專利名稱：一種桔黃假單胞菌菌劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
一種桔黃假單胞菌菌劑及其制備方法和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于微生物和化學(xué)領(lǐng)域，公開了一種農(nóng)用促生菌劑，具體地說是一種植物根際促生菌桔黃假單胞菌菌劑的制備方法。
背景技術(shù)：
我國是農(nóng)業(yè)大國，通過使用化肥以提高農(nóng)作物的產(chǎn)量，長期和大量施用化肥會造成水體富營養(yǎng)化、土壤物理性質(zhì)惡化，危害食品安全、甚至人類生命健康。
微生物肥料菌劑是由一種或數(shù)種有益活體微生物制備而成的肥料，借助其代謝過程或代謝產(chǎn)物，以改善植物生長條件，尤其是營養(yǎng)環(huán)境，達(dá)到促進(jìn)植株生長的作用。微生物肥料菌劑是一種保護(hù)生態(tài)環(huán)境、提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的好方法。假單胞菌是一種植物根際促生菌(Plant Growth-promoting Rhizobacteria, PGPR)，能夠通過多種方式促進(jìn)植物生長，包括抑制植物病原菌、分泌吲哚乙酸(IAA)、產(chǎn)生鐵載體等直接或間接的作用促生作用。
現(xiàn)有階段發(fā)現(xiàn)桔黃假單胞菌對多種植物致病菌有抑制作用(Rosas BS等， Phyton-Revista Internacionalde Botanica Experimental,2001, 67 :203-209) ；Rosas 和 Rovera 等人(Carlier E, Rovera M 等 World J Microbiol Biotechnol,2008,24 2653-2658)研究發(fā)現(xiàn)，桔黃假單胞菌SRl通過產(chǎn)生鐵載體、拮抗蛋白、氫氰酸(HCN)、植物激素類似物等來抑制植物病原菌、促進(jìn)植物的生長。Feklistova和Maksimova(Feklistova IN 等，Bulletin of BSU, chemistry, biology, Geography, 2005, 2 :29-31)發(fā)現(xiàn)，桔黃假單胞菌還能合成吩嗪類物質(zhì)(phenazines)起到生物防治的作用。
現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)一株桔黃假單胞菌JD37 (菌種保藏號CGMCCNo. 1. 10967)對多種植物致病菌有抑制作用，并且能夠通過直接或者間接促生作用促進(jìn)玉米、小麥和番茄植株的生長。所以發(fā)明一種對人畜無毒、生態(tài)環(huán)境友好、能促進(jìn)植物生長的桔黃假單胞菌菌劑對于保護(hù)環(huán)境、促進(jìn)植物生長和農(nóng)業(yè)發(fā)展有著重要的意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種既能對植物有促生作用，提高植株產(chǎn)量，又對環(huán)境無污染，同時制備簡單、使用方便的桔黃假單胞菌菌劑的制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案為，一種桔黃假單胞菌菌劑的制備方法，包括以下步驟
(1)將桔黃假單胞菌JD37菌株接種入液體培養(yǎng)基中，25 30°C下培養(yǎng)M 觀小時；離心沉淀取桔黃假單胞菌JD37菌體，與滅菌的0. 05wt% 0. 2wt%助劑溶液懸浮，混合均勻，得到懸浮菌液；
液體培養(yǎng)基為KB培養(yǎng)基；
離心條件為-8 0°C，優(yōu)選_4°C，6000 IOOOOrpm離心8 15分鐘；
助劑優(yōu)選為羧甲基纖維素鈉；助劑溶液濃度優(yōu)選為0. Iwt% ；
獲得菌體的液體培養(yǎng)基與助劑溶液體積比為200 300 1，即平均每200 300毫升菌液離心后得到的桔黃假單胞菌JD37菌體，與1毫升助劑溶液混合制備懸浮菌液。
(2)將懸浮菌液與滅菌的載體混合，載體與懸浮菌液的體積質(zhì)量比為3 6g/ml， 優(yōu)選為5g/ml。載體可選用滑石粉或硅藻土，優(yōu)選為滑石粉。
