專利名稱：一株多菌靈降解木霉菌株及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā) 明屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多菌靈農(nóng)藥殘留降解木霉，是利用微生物的方法降解化學(xué)農(nóng)藥殘留，適用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中綠色無公害農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)與加工。
背景技術(shù)：
多菌靈(Carbendazim，MBC)是一種廣譜高效低毒的內(nèi)吸性殺菌劑，化學(xué)名稱為 N-(2-苯并咪唑基)氨基甲酸甲酯，對各種農(nóng)作物、瓜果蔬菜病害具有較好的防治效果，也是其他殺菌劑，例如苯菌靈、甲基硫菌靈等咪唑類殺菌劑的代謝中間產(chǎn)物。據(jù)統(tǒng)計，我國2006 年農(nóng)藥需求總量(有效含量)為29. 96萬噸，其中多菌靈的需求量在0. 8 1. 0萬噸。多菌靈在土壤和水中性質(zhì)非常穩(wěn)定，降解半衰期較長，在蔬菜、果品和土壤中殘留與累積可通過食物鏈影響人體健康，例如導(dǎo)致染色體畸變，引起肝病等。2002年被我國列為環(huán)境激素類化學(xué)農(nóng)藥。因此，多菌靈在環(huán)境中的降解研究愈來愈受到人們的關(guān)注。生物降解是去除環(huán)境中多菌靈殘留的主要途徑，目前已報道的多菌靈降解菌均為細(xì)菌類?，F(xiàn)有的木霉菌類對多菌靈幾乎沒有降解功能，甚至在多菌靈污染嚴(yán)重的土壤中無法生存和繁殖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株具有多菌靈降解作用的生防木霉菌株及其
制備和應(yīng)用。本發(fā)明提供的一株可降解多菌靈的生防菌株為木霉577. )Trl，該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏；保藏號為CGMCC No. 5210，保藏時間為2011年9月1日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明所述的可降解多菌靈的木霉菌株(TricAoiferffl3 sp. ) Trl是利用含有多菌靈的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，從受多菌靈污染的土壤中分離、篩選、培養(yǎng)獲得的。該菌株不僅對多菌靈具有良好的降解效果，對各種病原菌也具有一定的抑菌效果。該發(fā)明為獲得降解多菌靈的木霉菌制品奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明所述的可降解多菌靈的生防菌株木霉sp. ) Trl的分離培養(yǎng)條件，包括下列步驟
采集日照東港區(qū)三莊鎮(zhèn)吉洼村某長期施用多菌靈的葡萄園耕作土層(10-30cm),稱取土樣10g，加到IOOml多菌靈濃度為ΙΟΟΟμ g/ml的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，28°C 150r/min搖床培養(yǎng)7d，吸取IOml培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到相同培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7d，共連續(xù)轉(zhuǎn)接5次。取Iml培養(yǎng)液，稀釋10_5，取200μ 1培養(yǎng)液均勻涂布于固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基(其中添加100μ g/ml鏈霉素用于抑制細(xì)菌)中，28°C培養(yǎng)至平板上出現(xiàn)單菌落，將菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板(其中添加100 μ g/ml 鏈霉素用于抑制細(xì)菌)上，28°C恒溫培養(yǎng)，反復(fù)純化至純培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中繼續(xù)搖床培養(yǎng)，利用HPLC檢測 菌株對多菌靈的降解能力，篩選對多菌靈降解能力最強(qiáng)的菌株進(jìn)行保藏，即為保藏號為CGMCC No. 5210飽木霉(Jrichoderma sp. ) Trl菌株。將上述培養(yǎng)篩選獲得的菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板上，發(fā)現(xiàn)該菌株在PDA平板上菌落初期氣生菌絲呈白色致密叢束狀，邊緣松散，呈發(fā)散狀生長，背面初期無色，后期出現(xiàn)菌絲產(chǎn)孢區(qū)，顏色從淺綠漸至深綠色。分生孢子梗從菌絲側(cè)枝生出，呈十字輪生排列，頂生分生孢子，分生孢子光滑，亞球形至卵形(圖1 )。通過一系列培養(yǎng)形狀及光學(xué)顯微鏡觀察，經(jīng)鑒定為
M (Trichoderma sp.\上述培養(yǎng)、篩選木霉sp. ) Trl的培養(yǎng)基配方如下
