā)酵培養(yǎng)基為g/L 蛋白胨10. 0、淀粉10. 0、溶劑為水，pH7. 2-7. 4 ；發(fā)酵條件為35-39°C搖瓶150_170r/min培養(yǎng)15-25小時(shí)，按照發(fā)酵條件發(fā)酵后獲得發(fā)酵液。而且，所述發(fā)酵液中含有苯乳酸。而且，所述發(fā)酵液的純化方法為(1)采用離心濃縮菌體發(fā)酵劑，濃縮條件為離心轉(zhuǎn)速6000r/min，離心20min，離心溫度為4°C，去除菌體，獲得濃縮液；(2)離心后，棄去沉淀，將上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾，濃縮發(fā)酵液。
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一種凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵獲得發(fā)酵液的方法獲得的發(fā)酵液。而且，含有苯乳酸。凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵獲得發(fā)酵液的方法獲得的發(fā)酵液的發(fā)酵液作為生物農(nóng)藥的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1、本發(fā)明從凝結(jié)芽孢桿菌TQ33發(fā)酵液中分離出一種抑制植物病原真菌的活性物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)鑒定為苯乳酸，并且溫室盆栽實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了苯乳酸對植物病原菌的抑制作用，這是首次從凝結(jié)芽孢桿菌中分離出苯乳酸這種抑制植物病原菌活性物質(zhì)，為凝結(jié)芽孢桿菌應(yīng)用于生物農(nóng)藥，抑制植物病原菌生長等方面提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2、本發(fā)明首次從凝結(jié)芽孢桿菌中分離純化的苯乳酸，凝結(jié)芽孢桿菌不僅具有普通乳酸菌的營養(yǎng)保健作用，還具有抗逆性強(qiáng)、耐高溫高壓、易于培養(yǎng)、發(fā)酵成本低等獨(dú)特優(yōu)勢，因此利用凝結(jié)芽孢桿菌培養(yǎng)獲得含有苯乳酸的發(fā)酵產(chǎn)物應(yīng)用于生物農(nóng)藥更易于工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為本發(fā)明液相色譜圖；圖2為本發(fā)明質(zhì)譜圖；圖3為本發(fā)明核磁共振圖；圖4A-圖4B為本發(fā)明盆栽試驗(yàn)圖，其中圖4A為用含有12mg/ml苯乳酸的發(fā)酵液噴施接種有甜瓜疫霉病原菌的西紅柿苗，一周后實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖4B為不加苯乳酸的液體培養(yǎng)基噴施接種有甜瓜疫霉病原菌的西紅柿苗，一周后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖5A-圖5D為本發(fā)明苯乳酸最小抑制濃度圖，其中圖5A為含有18mg/ml苯乳酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)的甜瓜疫霉；圖5B為含有Hmg/ml苯乳酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)的甜瓜疫霉；圖5C為含有12mg/ml苯乳酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)的甜瓜疫霉；圖5D為不含有苯乳酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)的甜瓜疫霉。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步說明，下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。一種凝結(jié)芽孢桿菌TQ33，分類名稱Bacillus coagulans，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心1、種子及發(fā)酵培養(yǎng)基液態(tài)種子及發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨10.0，淀粉10.0，溶劑為水，pH7. 2-7. 4，37°C搖瓶160r/min培養(yǎng)20小時(shí)。2、菌體的種子制備將甘油管凍藏的菌種接到裝有液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中，37°C搖瓶培養(yǎng)20小時(shí)。3、菌體的液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)至對數(shù)期中期的液體種子以5%的接種量接到裝液量為IOOmL的250mL平底燒瓶中，于37士 1°C搖瓶培養(yǎng)20小時(shí)。