通過上述方法制備的桔黃假單胞菌JD37菌劑可用作微生物肥料，菌體釋放能力高，可防治植物病害，促進(jìn)作物生長。
桔黃假單胞菌JD37菌劑通過降低植株發(fā)病率，達(dá)到促進(jìn)作物生長的效果。桔黃假單胞菌菌劑作為活體微生物肥料的應(yīng)用價值在于
(1)桔黃假單胞菌菌劑的菌體釋放能力高。
(2)能通過直接或間接的促生方式，促進(jìn)作物生長。
對作用施用桔黃假單胞菌活體微生物肥料，并在整個生長過程中多次施用，可以顯著促進(jìn)植株根的生長，進(jìn)而促進(jìn)整株作物的生長。
(3)抑制植物病原真菌通過離體葉片實驗，桔黃假單胞菌活體微生物肥料能夠顯著抑制植物病原菌，增強(qiáng)植株抵抗植物病原的能力，起到預(yù)防和防治植物病原菌的效果。無毒、無副作用，人畜安全。
(4)農(nóng)藥開發(fā)成本低桔黃假單胞菌活體微生物菌劑的活性成分是桔黃假單胞菌，該菌具有易培養(yǎng)、易收集、對人體及動植物無害的特點，加工促生菌劑選用的載體及助劑材料價格低廉，制備工藝簡單易行。
(5)菌劑的使用方法操作簡單桔黃假單胞菌菌劑為干粉狀，使用前按一定比例加水稀釋，采用澆灌和噴曬的方式施用均可。


圖1為桔黃假單胞菌JD37菌劑釋放菌體在番茄根際土壤和根內(nèi)的定殖實驗結(jié)果。
具體實施方式
實施例1
(1)制備液體培養(yǎng)基蛋白胨 20g、甘油 IOmL, K2HPO4 1. 5g、MgSO4 · 7H20 1. 5g、去離子水1L，混合靜置并滅菌；
(2)在超凈工作臺中用移液槍將5毫升桔黃假單胞菌JD37菌懸液接種入500毫升液體培養(yǎng)基中，放入恒溫?fù)u床，28°C下轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)觀小時；
(3)將振蕩培養(yǎng)后的菌懸液轉(zhuǎn)入滅菌的離心瓶，置入轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分鐘的冷凍離心機(jī)，_4°C離心10分鐘，沉淀制得JD37菌體；
(4)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 的羧甲基纖維素鈉溶液，在121°C滅菌20分鐘備用；將滑石粉置入高壓蒸汽滅菌鍋121°C滅菌30分鐘，烘干，分別滅菌三次。
(5)將步驟(3)制得的菌體加入滅菌的0. 羧甲基纖維素鈉溶液2毫升，混合均勻；倒入裝有10克滑石粉的玻璃廣口瓶中，用無菌玻璃棒攪拌；在超凈工作臺中晾干，桔黃假單胞菌JD37菌劑制成，可作為干粉狀活體JD37微生物肥料。
(6)將步驟(5)制得的桔黃假單胞菌JD37菌劑裝入一只封口塑料袋，抽真空，密封、室溫保存。
取10克桔黃假單胞菌JD37菌劑，放入10公斤水中，攪拌均勻；番茄種子播種后澆灌，出苗后噴灑。
實施例2
(1)制備液體培養(yǎng)基
蛋白胨50g、甘油 25mL、K2HPO4 3. 75g、MgSO4 · 7H20 3. 75g、去離子水 2500ml，混合靜置并滅菌；
(2)在超凈工作臺中用移液槍將25毫升桔黃假單胞菌JD37菌懸液接種入2500毫升液體培養(yǎng)基中，放入恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)觀小時；
(3)將振蕩培養(yǎng)后的菌懸液轉(zhuǎn)入滅菌的離心瓶，置入轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分鐘的冷凍離心機(jī)，_4°C離心10分鐘，沉淀制得JD37菌體；
(4)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 的羧甲基纖維素鈉溶液，在121°C滅菌20分鐘備用；將滑石粉置入高壓蒸汽滅菌鍋121°C滅菌30分鐘，烘干，分別滅菌三次。
(5)將步驟C3)制得的菌體加入滅菌的0. 羧甲基纖維素鈉溶液10毫升，混合均勻；倒入裝有50克滑石粉的玻璃廣口瓶中，用攪拌器攪拌；在無菌環(huán)境晾干，桔黃假單胞菌JD37菌劑制成，可作為干粉狀活體JD37微生物肥料。
(6)將步驟( 制得的JD37菌劑裝入封口塑料袋，每袋10克，抽真空，密封、室溫保存。
取2袋菌劑，放入20公斤水中，攪拌均勻；番茄幼苗期灌溉。
實施例3
(1)制備液體培養(yǎng)基
蛋白胨20g、甘油 IOmL, K2HPO4 1. 5g、MgSO4 · 7H20 1. 5g、去離子水 1L，混合靜置并滅菌；