無機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/L) =NaCl 1. 0g, K2HPO4 1. 5g，KH2PO4 0. 5g，MgSO4·7Η20 0. 2g，NH4NO3 1. Og,蒸餾水 lOOOmL，多菌靈(100mg/mL) 10ml。固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/L)上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加瓊脂10g。PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml。本發(fā)明所述木霉(Trichoderma sp. ) Trl的發(fā)酵生產(chǎn)方法如下
采用固體PDA培養(yǎng)基，將該木霉Trl接種在試管培養(yǎng)基上，27-30°C下培養(yǎng)48h后，將培養(yǎng)好的木霉菌種轉(zhuǎn)接到液體PDA培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng)72h。將液體培養(yǎng)好的木霉菌株按照1% (v/V)的接種量轉(zhuǎn)接到小麥培養(yǎng)基中，27-30°C擴(kuò)大培養(yǎng)3d。清洗已培養(yǎng)好的木霉菌株，制成7 X IO9個/ml的木霉孢子懸浮菌液。上述所得到的木霉孢子懸浮菌液可經(jīng)常規(guī)工藝流程制成商品微生物制劑。上述小麥培養(yǎng)基為將小麥用清水浸泡、煮沸所制得的液體小麥培養(yǎng)基。具體配方實(shí)例如下
稱取IOOOg麥粒，清洗干凈后，加10L清水浸泡過夜，第二天煮沸至不發(fā)硬為止，同時用手感覺麥粒不發(fā)粘，分裝廣口玻璃瓶40瓶，121°C，20min高壓滅菌，兩次。應(yīng)用本發(fā)明所述木霉577. )Trl發(fā)酵菌液制得的微生物制劑，可用于防治植物真菌病害，同時對受到多菌靈污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)。


圖1是木霉Trl分生孢子梗及分生孢子
圖2是多菌靈降解菌Trl對各種病原菌的抑菌效果。1 -.Rhizoctonia solani ；2 Phytophthora capsici ；3 Verticillium dakIiae Kleb ；4 -.Phoma uvicola Berk ；5 Bipolaris sorokiniana (Sacc. ) hoemaker ；6 -.Fusarium moniliforme Sheld 圖3是木霉Trl對含多菌靈土壤的生物修復(fù)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.
ifMCTrichodenm sp. ) Trl的培養(yǎng)及多菌靈降解能力檢測
將木霉Trl轉(zhuǎn)接到PDA (添加鏈霉素，100 μ g/ml)平板上，培養(yǎng)5D后，用無菌水沖洗孢子，制成IO9個/ml孢子懸浮液，按照1%的接種量轉(zhuǎn)接到無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng) 14D，以不接菌的多菌靈降解培養(yǎng)基為對照。培養(yǎng)完畢，按照體積比為1 :4的比例在加入丙酮，混勻后，采用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行分析。流動相為乙腈水=18:82。流速為lml/min，進(jìn)樣量10 μ 1，可變波長檢測器的工作波長為270nm，采用外標(biāo)法按峰面積定量， 按照下列公式計算多菌靈降解率
X 一，4—B..., “ A^
式中，X為降解率，A為未接菌處理液中多菌靈濃度，B為接菌處理液中多菌靈濃度。該菌株14D內(nèi)對多菌靈的降解率達(dá)到了 55. 47%，即14天降解了 554. 7mg,經(jīng)條件優(yōu)化，無機(jī)氮源替換成有機(jī)氮源(酵母粉，1. Og/L)，培養(yǎng)溫度為28°C，初始pH6. 5，降解率達(dá)到了 63%，即多菌靈降解了大約630mg。實(shí)施例2.
木霉Trl抑菌活性檢測
各種病原菌和木霉Trl在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)三天后，用滅菌打孔器取帶菌絲的圓盤型培養(yǎng)基塊，將圓盤型帶有病原菌的培養(yǎng)基塊放距PDA平板中央1. 5cm處，將木霉Trl的培養(yǎng)基菌塊放在距病原菌菌塊3. 0 cm處，28°C下培養(yǎng)3天后記錄抑菌帶的寬度。計算木霉Trl 的抑菌率。實(shí)驗(yàn)中以市場上銷售的木霉制劑LTR-2可濕性粉劑作為對照。上述病原菌為soIani, Phytophthora capsici, Verticillium dahliae YAeb, Phoma uvicola ^qyY,Bipolar is sorokiniana (Sacc. )hoemaker ,Fusarium moniliforme Sheld
結(jié)果見圖2，由圖2可知，木霉Trl和LTR-2均對各種病原菌均有一定程度的抑制作用， Rhizoctonia soIani, Phytophthora capsici, Verticillium dahliae Kleb /L禾中病原菌， LTR—2 白勺才屯菌效果強(qiáng)于 Trl,而對uvicola Berk, Bipolaris sorokiniana (Sacc.) hoemaker, Fusarium monili forme Sheld，木霉Trl的抑菌效果稍強(qiáng)于木霉LTR-2，說明該發(fā)明中分離獲得的木霉菌株Trl不僅能夠降解多菌靈，而且對各種植物病原真菌也具有一定的抑制效果。實(shí)施例3.