4、菌體的高密度放大培養(yǎng)(1)50L種子罐培養(yǎng)以8%的接種量將凝結(jié)芽孢桿菌接種于起始裝液量為30L的種子罐中，發(fā)酵溫度為37°C，起始攪拌轉(zhuǎn)速360r/min，通風(fēng)量為1 0. 5，罐壓為0. 06MPa。(2) 200L發(fā)酵罐培養(yǎng)以8%的接種量將凝結(jié)芽孢桿菌接種于200L罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，裝液量70%，發(fā)酵溫度為37°C，起始攪拌轉(zhuǎn)速250r/min，通風(fēng)量為1 0.3。5、離心分離采用離心法濃縮分離菌體，分離條件為6000r/min離心20min。6、液液萃取離心后，棄去沉淀，將上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾，濃縮發(fā)酵液。將濃縮后的發(fā)酵液與篩選出的有機(jī)溶劑(石油醚、環(huán)己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯，震蕩15min后靜置15min，然后取水相，每個(gè)重復(fù)萃取3次)進(jìn)行萃取。7、薄層層析在硅膠板上用微量毛細(xì)管吸取部分標(biāo)準(zhǔn)品溶液和上述萃取后的樣品溶液點(diǎn)于距玻璃板下邊緣Icm的位置。點(diǎn)樣斑點(diǎn)的直徑為3 5mm，點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離為1. 0cm，溶劑揮發(fā)干后即可用于層析。8、高壓液相色譜用薄板層析法選擇合適的展開劑，對活性物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分析，同時(shí)用經(jīng)典的硅膠柱柱層析法(將用上述有機(jī)溶劑萃取后的產(chǎn)物粗品進(jìn)行硅膠柱分析，采用石油醚-甲醇梯度洗脫，洗脫過程中各組分的分離效果用薄層層析檢測。確定展開劑為石油醚甲醇=9:1。)分離收集不同的組分。將上步所收集的活性物質(zhì)凍干，用乙腈溶解，用高效液相色譜對硅膠柱層析餾分進(jìn)行檢測，檢測條件所用色譜柱為Agilent Zorbax SB-Aq Cw色譜柱5 μ m，4. 6X 150mm，流動相為3% -100%乙腈，進(jìn)行梯度洗脫，流速為lml/min，檢測波長為220nm。9、抗菌物質(zhì)分子量的測定檢測柱為AcquityUPLC BEH C18 1. 7ym 2. IX50mm, ESI-Full scan 100-1800Da，流動相A :0. 1% FA H2O, B :CH3CN。10、核磁共振測定將目標(biāo)物溶于氘代試劑中，用AV400/600核磁共振儀分別測定H-NMR、C-NMR，確定物質(zhì)結(jié)構(gòu)。11、溫室盆栽試驗(yàn)液相檢測濃縮發(fā)酵液中苯乳酸含量為12mg/ml，并將苯乳酸用相應(yīng)的液體培養(yǎng)基稀釋成濃度為10mg/ml，作盆栽試驗(yàn)，檢測苯乳酸對植物病原菌的影響，以不加苯乳酸的液體培養(yǎng)基作對照。12、苯乳酸最小抑菌濃度(MIC)的測定將苯乳酸用相應(yīng)的PDA培養(yǎng)基稀釋成濃度為18mg/mL、Hmg/mL、12mg/mL、5mg/mL的溶液備用。以不加苯乳酸的PDA培養(yǎng)基作為陰性對照，在每個(gè)培養(yǎng)基平板上接種甜瓜疫霉菌塊，每個(gè)濃度做三次重復(fù)。陰性對照平板長滿疫霉時(shí)，抑制甜瓜疫霉出現(xiàn)明顯增長的最低苯乳酸濃度即最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果一、分別用幾種不同的有機(jī)溶劑萃取凝結(jié)芽孢桿菌的發(fā)酵液，然后分別將有機(jī)相在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干。將萃取得到的物質(zhì)稱量后，加去離子水懸浮，配成相同濃度，然后使用抑制菌絲甚至速率法測抑菌活性。結(jié)果如表1。通過有機(jī)溶劑萃取實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用乙酸乙酯萃取后，抑菌物質(zhì)可以從水相轉(zhuǎn)至有機(jī)相。二、HPLC 分析通過高壓液相色譜分析，如圖1所示，得到了三個(gè)含量較高的組分(分別在
1.565min，5. 590min, 16. 154min)其中第二個(gè)峰的抑菌活性最高，可以作進(jìn)一步分析。三、LC-MS質(zhì)譜圖質(zhì)譜圖顯示上述第二個(gè)峰，即保留時(shí)間為5. 590這個(gè)峰代表的化合物的分子量是165(圖幻，化合物的分子量按正離子圖譜峰值處減1計(jì)算。然后查閱文獻(xiàn)得知苯乳酸的分子量為165，因此可以推測，該化合物有可能為苯乳酸。四、核磁共振圖核磁共振圖譜顯示，碳譜(圖3A)，氫譜(圖3B)分別為13C-NMR (400MHz, DMS0_d6) δ 175. 57 (C-I) ,71. 53 (C-2)，40. 21 (C-3)，138. 60(C-4)，128. 42(C_5and C-9)，129. 85(C_6and C_8)，126. 56(C_7)；1H-NMR (400MHz, DMS0_d6) δ 7. 23(H_5and H_9)，7. 21 (H_6to H_8)，4. 17(H_2)，
