專利名稱：一種棘孢木霉菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種具對(duì)葡萄灰霉病有高拮抗木霉菌株。
技術(shù)背景
葡萄灰霉病主要危害花序、幼果和將要成熟的果實(shí)，也可侵染果梗、新梢與幼嫩葉片。葡萄灰霉病是由半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、葡萄孢屬AoiiTii1S cinerea pers. ex Fr.侵染引起的。該病原菌是一種寄主非常廣泛的兼性寄生真菌，它可寄生多種水果、蔬菜與花卉，因此該病菌的侵染原十分廣泛。
對(duì)于該病，常規(guī)手段是采用噴灑滅蟲劑來防治葡萄灰霉病。在中國專利 CN101543217中披露了將含有嘧菌環(huán)胺和戊唑醇的殺菌組合物用來防治葡萄灰霉病，中國專利CN101731245提供了一種含有嘧菌環(huán)胺和戊唑醇的殺菌組合物用于防治該病，中國專利CN101779638提供一種含有嘧霉胺和乙烯菌核利的殺菌劑用于治療該病。此外，中國專利CN1730455和CN1730456也分別披露了利用合成的間苯三酚乙?；苌镉糜谥委熎咸鸦颐共?。
在治療葡萄灰霉病農(nóng)藥使用過程中常存在用量大的問題，用量少了達(dá)不到防治灰霉病的效果，長期大用量使用農(nóng)藥會(huì)對(duì)葡萄生長環(huán)境產(chǎn)生破壞影響。雖然在短時(shí)間內(nèi)可以取得很好的防止葡萄灰霉病的效果，但長久來看將農(nóng)藥作為防治灰霉病方法將會(huì)被淘汰。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決目前防治葡萄灰霉病的化學(xué)農(nóng)藥量多且農(nóng)藥對(duì)環(huán)境會(huì)產(chǎn)生影響，提供一種產(chǎn)孢量多、高效防治葡萄灰霉病的木霉菌株。
本發(fā)明提供的木霉菌株屬于棘孢木霉(Trichoderma asperellum)菌株,具有防治葡萄灰霉病的特性。該菌株于2011年8月31日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號(hào)為CGMCC No. 5201。保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)。棘孢木霉菌株具有以下性質(zhì)
本發(fā)明棘孢木霉菌株的分生孢子階段為半知菌門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，木霉屬，其有性態(tài)是屬于子囊菌門子囊菌綱。
菌株培養(yǎng)特性本發(fā)明棘孢木霉菌株在PDA培養(yǎng)基上最適合的生長溫度為30°C，在30°C下生長48小時(shí)形成菌落的半徑約為47mm。菌株不產(chǎn)生擴(kuò)散性色素，無明顯氣味，菌落反面為奶油色。
本發(fā)明的棘孢木霉菌株的液體培養(yǎng)法為，在培養(yǎng)瓶中加入培養(yǎng)液并接種孢子懸浮液，在30°C環(huán)境下振蕩培養(yǎng)，4天后便可收獲大量的孢子。在孢子中添加等體積比的硅藻土抽濾并干燥可長久保存。
本發(fā)明棘孢木霉菌落形態(tài)培養(yǎng)條件為在15 35°C下黑暗環(huán)境下培養(yǎng)7小時(shí)。在PDA 培養(yǎng)基中，棘孢木霉菌最適合生長溫度為30°C。在25°C下，菌絲生長速度最快。在PDB培養(yǎng)基內(nèi)，在30°C的溫度下，棘孢木霉菌的分生孢子產(chǎn)量最大。
菌株微觀形態(tài)特性參照?qǐng)D廣圖3，本發(fā)明棘孢木霉菌株的分生孢子簇呈棉絮狀，有可見的單個(gè)的分生孢子梗分枝，至頂端可育。在分生孢子簇內(nèi)，分生孢子梗上的瓶梗呈現(xiàn)對(duì)稱分布，頂端有兩個(gè)或多個(gè)瓶梗，瓶梗寬度為2. 8^5. 4 μ m,主軸頂端下面生出的初次分枝常對(duì)生，與主軸夾角近 90°。隨著離頂端距離的增加，初次分枝的長度也增加；二次分枝能夠產(chǎn)生第三次分枝。瓶梗典型地產(chǎn)生于初次、二次、三次分枝的頂端，較少直接產(chǎn)生于初次和二次分枝中部，2 3個(gè)瓶梗呈旋渦狀排列。瓶梗直、安瓿形，僅在中部稍微加粗，其長度為7. fll.3ym，中部寬度為3· (Γ5. 5 μ m,基部寬度為2· (Γ3. 5 μ m,基部稍微有縊縮。分生孢子球形或亞球形或卵圓形，大小為 3. 7^6. 0X3. 0 5· Ομπι。