多菌靈降解木霉菌對土壤的生物修復(fù)試驗(yàn)
取山東省科學(xué)院生物中心基地土壤，風(fēng)干，過篩，檢測土壤中多菌靈的含量。未發(fā)現(xiàn)篩選得到的土壤中含有多菌靈，分裝，40g/瓶，121°C滅菌2h。按照表2進(jìn)行土壤處理，攪拌均勻后，取Ig檢測多菌靈含量。以后每隔7天取樣進(jìn)行檢測，共檢測4周。其中多菌靈采用 50%可濕性粉劑，每處理重復(fù)三次。采用HPLC檢測土壤中的多菌靈含量，以不加木霉Trl 為對照。
表1土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn)處理^
處理ρTrl^ 滅茴土 &
靈‘·
+ ‘；+十‘；注‘‘ + ”，加入的克數(shù)為5g ；“一”，不加入任何物質(zhì)，最終克數(shù)為50g/瓶。木霉Trl對污染多菌靈的土壤生物修復(fù)試驗(yàn)結(jié)果見圖3。
由圖3可以看到，將木霉Trl與滅菌土壤、多菌靈混勻后，發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，土壤中的多菌靈含量明顯降低，經(jīng)木霉Trl處理后的土壤28天后檢測多菌靈含量在29. 74%， 降解率達(dá)到了 43. 96%。說明本發(fā)明中獲得的木霉Trl在土壤修復(fù)試驗(yàn)中起到了主要的作用。
權(quán)利要求
1.一株具有多菌靈降解作用的生防木霉菌株(rricAoiferaa sp. )Trl，該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No. 5210。
2.如權(quán)利要求1所述的木霉菌株sp.)Trl，其特征在于該菌株是利用含有多菌靈的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，從受多菌靈污染的土壤中分離、篩選、培養(yǎng)獲得的。
3.如權(quán)利要求1所述的木霉菌株577.) Trl，其特征在于篩選、培養(yǎng)該菌株的培養(yǎng)基組成如下無機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/L) =NaCl 1. 0g, K2HPO4 1. 5g，KH2PO4 0. 5g，MgSO4·7Η20 0. 2g，NH4NO3 l.Og，蒸餾水 1 OOOmL，多菌靈(lOOmg/mL) 10ml,固體無機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/L)上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加瓊脂10g， PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml。
4.如權(quán)利要求1所述的木霉菌株aricAoiferaasp. )Trl，其特征在于發(fā)酵生產(chǎn)方法如下采用固體PDA培養(yǎng)基，、\綠鳩、Trichoderma sp. )Trl接種在試管培養(yǎng)基上，27-30°C 下培養(yǎng)48h后，將培養(yǎng)好的木霉菌種轉(zhuǎn)接到液體PDA培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng)72h，將液體培養(yǎng)好的木霉菌株按照l%(v/V)的接種量轉(zhuǎn)接到小麥培養(yǎng)基中，27-30°C擴(kuò)大培養(yǎng)3d，清洗已培養(yǎng)好的木霉菌株，制成7 X IO9個/ml的木霉孢子懸浮菌液；其中，小麥培養(yǎng)基為將小麥用清水浸泡、煮沸所制得的液體小麥培養(yǎng)基。
5.如權(quán)利要求1和4所述的木霉菌株(Trichodermasp. ) Trl發(fā)酵菌液的應(yīng)用，其特征在于其發(fā)酵菌液制得的微生物制劑，可用于防治植物真菌病害，同時對受到多菌靈污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)。
全文摘要
本發(fā)明為一株多菌靈降解木霉菌株及其制備方法。本發(fā)明所提供的生防菌株為木霉(Trichoderma sp.)Tr1，該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No.5210；該菌株是利用含有多菌靈的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，從受多菌靈污染的土壤中分離、篩選、培養(yǎng)獲得的；應(yīng)用該菌株的發(fā)酵菌液制得的微生物制劑，可用于防治植物真菌病害，同時對受到多菌靈污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)。
文檔編號A01N63/04GK102329740SQ201110287929
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月26日
發(fā)明者鄭恩澤 申請人:鄭恩澤