2.99 (H-3a)，2. 78 (H_3b)；五、盆栽試驗(yàn)4A為用含有12mg/ml苯乳酸的發(fā)酵液噴施接種有甜瓜疫霉病原菌的西紅柿苗，一周后實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖4B為不加苯乳酸的液體培養(yǎng)基噴施接種有甜瓜疫霉病原菌的西紅柿苗，一周后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。六、苯乳酸最小抑制濃度5A為含有18mg/ml苯乳酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)的甜瓜疫霉；圖5B為含有Hmg/ml苯乳酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)的甜瓜疫霉；圖5C為含有12mg/ml苯乳酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)的甜瓜疫霉；圖5D為不含有苯乳酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)的甜瓜疫霉。結(jié)論通過對凝結(jié)芽孢桿菌抗植物病害真菌物質(zhì)分離方法的研究，根據(jù)HPLC及質(zhì)譜分析，核磁共振得到其中一種抗真菌物質(zhì)分子量為165，結(jié)構(gòu)鑒定為苯乳酸。在測得發(fā)酵液中苯乳酸含量是12mg/ml的基礎(chǔ)上，盆栽實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了苯乳酸對甜瓜疫霉病原菌有抑制作用，而且最小抑制濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示苯乳酸對甜瓜疫霉的最小抑制濃度為12mg/ml，所以本發(fā)明的研究為凝結(jié)芽孢桿菌應(yīng)用于生物農(nóng)藥，抑制植物病原菌生長等方面提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。表1萃取相和萃余相對抑菌活性的影響
權(quán)利要求
1.一種凝結(jié)芽孢桿菌，其特征在于名稱為TQ33，分類名稱凝結(jié)芽孢桿菌Bacilluscoagulans，保藏編號為=CGMCC No. 5233，保藏日期:2011年9月9日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
2.一種由權(quán)利要求1所述的凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵獲得發(fā)酵液的方法，其特征在于方法所用發(fā)酵培養(yǎng)基為g/L 蛋白胨10. 0、淀粉10. 0、溶劑為水，pH7. 2-7. 4 ；發(fā)酵條件為35-39°C搖瓶150-170r/min培養(yǎng)15-25小時(shí)，按照發(fā)酵條件發(fā)酵后獲得發(fā)酵液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述由凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵獲得發(fā)酵液的方法，其特征在于所述發(fā)酵液中含有苯乳酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述由凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵獲得發(fā)酵液的方法，其特征在于所述發(fā)酵液的純化方法為(1)采用離心濃縮菌體發(fā)酵劑，濃縮條件為離心轉(zhuǎn)速6000r/min，離心20min，離心溫度為4°C，去除菌體，獲得濃縮液；(2)離心后，棄去沉淀，將上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾，濃縮發(fā)酵液。
5.一種由權(quán)利要求2所述的凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵獲得發(fā)酵液的方法獲得的發(fā)酵液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵的發(fā)酵液，其特征在于含有苯乳酸。
7.權(quán)利要求5所述的發(fā)酵液作為生物農(nóng)藥的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種凝結(jié)芽孢桿菌及該菌發(fā)酵獲得的發(fā)酵液作為農(nóng)藥的應(yīng)用，名稱為TQ33，分類名稱Bacillus coagulans，保藏編號為CGMCC No.5233，方法所用發(fā)酵培養(yǎng)基為g/L蛋白胨10.0、淀粉10.0、溶劑為水，pH7.2-7.4；發(fā)酵條件為35-39℃搖瓶150-170r/min培養(yǎng)15-25小時(shí)，按照發(fā)酵條件發(fā)酵后獲得發(fā)酵液。本發(fā)明從凝結(jié)芽孢桿菌TQ33發(fā)酵液中分離出一種抑制植物病原真菌的活性物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)鑒定為苯乳酸，并且溫室盆栽實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了苯乳酸對植物病原菌的抑制作用，這是首次從凝結(jié)芽孢桿菌中分離出苯乳酸這種抑制植物病原菌活性物質(zhì)，為凝結(jié)芽孢桿菌應(yīng)用于生物農(nóng)藥，抑制植物病原菌生長等方面提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
文檔編號A01N63/02GK102382783SQ20111031393
公開日2012年3月21日 申請日期2011年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月17日
發(fā)明者戚薇, 戴玉杰, 王海寬, 肖瑞峰 申請人:天津科技大學(xué)