系統(tǒng)發(fā)育學(xué)鑒定通過PCR (Polymerase Chain Reaction,多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))對(duì)本發(fā)明棘孢木霉菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的鑒定，確定棘孢木霉菌株的進(jìn)化關(guān)系。
將引物ITS4和ITS5擴(kuò)增到ITS1-5. 8S-1TS2區(qū)序列，從而得到1158bp的序列段， 通過NCBI Gen Bank建立的DNA序列數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，1158bp的序列段與棘孢木霉的相似度達(dá)到100%。
1158bp 的 ITS 序列如下 GGAAGTAAAAGTCGTA ACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTG81TAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAATTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGA。
提供采用引物Ef728和Tefl a R擴(kuò)增Tefl a序列到1090bp的序列段，通過NCBI Gen Bank建立的DNA序列數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，1090bp的Tefl a序列與棘孢木霉的相似度達(dá)到100%。
1090bp 的 Tefl a 序列如下TTCATCATTTTTGGCACAGTCATATGCCCGACAATTCTGCTCTCA GTTTTTGTCTTTTTTTTCCAGCGTCACCCCGCTTTGCCAGTCTACCTACCCCTCCTTTGGCACAGCAAAAATTTTCT GGCTGCCCTTGTTTGGCTTTTAGTGGGGTGTCAAATTTTTTGGCAGCAACCCCGCTATCGCCACTGCACCTCTTCCA TCACCCACCACATGCTATTTGCTCAATCGCGTCGTCTTTTTTTGTTCATTATGCTGATCATGCTTCAATCAATAGGA AGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTATGCGTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTA TCACCATCGACATTGCCCTCTGGAAGTTCGAGACTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTTTGGACTCTT CTCTCTAGCTATCGACATTCCAAGTCCGCCATTCTAACATGCTCTTCCCACAGACGCTCCCGGTCACCGTGATTTCA TCAAGAACATGATCACTGGTACCTCCCAGGCTGACTGCGCTATCCTGATTATCGCTGCCGGTACTGGTGAGTTCGAG GCTGGTATCTCCAAGGATGGCCAGACCCGTGAGCACGCTCTGCTCGCC重寄生性木霉菌對(duì)病原菌主要通過拮抗作用、競爭作用、重寄生作用、誘導(dǎo)抗性和促生作用來防治灰霉病的發(fā)生。重寄生性是木霉菌對(duì)病原菌的主要作用方式，通過在棘孢木霉菌株自身產(chǎn)生的真菌細(xì)胞壁降解酶如幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶等，溶解病原菌細(xì)胞壁并滲透進(jìn)入其細(xì)胞中形成大量的分枝和有性結(jié)構(gòu)，使病原真菌生長受抑制而死亡而實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明提供的棘孢木霉菌株產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶活OD值為O. 4100，能很好的抑制病原真菌。
本發(fā)明提供的棘孢木霉菌株可以高效抑制葡萄灰霉病的病原真菌，減少葡萄灰霉病的發(fā)生，替代化學(xué)農(nóng)藥用于抑制葡萄灰霉病。


圖1是本發(fā)明提供的棘孢木霉菌株在PDA培養(yǎng)基上25°C黑暗7d的菌落形態(tài)圖。