(2)在超凈工作臺中用移液槍將3毫升桔黃假單胞菌JD37菌懸液接種入300毫升液體培養(yǎng)基中，放入恒溫?fù)u床，轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/分鐘，振蕩培養(yǎng)觀小時；
(3)將振蕩培養(yǎng)后的菌懸液轉(zhuǎn)入滅菌的離心瓶，置入轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分鐘的冷凍離心機(jī)，_4°C離心10分鐘，沉淀制得JD37菌體；
(4)配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 的羧甲基纖維素鈉溶液，在121°C滅菌20分鐘備用；將硅藻土置入高壓蒸汽滅菌鍋121°C滅菌30分鐘，烘干，分別滅菌三次。
(5)將步驟C3)制得的菌體加入滅菌的0. 羧甲基纖維素鈉溶液5毫升，混合均勻；倒入裝有10克硅藻土的玻璃廣口瓶中，用攪拌器攪拌；在無菌環(huán)境晾干，桔黃假單胞菌 JD37菌劑制成，可作為干粉狀活體JD37微生物肥料。
(6)將步驟(5)制得的桔黃假單胞菌JD37菌劑裝入一只封口塑料袋，抽真空，密封、室溫保存。
取10克桔黃假單胞菌JD37菌劑，放入4公斤水中，攪拌均勻；番茄種子播種后澆灌，出苗后噴灑。
實施例4菌體釋放能力測定
JD37微生物肥料的保存能力測定菌劑制備一周后，用分析天平(0. OOOlg)稱取各Ig實施例2和3所制備的干粉狀活體JD37菌劑，分別加入裝有IOOml無菌水三角瓶中， 搖床振蕩Ih后，立即采用平板稀釋涂布的方法，計算兩種菌劑中的JD37菌體含量。實驗三次重復(fù)。結(jié)果如表1所示。
“菌劑1”表示用滑石粉為載體制備的菌劑；“菌劑2”表示用硅藻土為載體制備的菌劑。實驗結(jié)果表明實施例2以滑石粉為載體的菌劑中有效菌體釋放能力比實施例3硅藻土為載體的菌劑高2. 5倍(表1)。此數(shù)據(jù)表明，以滑石粉作為載體更適合于桔黃假單胞菌JD37菌劑的制備，載體材料滑石粉能夠為桔黃假單胞菌JD37菌體提供了適合的附著位點并且有良好的釋放作用。
表1菌劑釋放JD37數(shù)量
權(quán)利要求
1.一種桔黃假單胞菌菌劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將桔黃假單胞菌JD37菌株接種入液體培養(yǎng)基中，25 30°C下培養(yǎng)M 觀小時； 離心后取桔黃假單胞菌JD37菌體，與滅菌的0. 05wt% 0. 2wt%助劑溶液懸浮，混合均勻，得到懸浮菌液；獲得菌體的菌液與助劑溶液體積比為200 300 1 ；(2)將懸浮菌液與滅菌的載體混合，載體與步驟(1)所述助劑溶液的用量比為3 6g/ml ο
2.權(quán)利要求1所述一種植物根際促生菌桔黃假單胞菌菌劑的制備方法，其特征在于， 所述助劑為羧甲基纖維素鈉，所述載體為滑石粉。
3.權(quán)利要求1所述一種植物根際促生菌桔黃假單胞菌菌劑的制備方法，其特征在于， 步驟(1)所述液體培養(yǎng)基為KB培養(yǎng)基。
4.權(quán)利要求1所述一種植物根際促生菌桔黃假單胞菌菌劑的制備方法，其特征在于， 步驟(1)所述桔黃假單胞菌JD37培養(yǎng)條件為下培養(yǎng)觀小時。
5.一種桔黃假單胞菌菌劑，其特征在于，通過權(quán)利要求1 4任一項所述的方法制備。
6.權(quán)利要求5所述桔黃假單胞菌菌劑用于制備微生物肥料。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物和農(nóng)用促生菌劑，公開了一種植物根際促生菌桔黃假單胞菌菌劑的制備方法，步驟包括(1)將桔黃假單胞菌JD37菌種接種入液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24～28小時，冷凍離心得菌體，與滅菌的助劑溶液懸浮，混合均勻，得到懸浮菌液；(2)將懸浮菌液與滅菌的載體混合。通過上述方法所制得的桔黃假單胞菌菌劑用于制備微生物肥料，菌體釋放能力高，使用方便，可降低植株發(fā)病率，促進(jìn)作物生長。制備方法簡單，成本低。
文檔編號C05F11/08GK102505009SQ201110299609
公開日2012年6月20日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者王婧, 肖明 申請人:上海師范大學(xué)