圖2是本發(fā)明提供的棘孢木霉菌株的分生孢子梗、瓶梗直、安瓿形圖。
圖3是本發(fā)明提供的棘孢木霉菌株的分生孢子。
具體實(shí)施方式
通過借助一下實(shí)施例將更詳細(xì)說明本發(fā)明。以下實(shí)施例僅是說明性的，應(yīng)該明白， 本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。
菌株篩選方法稱取Ig 土樣于IOml水中，在渦旋儀上混勻后進(jìn)行梯度稀釋至10_5，取Iml加入到木霉菌選擇性培養(yǎng)基TSM培養(yǎng)基的表面，均勻涂布，該培養(yǎng)基在25°C靜置培養(yǎng)5-7天。根據(jù)平皿上篩選到的真菌菌落的形態(tài)、顏色、大小挑選出木霉菌菌落并轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基，進(jìn)行純化、培養(yǎng)及進(jìn)一步鑒定。
TSM 培養(yǎng)基配方(單位為 g/1) MgS047H20 O. 2g、KH2PO4 O. 9g、KCl 0. 15g、NH4NO31. 0g、葡萄糖3g、氯霉素0. 25g、甲基磺0. 3g、五氯硝基苯0. 2g,玫瑰紅0. 15g、瓊脂20g。
菌株培養(yǎng)在每250mL三角瓶中加IOOmL的PDB培養(yǎng)液，每瓶內(nèi)接種孢子懸浮液lmL。在30°C溫度下、150r/min振蕩下培養(yǎng)菌株，第5天便可收獲大量的棘孢木霉菌株孢子。在孢子中添加等體積的硅藻土，抽濾粉碎干燥備用。圖1和圖2是棘孢木霉菌株的菌落形態(tài)圖和分生孢子梗、瓶梗直、安瓿形圖。
葡萄灰霉病的大田防治將棘孢木霉菌株制 劑、施佳樂、枯草芽孢桿菌和速克靈對(duì)葡萄灰霉病進(jìn)行防治，實(shí)驗(yàn)期間共施藥3次，第一次時(shí)間為開花前一星期(2010年05月12日)；第二次時(shí)間為開花期 (2010年05月20日);第三次時(shí)間為初果期(2010年05月31日)。用背負(fù)式手動(dòng)噴霧器將菌株制劑噴灑在花穗、果穗及其附近葡萄葉背面上。每個(gè)處理噴30L水，每個(gè)田間規(guī)格、品種及肥水管理等條件一致。每次施藥后當(dāng)天均無降雨發(fā)生，試驗(yàn)期間未進(jìn)行任何施肥、灌溉及其他病蟲害的防治。
對(duì)病害嚴(yán)重度分級(jí)調(diào)查。對(duì)每小區(qū)采用隨機(jī)取樣，每點(diǎn)調(diào)查2(Γ40株。采用定株調(diào)查法在每小區(qū)調(diào)查中間2壟，從每壟的第3株開始調(diào)查20株。按以下分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄發(fā)病情況、統(tǒng)計(jì)病情級(jí)數(shù)。病情級(jí)數(shù)如下0級(jí)，花穗無病斑；1級(jí)，花穗初現(xiàn)零星小病斑病花蕾占1/4以下；2級(jí)，病斑占花穗1/2以下；3級(jí)，病斑占花穗1/2 3/4 ;4級(jí)，病斑占花穗3/4以上。計(jì)算相關(guān)病情指數(shù)和防效，并用鄧肯氏新復(fù)極差法測定差異顯著性。調(diào)查發(fā)病花穗或果穗的病級(jí)在最后一次施藥后第3天，每個(gè)處理隨機(jī)讀取36個(gè)花穗的病指。所計(jì)算得到的指數(shù)計(jì)入下表。
表I各處理對(duì)葡萄灰霉病防治效果表
權(quán)利要求
1.一種棘孢木霉菌株 aspereJJw ),該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 5201。
2.一種如權(quán)利要求1所述的棘孢木霉菌株在防治葡萄灰霉病中的應(yīng)用。
全文摘要
一種棘孢木霉菌株(Trichodermaasperellum)，保藏號(hào)為CGMCCNo.5201。
文檔編號(hào)A01P3/00GK103045483SQ20111030601
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2011年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月11日
發(fā)明者張鈺, 王承芳, 曠文豐, 干華磊, 陳娟, 毛偉力 申請(qǐng)人:上海萬力華生物科技有限公司